Ostase IRMA. Immunoradiometric assay for the in-vitro determination of Bone Alkaline Phosphatase (BAP) in human serum. 12 x 8

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1 Instructions for Use Ostase IRMA Immunoradiometric assay for the invitro determination of Bone Alkaline Phosphatase (BAP) in human serum. 12 x 8 For illustrative purposes only. To perform the assay the instructions for use provided with the kit have to be used. Distributed by: I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 Instruções de Uso OSTASE IRMA KIT PORTUGUÊS ENSAIO IMUNORADIOMÉTRICO PARA A DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA IN VITRO DA FOSFATASE ALCALINA ÓSSEA (BONE ALKALINE PHOSPHATASE BAP) NO SORO HUMANO 1. PRINCIPíO DO MÉTODO O ensaio imunoradiométrico da fosfatase alcalina óssea (bone alkaline phosphatase BAP) é um ensaio de tipo sandwich. O equipamento utiliza anticorpos monoclonais de rato dirigidos contra diferentes epítopos da BAP As amostras, controlos e calibradores são incubados em tubos revestidos com o primeiro anticorpo monoclonal em presença do segundo anticorpo monoclonal o qual está marcado com 125 I. Depois da incubação, aspirase o líquido contido nos tubos e estes lavamse para retirar o anticorpo não ligado e marcado. A actividade de 125 I ligado é depois medida num contador gama. A concentração de BAP nas amostras é directamente proporcional à radioactividade e obtémse por interpolação a partir da curva padrão. 2. REAGENTES Todos os reagentes são estáveis até ao fim do prazo de validade do equipamento, desde que conservados entre 2 e 8 C. As condições de armazenamento dos reagentes depois da diluição são indicadas na secção de Procedimento da Análise. 2.1 Tubos revestidos de anticorpo monoclonal antibap: 2 x 50 tubos (prontos a usar). 2.2 Anticorpo monoclonal antibap, marcado 125 I: 1 frasco (11 ml); prontos a usar O frasco contém 650 kbq (na data de fabrico) de imunoglobulina marcada com I 125 num tampão com proteínas bovinas e equina, azida sódica (<0,1%, ver secção Precauções) e corante. Nota: A presença ocasional de partículas coaguladas no marcador nao afecta o desempenho do ensaio. 2.3 Calibradores: 5 frascos (a 1 ml) e 1 frasco do calibrador zero (6 ml); prontos a usar Os frascos contêm BAP num tampão com albumina de soro bovino e azida sódica (<0,1%, ver a secção Precauções), o limite da concentração é 0120 μg/l. Os valores exactos das concentrações encontramse nas etiquetas dos frascos. Os valores dos calibradores foram ajustados segundo um padrão interno de referência. 2.4 Amostra de controlo: 2 frascos; prontos a usar Os frascos contêm BAP num tampão com albumina sérica bovina e azida sódica (<0,1%, ver a secção Precauções). Os valores esperados situamse no intervalo de concentração indicado no anexo das instruções. 2.5 Solução de lavagem (20 x); 1 frasco de 50 ml. A solução concentrada deve diluirse antes de utilizar. Nota: O prazo de validade e a temperatura impressa nas etiquetas dos reagentes são válidas, apenas para o fabricante, durante o seu armazenamento a longo prazo até antes de serem associados como parte do kit. Não tomar em consideração. 3. MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO ALÉM do equipamento normal de laboratório, é necessário o seguinte: Micropipetas de precisão (100 μl). Micropipeta de repetição (100 μl, 2 ml). Agitador tipo Vórtex. Unidade de refrigeração mantida entre 2 e 8 C. Sistema de aspiração. Contador gama calibrado para I 125. ; 4. PRECAUÇÕES E MEDIDAS DE SEGURANÇA 4.1 Gerais: Permitir que os reagentes alcancem a temperatura ambiente antes da sua utilização. Não misturar os reagentes de lotes diferentes. Incluir uma curva padrão em cada ensaio. O número de amostras a analisar está limitado ao tempo máximo de 20 minutos para pipetar as amostras Recomendase realizar o ensaio em duplicado. Cada tubo só deve ser usado uma vez. 4.2 Segurança radiológica A compra, posse, uso e transferência de material radioactivo estão sujeitas às disposições legais do país em que se utiliza. O cumprimento das normas básicas de segurança radiológica proporciona uma protecção adequada. Não se deve comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos em presença de materiais radioactivos. Não pipetar as soluções radioactivas com a boca. Evitar qualquer contacto com materiais radioactivos mediante o uso de luvas e bata de laboratório. Toda a manipulação de material radioactivo deve realizarse em lugar adequado, longe de corredores e espaços ocupados. Os materiais radioactivos devem armazenarse num contentor aprovado numa zona especializada. Devese levar e conservar actualizado um registo das entradas e armazenamento de todos os produtos radioactivos. O equipamento e o material de vidro de laboratório que são objecto de contaminação devemse separar para evitar a contaminação com outros radioisótopos. Cada caso de contaminação radioactiva, ou de perda de materiais radioactivos devese resolver de acordo com os procedimentos estabelecidos. O resíduo radioactivo deve manipularse de acordo com as regras estabelecidas pelo país onde se utiliza. 4.3 Azida sódica Alguns reagentes contêm azida sódica como conservante. A azida sódica pode Alguns reagentes têm azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir com o chumbo, o cobre e o bronze das canalizações, para formar azidas metálicas explosivas. Elimine os reagentes, lavando com um fluxo de água abundante, em simultâneo. 4.4 Soro humano Certos reagentes deste equipamento são de origem humana e tiveram resultado negativo nos testes de HIV 1 e de HIV 2, de HCV, bem como de hepatite B (HBs Ag). No entanto, devem manipularse como capazes de transmitir doença. Nenhum teste conhecido pode oferecer segurança completa quanto à ausência de agentes virulentos. Manipule estes reagentes com todas as precauções necessárias. Todas as amostras de sangue devem manipularse como potencialmente capazes de transmitir doenças (ex. hepatite ou SIDA). 5. COLHEITA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DA AMOSTRA Recolher o sangue em tubos sem aditivos. Separar o soro das células mediante centrifugação. As amostras do soro podemse armazenar entre 28 C durante 24 horas. Para um período maior armazenar a <18 C depois de preparar alíquotas para evitar o congelamento e a descongelação repetidos das amostras. As amostras que apresentarem uma concentração superior ao calibrador de maior concentração, devem diluirse com o calibrador zero. 6.1 Preparação dos reagentes Permita que todos os reagentes estabilizem à temperatura ambiente Preparação de a solução de lavagem Verter o conteúdo de um frasco em 950 ml de água destilada e homogeneizar. A solução diluída podese armazenar entre 2 e 8 C até ao fim do prazo de validade do equipamento. 6.2 Resumo do procedimento da análise: (ver tabela mais adiante). 7. RESULTADOS Os resultados obtêmse por interpolação com a curva de calibração. A curva serve para determinar as concentrações de BAP nas amostras medidas ao mesmo tempo que os calibradores. 7.1 Curva de calibração Os resultados apresentados neste folheto foram calculados usando uma curva loglog (regressão quadrática ponderada), onde os valores (cpm kal. cpmkal.0) foram marcados no eixo vertical e a concentração de BAP dos calibradores no eixo horizontal (μg/l). Outros métodos de valoração podem dar resultados ligeiramente diferentes.

3 Actividade total: cpm BAP Calibradores , cpm (n=3) B/T (%) cpmcal cpmcal ,09 1,10 2,27 4,20 8,08 14, (Exemplo de curva padrão, não utilizar para os cálculos) 7.2 Amostras Para cada amostra ou controlo inserir o valor da actividade (cpmvz cpmkal.0) no eixo vertical e determinar a concentração correspondente de BAP no eixo horizontal. A concentração das amostras diluídas deve ser corrigida pelo factor de diluição. A actividade enzimática 100 U/L BAP corresponde aproximadamente a 38,4 µg/l. 8. CONTROLO DE QUALIDADE As boas práticas de laboratório implicam que as amostras controlo sejam utilizadas em cada série de experiências para assegurar a qualidade dos resultados obtidos. As amostras controlo devem ser processadas da mesma forma que as amostras a analisar. Recomendase que os resultados sejam analisados utilizando os métodos estatísticos apropriados. Em caso de detectar deterioração da embalagem do produto ou que os resultados expressam uma alteração nas características do mesmo, contactar com o Distribuidor local ou notificar por immunotechsup@beckmancoulter.com 9. VALORES ESPERADOS Recomendase que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores de referência. Os valores que se mostram a seguir foram obtidos em indivíduos saudáveis e devem considerarse só como orientadores. Realizouse um ensaio clínico multicêntrico para verificar a efectividade da BAP como ajuda no seguimento da osteoporose pósmenopausica e a doença de Paget. Embora os resultados da medição de BAP neste ensaio tenham sido obtidos com o TANDEM R OSTASE, o kit da Immunotech OSTASE IRMA foi desenvolvido, usando os mesmos anticorpos monoclonais utilizados no kit TandemR OSTASE e foi padronizado para proporcionar a mesma interpretação clínica. As determinações de BAP usando outros anticorpos monoclonais ou outros métodos podem dar resultados clínicos diferentes. Sistemas que utilizem outros anticorpos monoclonais ou outros métodos da série podem dar resultados clínicos diferentes. Os resultados do estudo estão na tabela seguinte. n Média DP Mediana Percentil 95 Homens ,3 4,3 11,6 20,1 Mulheres prémenopausa 228 8,7 2,9 8,5 14,3 Mulheres pósmenopausa ,2 4,7 12,5 22,4 10. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMENTO DA ANÁLISE (Para mais detalhes ver a página de APÊNDICES ) 10.1 Sensibilidade Sensibilidade analítica: 2,0 µg/l Sensibilidade funcional: 5,0 µg/l 10.2 Especificidade De intestinos BAP 100 U/L dá o resultado de 2,4 µg/l neste ensaio. De placenta BAP 100 U/L não deu um resultado detectável neste ensaio. De fígado BAP 100 U/L dá o resultado 6,9 µg/l neste ensaio Precisão Intraanálise As amostras foram analisadas 18 vezes numa mesma série. Os coeficientes de variação foram iguais ou abaixo de 8,4% Interanálise As amostras avaliaramse em duplicado em 10 séries diferentes. Os coeficientes de variação foram iguais ou abaixo de 10,9% Precisão Prova de diluição As amostras altamente concentradas foram diluídas em série com o calibrador Zero. As percentagens de recuperação foram entre 88,5 % e 115 % Prova de recuperação As amostras de baixa concentração regularamse por concentrações conhecidas de BAP. As percentagens de recuperação situaramse entre 86,7 %e 106 %. 11. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO Ao não respeitar as instruções de uso pode afectar significativamente os resultados. Os resultados devem ser interpretados no âmbito do quadro clínico total do doente, incluindo a sua história clínica, os dados de provas adicionais e as outras informações apropriadas. Não se recomenda usar em amostras hemolisadas ou lipémicas com o kit de OSTASA. O Efecto Hook deste kit IRMA pode aparecer em amostras que contenham concentrações de BAP iguais ou superiores 1000 µg/l. Em amostras com suspeita clínica de um nível muito alto de BAP recomendase diluir sempre com o calibrador zero. Os resultados devem corrigirse com o factor de diluição. Nos ensaios onde se utilizam anticorpos existe a possibilidade de que se produzirem interferências devido à presença de anticorpos heterófilos na amostra do doente. Os doentes que tenham estado em contacto regularmente com animais ou tenham recebido imunoterapia ou procedimentos diagnósticos com imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas podem produzir anticorpos, p.ex. HAMA, que interferem com os imunoensaios. Estes anticorpos que criam interferências podem causar resultados errados. Avalie cuidadosamente os resultados dos doentes com suspeita de conter esses anticorpos. Passo 1 Pipetagem* Nos tubos revestidos agregar sucessivamente: 100 μl de calibrador, controlo ou amostra e 100 μl de traçador. Misturar manualmente, agitando com cuidado durante 15 segundos. 6.2 PROCEDIMENTO DA ANÁLISE Passo 2 Incubação Introduzir os tubos em banho de água fria colocado no frigorífico. Incubar durante 19 ±1 horas com 28 C sem agitar. A temperatura não deve ultrapassar os 8 C. Passo 3 Lavagem e contagem Adicionar a todos os tubos 2 ml de solução de lavagem e aspirar** (com excepção de 2 tubos de cpm total). Adicionar 2 ml da solução de lavagem e aspirar**. Determinar a actividade (cpm) em todos os tubos durante 1 minuto. *Adicionar 100 µl de traçador a 2 tubos adicionais para obter as cpm totais. **Aspire cada grade de tubos à parte para diminuir a presença da solução de lavagem nos tubos, ao mínimo. Depois da segunda lavagem espere aproximadamente um minuto e volte a aspirar o resto do líquido.

4 Appendix OSTASE IRMA KIT IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR THE IN VITRO DETERMINATION OF BONE ALKALINE PHOSPHATASE (BAP) IN HUMAN SERUM A. Accuracy A.1 Dilution test Serum samples were diluted with zero calibrator and assayed according to the assay procedure of the kit. Sample K L M N Dilution 1/16 1/16 BAP expected measured Recovery measured/expected (%) A.1 Recovery test Serum samples containing known concentrations of BAP were added to three sera and assayed according to the assay procedure of the kit. BAP Recovery (%) Endogenous conc. Added Obtained measured/expected B. Precision B.1 Intraassay Sample A B C D E F No. of determination Mean value (μg/l) CV (%) B.2 Interassay Sample No. of determination Mean value (μg/l) CV (%) C. Interference by drugs Analogous IRMA sandwich system TandemR OSTASE, employing the same monoclonal antibodies, was tested for interference by drugs. The drugs and the highest concentrations tested were: Acetaminophen (350 μg/ml), alendronate (20 μg/ml), aspirin (350 μg/ml), calcitoninhuman (80 μg/ml), calcitoninsalmon (60 IU/mL), calcium (500 μg/ml), estrogen (100 μg/ml), etidronate (350 μg/ml), ibuprofen (150 μg/ml), norethidronel/ethinyl estradiol mixture (oral contraceptive) (3.0 mg/ml), pamidronate (180 μg/ml), vitamin D (400 IU/mL). These drugs did not interfere in the TandemR OSTASE assay. Due to analogous design of the Immunotech OSTASE IRMA assay, no interference is expected as well. T ( 125 I) = 1443 h = d 125I E % (MeV) γ X

5 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθµόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International B.V. Zutphenseweg 55, 7418 AH Deventer, The Netherlands IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBLInternational.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer. Symbols Version 3.5 /