alpha-amylase Saliva Assay

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1 Instruções de Utilização alpha-amylase Saliva Assay Ensaio enzimático para a determinação da actividade da alfa-amilase na saliva humana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. APLICAÇÕES Ensaio enzimático para a determinação da actividade da alfa-amilase na saliva humana. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A medição da actividade da alfa-amilase na saliva é útil na área da psicobiologia do stress. Muitos estudos têm mostrado que a actividade da alfa-amilase da saliva está relacionada com a actividade do sistema medular simpatoadrenal. O cortisol livre na saliva é um marcador não-invasivo estabelecido da actividade do eixo hipotálamo pituitário adrenal (HPA). Agora a alfa-amilase salivar parece representar um marcador da saliva tão bem caracterizado para a actividade do sistema medular simpatoadrenal (SAM). A alfa-amilase salivar também parece estar relacionada com o stress crónico, distúrbio de stress pós-traumático, comportamento, função cognitiva e saúde. Para além disso, os aumentos na alfa-amilase salivar podem ser originados por medicamentos activadores do SNS (como a yohimbina) e impedidos pelos beta-bloqueadores (como o propanolol). O estado actual da investigação mostra que a alfa-amilase salivar poderia ser uma extensão útil dos métodos biopsicológicos. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Este ensaio é um ensaio enzimático de fase líquida. A alfa-amilase salivar metaboliza especificamente o substrato. A intensidade da cor desenvolvida é proporcional à actividade da alfa-amilase na amostra. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente ao usar uma curva padrão. 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN 3 ) como conservante. Em caso de contacto com os olhos ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN 3 pode reagir com o chumbo e o cobre da canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. Version / 6

3 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Saliva O paciente não deve comer, beber, mastigar pastilha elástica ou lavar os dentes nos 30 min anteriores à obtenção da amostra. Caso contrário, deve lavar vigorosamente a boca com água fria 5 min antes da recolha da amostra. Não recolher amostras se houver doenças, inflamação ou lesões orais (contaminação por sangue). A saliva pode ser recolhida com equipamento de recolha apropriado. Deve ser recolhido no mínimo 0.5 ml de líquido. O fluxo de saliva pode ser estimulado mastigando um pedaço de Parafilm. Recomenda-se o congelamento das amostras a 20 C antes dos testes laboratoriais. Após descongelar, mistura e centrifugar 10 min a x g para remover quaisquer partículas. Assegurar que as amostras de saliva estão com bom aspecto. (Cor avermelhada indicando contaminação por sangue) Armazenamento C 2 8 C -20 C (Alíquotas) Estabilidade 1 dia 28 dias 6 meses 7. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 3 x 200 µl CAL LYO 2 x 3 x 200 µl CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 40 ml DILBUF CONC 1 x 21 ml SUBS Microplaca Tiras separáveis. Padrão estoque, liofilizado Contêm: alfa-amilase salivar humana Método de referência para o fotómetro temperado de calibração. Para concentrações exactas consultar etiquetas dos frascos ou o certificado CQ. Controlo 1+2, liofilizado Contêm: alfa-amilase salivar humana Método de referência para o fotómetro temperado de calibração. Para concentrações exactas consultar etiquetas dos frascos ou o certificado CQ. Tampão da Amostra, Concentrado (10x) Contêm: PBS, BSA, estabilizantes. Solução de Substrato Pronto a usar. Contêm: CNPG3, estabilizantes. 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 10; 100; 200; 1000 µl 2. Tubos de ensaio descartáveis para diluição de amostras 3. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 4. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm (comprimento de onda de referência nm) 5. Água bidestilada ou bi-destilada 6. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 7. Vortex 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. Version / 6

4 4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 7. Verifica-se a alfa-amilase no suor e na saliva. Por favor use luvas durante o ensaio e não pipete com a boca. 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Preparação de componentes concentrados Componente Relação Diluente Observações Armazenamento Estabilidade Tampão da Amostra DILBUF CONC 1:10 agua bidest. p.ex. 10 ml Tampão da Amostra + 90 ml agua bidest. Misturar sem fazer espuma. 2-8 C 4 semanas Preparação de Componentes liofilizados Componente com Diluente Observações Armazenamento Estabilidade CAL LYO 200 µl Deixar repousar 15 min. 2-8 C 7 dias CONTROL 1+2 LYO 200 µl amostra diluída Misturar sem fazer espuma. 2-8 C 7 dias Pré-diluição de Padrões O padrão de reserva reconstituído tem de ser diluído a 1:301. Este é o padrão 1. Então, uma diluição em série desta solução permite obter padrões a diferentes concentrações. O exemplo seguinte mostra como obter uma curva padrão com 5 pontos de calibração. Calculação Nome Relação Diluente Observações Padrão 1 1:301 Padrão 2 1:2 Padrão 3 1:2 Padrão 4 1:2 Padrão 5 - amostra diluída amostra diluída amostra diluída amostra diluída 10µL Padrão de reserva reconstituído + 3 ml amostra diluída Misturar bem antes de diluir mais. 100 µl Standard µl amostra diluída Misturar bem antes de diluir mais. 100 µl Standard µl amostra diluída Misturar bem antes de diluir mais. 100 µl Standard µl amostra diluída Misturar bem. U/mL Veja rótulo p. ex.,400 U/mL e.g.: 200 U/mL e.g.: 100 U/mL e.g.: 50 U/mL amostra diluída Apenas solução tampão da amostra diluída 0 U/mL Pré-diluição de Controlos e Amostras As amostras têm de ser pré-diluídas até 1:301, como se segue: Relação Diluente Observações Amostra 1:301 Solução tampão p.ex.: 10 µl Amostra (Saliva) + 3 ml amostra diluída. da amostra diluída Misture bem após a diluição! Controlos 1:301 Solução tampão p.ex.: 10 µl Controlo (reconstituído) + 3 ml amostra diluída. da amostra diluída Misture bem após a diluição! Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas. Version / 6

5 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipete 10 µl de cada Padrão pré-diluído, Controlos pré-diluídos e amostra pré-diluída para os respectivos poços da Placa de Microtitulação. 2. Pipete 200 µl da Solução de Substrato para cada poço. Agitar cuidadosamente a placa. 3. Para a adição das Soluções de Substrato e Stop usar uma pipeta de 8 canais. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar. 4. Incubar 3 min à temperatura ambiente (18-25 C). 5. Medição 1: Medir a densidade óptica (DO) com un fotometro à 405 nm (Comprimento de onda de referência: nm). 6. Durante a incubação, a alfa-amilase presente na amostra irá metabolizar especificamente o substrato. É importante obter uma boa diferenciação entre os padrões. Não obstante, o valor DO do padrão mais elevado obtido para a segunda medição não deverá exceder Siga o desenvolvimento do valor DO em momentos diferentes para evitar sobressaturação. Isto é ainda mais apropriado no caso de temperatura ambiente elevada. Os resultados da actividade da alfa-amilase não serão afectados! 7. Incube mais 5 minutos (tempo de incubação total de 8 minutos) à temperatura ambiente (18-25 C). No caso de temperatura ambiente elevada ou primeira utilização do ensaio, recomendase a medição da placa durante 3 minutos adicionais (tempo de incubação total de 6 minutos). 8. Medição 2: Medir a densidade óptica (DO) com un fotometro à 405 nm (Comprimento de onda de referência: nm). 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste for executado de acordo com as instruções. Adicionalmente o utilizador deve cumprir rigorosamente as Boas Práticas de Laboratório ou outras leis ouregulamentos. Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Calcule o valor DO delta para cada padrão, controlo e amostra ao deduzir a DO da Medição 1 ao DO da Medição 2. O valor DO delta obtido dos padrões (eixo y, linear) é representado graficamente contra a sua concentração (eixo x, logarítmico) quer num papel de gráfico semi-logarítmico, quer usando um método automatizado. É proporcionada uma boa adaptação com um ajustador cúbico, Logística de 4 Parâmetros ou Logit-Log. Para o cálculo da curva padrão, aplique cada valor DO delta dos padrões (um valor isolado óbvio das réplicas poderá ser omitido e o valor simples mais plausível poderá ser usado). A actividade da alfa-amilase das amostras e dos controlos pode ser lida directamente a partir da curva padrão. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm de ser multiplicadas pelo factor de diluição. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Poderá contactar a IBL para obter assistência no cálculo dos resultados. Os resultados são expressos em U/mL. Para converter para o Sistema Internacional (SI) de Unidades, queira multiplicar pelo factor Os resultados serão então expressos em nkat/l. Version / 6

6 14. DESEMPENHO Precisão Recuperação Média Actividade SD Intra-Ensaio Inter-Ensaio Amostra Medidos Actividade Recuperação Diluição Saliva (%) 1: : : : : : Linearidade 1: : : : : : : : : Actividade endógena Adicionado Actividade Medidos Actividade Recuperação (%) Saliva (25.5) Comparação do método Saliva 2 (38.9) Saliva 3 (107.1) CV (%) IBL = x Ensaio enzimático comercialmente disponível N r = n = 24 Version / 6

7 15. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. DIN EN ISO 18153:2003, In vitro diagnostic medical devices Measurement of quantities in biological samples Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzyme assigned to calibrators and control materials. 2. Emily S. Winn-Deen, Harold David, Gerald Sigler, Rodrigo Chavez; Development of a Direct Assay for alpha-amylase ; Clin. Chem. 34/10, (1988) 3. Jean-Pierre Bretaudiere, Robert Rej, Patricia Drake, Anne Vassault, Michel Bailly Suitability of Control Materials for Determination of alpha-amylase activity ; Clin. Chem. 27/6, (1981) 4. G. Gubern, F. Canalias, FJ Gella; Determination of alpha-amylase activity: method comparison and commutability study of several control material ; Clin. Chem. 41, (1995) 5. Urs M. Nater, Nicolas Rohleder, Wolff Schlotz, Ulrike Ehlert, Clemens Kirschbaum; Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase ; Psychoneuroendocrinology 32, (2007) 6. Daniela Schoofs, Diana Preuß, Oliver T. Wolf; Psychosocial stress induces working memory impairments in an n-back paradigm ; Psychoneuroendocrinology 33, , (2008) 7. Tom Smeet, Henry Otgaar, Ingrid Candel, Oliver T. Wolf; True or false? Memory is differentially affected by stress-induced cortisol elevations and sympathetic activity at consolidation and retrieval ; Psychoneuroendocrinology 33, (2008) 8. Katrin Starcke, Oliver Wolf; Anticipatory Stress Influences Decision Making Under explicit Risk Conditions ; Behavioral Neuroscience, 122/ 6, (2008) 9. Noriyasu Takai, Masaki Yamaguchi, Toshiaki Aragaki, Kenji Eto, Kenji Uchihashi and Yasuo Nishikawa; Gender-Specific Differences in Salivary Biomarker Responses to Acute Psychological Stress ; New York Academy of Sciences 1098: (2007) 10. Anda van Stegeren, Nicolas Rohleder, Walter Everaerda and Oliver T. Wolf; Salivary alpha amylase as marker for adrenergic activity during stress: Effect of betablockade ; Psychoneuroendocrinology 31, (2006) 11. Ulrike Ehlert, Katja Erni, Gundula Hebisch, and Urs Nater; Salivary α-amylase Levels after Yohimbine Challenge in Healthy Men ;The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(12): (2006) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /

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