Normetanephrine ELISA
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- Pietra Lancastre Freire
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1 Instruções de Utilização Normetanephrine ELISA Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de normetanefrina em urina humana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. APLICAÇÕES Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de normetanefrina em urina humana. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO As catecolaminas adrenalina, noradrenalina e dopamina são sintetizadas na medula adrenal, no sistema nervoso simpático e no cérebro. Influenciam praticamente todos os tecidos e estão envolvidas, juntamente com outros sistemas hormonais e neuronais, na regulação de uma grande variedade de processos fisiológicos. Como as catecolaminas e os seus metabolitos, metanefrina e normetanefrina, são segregadas em quantidades superiores às normais numa série de doenças, podem ser usados para efeitos de diagnóstico. Neste contexto, o diagnóstico assim como o follow-up de doenças tumorais do sistema nervoso revestemse de especial importância. Isto aplica-se essencialmente ao feocromocitoma, mas também ao neuroblastoma e ao ganglioneuroma. É descrito crescimento maligno em 10% dos feocromocitomas. Além disso, um aumento de catecolaminas e seus metabolitos, metanefrina e normetanefrina, pode ser observado em carcinóides. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O procedimento obedece ao princípio básico de ELISA competitivo, segundo o qual existe competição entre um antigénio biotinilado e outro não-biotinilado por um número fixo de locais de ligação de anticorpos. A quantidade de antigénio biotinilado que liga ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração da amostra. Quando o sistema está em equilíbrio, o antigénio biotinilado livre é removido por um passo de lavagem e o antigénio biotinilado ligado ao anticorpo é determinado usando estreptavidina fosfatasa alcalina como marcador e p-nitrofenil fosfato como substrato. A quantificação de amostras é conseguida comparando a actividade enzimática das amostras com uma curva resposta preparada usando padrões conhecidos. 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 C. Version / 7
3 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS A libertação in-vivo de catecolaminas e metanefrinas é influenciada por diversas comidas e medicamentos. Vitamina B, café e bananas, alfa-metildopa, inibidores MAO e COMT assim como medicações relativas à hipertensão não devem ser ingeridas pelo menos durante as 72 h anteriores à recolha de amostras. Urina É possível usar tanto a primeira urina do dia como urina de 24 h. O volume total de urina excretada durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco contendo como conservante ml de HCl 6 N. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as amostras antes de iniciar o ensaio. Armazenamento: -20 C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Estabilidade: 6 meses Evitar congelar-descongelar repetidamente. 7. MATERIAIS FORNECIDOS Os reagentes fornecidos com este kit são suficientes para 96 determinações simples, ou até 48 duplicações de Metanefrina e Normetanefrina cada. Quantidade Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 8 ml ANTISERUM 1 x 8 ml BIOTIN 1 x 400 µl ENZCONJ CONC 1 x 7 x 0.35 ml 1 x 2 x 0.5 ml CAL A-G CONTROL x 2.25 ml ACYLREAG 2 x 50 x HYDRTUB 1 x 20 ml HCL 1 x 50 ml ASSAYBUF CONC 1 x 11 ml INDICATORBUF 2 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 13 ml PNPP SUBS 1 x 15 ml PNPP STOP Microplaca Tiras separáveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal). Normetanefrina Antisoro Cor azul. Pronto a usar. Contêm: Antisoro (coelho), tampão fosfato, 0.1 % NaN 3. Normetanefrina Biotina, Pronto a usar. Contêm: Normetanefrina Biotina, tampão fosfato, BSA, < 0.1 % NaN 3 Conjugado Enzimático, Concentrado (50x) Contêm: Estreptavidina fosfatasa alcalina, Tampão Tris, 0.01 % NaN 3. Padrão A-G 0; 77; 192; 480; 1200; 3000; 7500 µg/l 0; 0.42; 1.05; 2.63; 6.56; 16.4; 41.0 µmol/l Pronto a usar. Contêm: Normetanefrina, 0.1 M HCl. Controlo 1+2 Pronto a usar. Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos. Reagente de Acilação Pronto a usar. Contêm: dimetilformamida. Tubos de Hidrolização Tubos de ensaio de poliestireno descartáveis (não revestidos). Tubos de Hidrolização adicionais estão disponíveis com a designação REF KEZZ661. HCl Pronto a usar. 0.1 M HCl. 3 x FOIL Película Aderente Tampão de Reacção, Concentrado (10x) Contêm: tampão fosfato, BSA, 1 % NaN 3. Tampão Indicador Roxo. Pronto a usar. Contêm: Tampão Tris, vermelho de fenol (mudança de cor a ph < 7.5). Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Contêm: Tampão Tris, HCl, Tween, 0.2 % NaN 3. Solução de Substrato PNPP Pronto a usar. Contêm: p-nitrofenil fosfato (PNPP). Solução de Paragem PNPP Pronto a usar. Contêm: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. Version / 7
4 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 10; 50; 100; 1000 µl 2. Tubos de ensaio de vidro descartáveis (12 x 75 mm) 3. Agitador orbital ( rpm) (p.ex. EAS 2/4, SLT) 4. Vortex 5. Banho de água, 90 C, 37 C 6. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 7. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 8. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm (comprimento de onda de referência nm) 9. Água bidestilada ou bi-destilada 10. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. Version / 7
5 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Para a versão manual e automatizada Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 experiências separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações). Se o cliente quiser reduzir o número de padrões de 7 para 6 pode omitir o Padrão G. O intervalo será então reduzido para 3000 μg/l. Se se usar um maior número de tiras, os volumes têm que ser alterados de acordo Preparação de componentes liofilizados ou concentrados Não misturar os Conjugados Enzimáticos de Metanefrina e Normetanefrina no caso de se usar o ELISA de Metanefrina em paralelo. Diluir / Componente Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade dissolver 15 ml ASSAYBUF CONC juntar agua bidest. 1: C 2 semanas 50 ml WASHBUF CONC 120 µl ENZCONJ CONC 150 ml juntar 500 ml com 6 ml agua bidest. 1: C 4 semanas Tampão de Reacção diluído 1:51 Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez C Hidrolização de Amostras de Urina, Padrões e Controlos para Normetanefrina total (em Tubos de Hidrolização) 5 horas O passo de hidrolização é necessário para a determinação de normetanefrina total e metanefrina total. Não é necessária hidrolização quando a testar normetanefrina e metanefrina livre. As amostras que se suspeite conterem concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas com HCl 0.1 M antes do passo de hidrolização Preparação de amostras completa em tubos de hidrolização 1. Pipetar 10 µl de cada Padrão, Controlo e amostra de urina para os tubos de hidrolização apropriadamente rotulados. 2. Pipetar 40 µl de HCl 0.1 M para cada tubo. 3. Fechar as tampas dos tubos. Hidrolizar 1 h a 90 C (verificar a temperatura com o termómetro). Em seguida, deixar arrefecer até à temperatura ambiente. Agitar no vortex. 4. Pipetar 100 µl de Indicador para cada tubo. Agitar no vortex. 5. Pipetar 20 µl de Reagente de Acilação para cada tubo. Agitar cada tubo no vortex imediatamente após pipetagem. Tomar atenção para que o reagente de acilação seja completamente adicionado ao conteúdo dos tubos. 6. Fechar as tampas dos tubos. Incubar 15 min a TA (18-25 C). 7. Pipetar 1 ml de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex. Version / 7
6 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO Em microplaca, para versão manual ou automatizada 1. Pipetar 50 µl de cada Padrão acilado, Controlo acilado e amostra de paciente acilada para os respectivos poços da microplaca. 2. Pipetar 50 µl de Normetanefrina-Biotina para cada poço. 3. Pipetar 50 µl de Antisoro para Normetanefrina para cada poço. Agitar cuidadosamente a placa. 4. Tapar a placa com película adesiva. Agitar cuidadosamente a placa. Incubar 1 h à TA (18-25 C) num agitador orbital (500 rpm). 5. Retire a folha. Rejeitar a solução d incubação. Lavar a placa 6 x com 250 µl de Tampão de Lavagem diluído (3 x manualmente). Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 6. Pipetar 150 µl de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço. 7. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min à TA (18-25 C) num agitador orbital (500 rpm). 8. Retire a folha. Rejeitar a solução d incubação. Lavar a placa 6 x com 250 µl de Tampão de Lavagem diluído (3 x manualmente). Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 9. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar. 10. Pipetar 100 µl de Solução de Substrato PNPP para cada poço. 11. Incubar 20 min à TA (18-25 C) num agitador orbital (500 rpm). 12. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µl de Solução Stop PNPP a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. 13. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (Comprimento de onda de referência: nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop. 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem. Observações para participantes em Esquemas de Avaliação de Controlo de Qualidade A IBL submete regularmente o imunoensaio de metanefrina a Esquemas de Avaliação de Controlo de Qualidade. De acordo com os organizadores dos Esquemas de Controlo de Qualidade, eles usam normetanefrina em mistura racémica (+/-) como reforço para recuperação das suas amostras e não a forma biologicamente activa da normetanefrina. Consequentemente, ao medir amostras recuperadas na gama de concentrações elevadas, encontra-se cerca de 30-40% de resultados mais baixos com o imunoensaio de normetanefrina comparado com HPLC. Quando os organizadores usam amostras nativas de pacientes com concentrações de normetanefrina elevadas, este problema não ocorre. A razão para isto é que o anticorpo usado no kit reconhece a forma biologicamente activa da normetanefrina. Por isso, é aconselhado verificar a preparação de amostras usada no Esquema de Controlo de Qualidade quando a interpretar os resultados obtidos. Version / 7
7 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. No caso de amostras diluídas os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Calcular a quantidade excretada em 24 h para cada amostra de urina: µg/24 h = µg/l x L/24 h Conversão: 1 ng/ml = 1 µg/l Normetanefrina (µg/l) x 5.46 x 10-3 = µmol/l Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!) Padrão Normetanefrina (µg/l) DO Média DO/DO max (%) A B C D E F G OD 405 nm 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0, Normetanephrine (µg/l) 14. VALORES ESPERADOS Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: Média: 230 µg/dias Intervalo: µg/dias (95 % percentil) Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade. 15. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes. Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO. Version / 7
8 16. DESEMPENHO Especificidade Analítica (Reactividade Cruzada) Substância Reactividade Cruzada (%) Metanefrina 0.02 Noradrenalina 0.12 Ácido Cafeico 0.00 Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção) Precisão Intervalo (µg/l) CV (%) Intra-Ensaio Inter-Ensaio Linearidade Recuperação Comparação Método Usado versus GCMS Comparação do método manual versus versão automática 18 µg/l Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD Reactividade cruzada de outras substâncias testadas < 0.05 % Intervalo (µg/l) Diluição em Série até Intervalo (%) : Média (%) Intervalo (%) % Recuperação após adição de reforço GCMS = 1.14 x Teste IBL r = 0.94; n = 47 Manual version = Triturus r = 0.99; n = REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004) 2. Wassell J et al. Freedom from drug interference in new immunoassays for urinary catecholamines and metanephrines. Clin Chem 45: (1999) Address: Wassell Julie, Wythenshawe hospital, Manchester, UK. 3. Wolthers BG, Kema IP, Volmer M, Wesemann R, Westermann J and Manz B. Evaluation of urinary metanephrine and normetanephrine enzyme immunoassay (ELISA) kits by comparison with isotope dilution mass spectrometry. Clin. Chem., 43: (1997). Address: Bert G. Wolthers, Central Laboratory for Clinical Chemistry, University Hospital, P.O. Box , 9700 RB Groningen, The Netherlands Version / 7
9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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