Mycobacterium tuberculosis IgG ELISA
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- Branca Flor Leonor Cabral Damásio
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1 Instruções de Utilização Mycobacterium tuberculosis IgG ELISA Imunoensaio enzimático para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos IgG contra a Mycobacterium tuberculosis em soro e plasma humanos. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. APLICAÇÕES Imunoensaio enzimático para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos IgG contra a Mycobacterium tuberculosis em soro e plasma humanos. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO As micobacterioses (tuberculose, hanseníase, micobacterioses atípicas, paratuberculosis e, talvez, a doença de Crohn) são as doenças infecciosas de homens e animais com a maior difusão na terra. Os agentes infecciosos de tuberculose são ácido-resistentes bactérias cilíndricas da família das Mycobacteriaceae, do género Mycobacterium. Este germe foi detectado por Robert Koch em Devido à capacidade infecciosa muito elevada infecciosa das micobactérias patogénicas, o diagnóstico precoce é essencial para evitar a propagação da doença. É necessária a convergência das diversas abordagens para controlar as micobacterioses, as reacções imunológicas e a propagação bacteriana, variável durante as doenças. No entanto, os procedimentos usuais de diagnóstico foram até agora insuficientes e não permitem distinguir entre diferentes espécies de micobactérias. A doença normalmente é transferida por gotículas de saliva de pessoas infectadas. O alvo da infecção são principalmente os pulmões, mas também podem ser atingidos outros órgãos como o cérebro, o intestino, os ossos, os nódulos linfáticos e os rins. A tuberculose não é encontrada apenas nos países em desenvolvimento, com 8 milhões de novas infecções por ano, mas também em civilizações industrializadas, como uma doença real, com alguns milhares de casos por ano. Sem tratamento, a doença leva, em 50 % dos casos, à morte em menos de dois anos. Os sintomas clínicos são fadiga, perda de peso, falta de apetite, febre leve, suor nocturno e dores no peito. Os doentes com HIV estão ameaçados pela tuberculose, devido ao seu sistema imunológico comprometido. A vacinação com bactérias vivas atenuadas é possível (BCG = Bacilo de Calmette-Guérin). Isto é feito principalmente em recém-nascidos ou crianças muito jovens. Com pacientes mais velhos, antes da vacinação, é normalmente realizado o teste de tuberculina (Pirquet ou Mantoux), onde uma pequena quantidade de tuberculina é injectada sob a pele. Em caso positivo, existem anticorpos contra as micobactérias, e não é necessária vacinação. Até há pouco tempo, não existiram quaisquer métodos sorológicos para detecção de anticorpos da tuberculose no soro. O único procedimento disponível era, além do teste tuberculínico cutâneo, a identificação microscópica directa de bactérias na expectoração. Entretanto, foram preparados antígenos específicos tanto pela purificação de material natural ou por métodos recombinantes. Este kit de teste de ELISA para a determinação de anticorpos IgG usa uma mistura de proteínas de elevada pureza, a fim de determinar uma resposta imunológica contra as bactérias em soro humano. A infecção recente ou cronicamente activa pode ser diagnosticada por exames de IgM e IgA, que também estão disponíveis. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente utilizando uma curva de calibração. 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. V2012_11 1 / 6
3 9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN 3 ) como conservante. Em caso de contacto com os olhos ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN 3 pode reagir com o chumbo e o cobre da canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos. 10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 C. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 C. 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro, Plasma (EDTA, Heparina) Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Armazenamento: 2-8 C -20 C Estabilidade: 2 dias > 2 dias 7. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ IgG 1 x 4 x 2 ml CAL A-D 1 x 60 ml DILBUF Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Microplaca Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos. Conjugado Enzimático IgG Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgG, conjugado com peroxidase, tampão contendo proteína, estabilizantes. Padrão A-D 1; 10; 40; 150 U/mL. Pronto a usar. Padrão A = Controlo Negativo Padrão B = Controlo Cut-off Padrão C = Controlo positivo fraco. Padrão D = Controlo Positivo Contêm: IgG anticorpos contra Mycobacterium tuberculosis, PBS, estabilizantes. Tampão de Diluição Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN 3. 1 x 60 ml WASHBUF CONC Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Contêm: PBS Tampão, Tween x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 2 x FOIL 1 x BAG Solução de Substrato TMB Pronto a usar. Contêm: TMB. Solução de Paragem TMB Pronto a usar. 0.5 M H 2SO 4. Película Aderente Para tapar a Microplaca durante a incubação. Saco Plástico Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas. V2012_11 2 / 6
4 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µl 2. Proveta 3. Tubos (1 ml) para diluição de amostras 4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência nm) 7. Água bidestilada ou desionizada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 C). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Preparação de Componentes Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações). Diluir / dissolver 20 ml Componente Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade WASHBUF CONC 200 ml agua bidest. 1:11 Aquecer até 37 C para dissolver cristais. Misturar energicamente. 2-8 C 8 sem Diluição de Amostras Amostra diluir com Relação Observações Soro / Plasma geralmente DILBUF 1:101 p.ex. 5 µl µl DILBUF Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas. V2012_11 3 / 6
5 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipetar 100 µl de cada Padrão e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. No teste qualitativo apenas é utilizado o Padrão B. 2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a C. 3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µl de Solução de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 4. Pipetar 100 µl de Conjugado Enzimático para cada poço. 5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a C. 6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µl de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar. 8. Pipetar 100 µl de Solução de Substrato TMB para cada poço. 9. Incubar 20 min a C no escuro (sem película aderente). 10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µl de Solução de Paragem TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo. 11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência: nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem. 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS A avaliação do teste pode ser feita quer quantitativamente quer qualitativamente Avaliação Qualitativa O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a partir das densidades ópticas médias da amostra e do Valor do Cut-off. Se a densidade óptica da amostra estiver num intervalo de 20 % á volta do Valor de Cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas. O Índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da seguinte forma: COI = DO Amostra DO Padrão B Avaliação Quantitativa Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Ao utilizar um programa de computador, são recomendados os métodos "Cubic-Spline" ou "Ponto a Ponto", uma vez que fornecem a máxima precisão na avaliação dos dados de medição comparando com outros modelos de avaliação. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. V2012_11 4 / 6
6 Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!) Padrão U/mL DO Média A B C D INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS Método Intervalo Interpretação < 8 U/mL negativo 8 12 U/mL indeterminado > 12 U/mL positivo < 0.8 negativo indeterminado Quantitativa (Curva Padrão) Qualitativa (Índice de Cut-off, COI) > 1.2 positivo (OD) Mycobacterium tuberculosis IgG ELISA (U/mL) Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. 15. DESEMPENHO Mycobacterium ELISA IgG IgA IgM Precisão Intra-Ensaio 7.6 % 7.9 % 7.9 % Precisão Inter-Ensaio 9.4 % 7.4 % 7.4 % Precisão Inter-Lote % % % Sensibilidade Analítica 1.09 U/mL 1.34 U/mL 1.22 U/mL Recuperação % % % Linearidade % % % Reactividade Cruzada Interferências No reactividade cruzada a Helicobacter pylori y Bordetella pertussis. No interferências da bilirubina até 0.3 mg/ml, hemoglobina até 8.0 mg/ml e triglicerídeos até 5.0 mg/ml. Especificidade Clínica 99 % 99 % 100 % Sensibilidade Clínica 100 % 100 % 100 % V2012_11 5 / 6
7 16. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Abebe F, Holm-Hansen C, Wiker HG, Bjune G, Progress in Serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis Infection, Scand J Immunol 66: (2007) 2. Barnes PF, Lee HQ, Davidson PT, Tuberculosis in patients with HIV infection, Medical clinics of North America 77(6): (1993) 3. Bloom BR, Murray CJL, Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer, Science 257: (1992) 4. Karamat KA, Rafi S, Abbasi SA, Drug Resistance in Mycobacterium Tuberculosis: A Four Years Experience, JPMA: (1999) 5. Kochi A, Global tuberculosis situation and the control strategy of the WHO, Tubercle 72: 1-6 (1991) 6. Marks LG, Genetics of tuberculosis, Medical clinics of North America 77(6): (1993) 7. Mustafa AS, Shaban FA, Abal AT, Al-Attiyah R, Wiker HG, Lundin KEA, Oftung F, Huygen K, Identification and HLA Restriction of Naturally Derived Th1-Cell Epitopes from the Secreted Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Recognized by Antigen-Specific Human CD4 +T-Cell Lines, Infect Immun 68(7): (2000) 8. Raja A, Uma Devi KR, Ramalingam B, Brennan PJ, Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis, Clin Diagn Lab Immunol 9(2): (2002) 9. Raja A, Uma Devi KR, Ramalingam B, Improved diagnosis of pulmonary tuberculosis by detection of antibodies against multiple Mycobacterium tuberculosis antigens, Diagn Microbiol Infect Dis 60(4): (2008) 10. Silva VMC, Sardella IG, Luiz RR, Cunha AJLA, Cavalcanti AH, Mahavir S, Barreto MM, Rodrigues RS, Carvalho TF, Saad MHF, Immunoreactivity of five antigens of Mycobacterium tuberculosis in patients attending a public health care facility in an area with high endemicity for TB, Microbiol Immunol 52: (2008) 11. Snider DE Jr, La Montagne JR, The neglected global tuberculosis problem: a report of the 1992 World Congress on tuberculosis, J Infect Dis 169: (1994) 12. Toman K. Tuberculosis case-finding and chemotherapy. Questions and answers. Geneva, World Health Organization, 3-74 (1979) 13. Tuberculosis control as an integral part of primary health care. Geneva, World Health Organization (1988) 14. Uma Devi KR, Ramalingam B, Brennan PJ, Narayanan PR, Raja A, Specific and early detection of IgG, IgA and IgM antibodies to Mycobacterium tuberculosis 38 kda antigen in pulmonary tuberculosis, Tuberculosis 81(3): (2001) V2012_11 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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