Haemophilus influenzae B IgG ELISA

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1 Instruções de Utilização Haemophilus influenzae B IgG ELISA O Imunoensaio Enzimático é para a determinação dos anticorpos IgG contra o poliribosilribitolfosfato do Haemophilus influenzae de tipo B no soro humano e plasma humano. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. APLICAÇÕES O Imunoensaio Enzimático é para a determinação dos anticorpos IgG contra o poliribosilribitolfosfato (PRP) do Haemophilus influenzae de tipo B no soro humano e plasma humano. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A Haemophilus influenzae de tipo B (HiB) é uma causa muito comum de doenças infecciosas, graves e invasivas em crianças até aos seis anos de idade. Após a infecção, os sintomas da doença incluem: Pericardite, osteomielite, meningite, encefalite, pneumonia, sinusite e otite. Em muitos casos, a doença é letal ou leva a lesões neurológicas, que não podem sempre ser prevenidas por uma terapêutica rápida com antibióticos. A razão subjacente para a doença é muito frequentemente uma imunodeficiência latente com uma resposta imunitária humoral especificamente reduzida ao polirribosilribitolfosfato (PRP) no polissacarídeo capsular da bactéria. Nas crianças, outra razão é a imaturidade do sistema imunitário. Actualmente usa-se frequentemente o termo "doentes imunocomprometidos", incluindo todas as imunodeficiências especificadas e não especificadas, inatas e adquiridas. Em consequência, recomenda-se a vacinação com diferentes tipos de vacinas que contenham PRP em crianças com três meses ou mais de idade. Isto pode levar a uma redução clara no número de infecções por Haemophilus influenzae de tipo B. A concentração de anticorpos produzidos pela vacinação pode ser usada para confirmar se a vacinação foi bem-sucedida. O HiB IgG é usado para medir o nível de anticorpos IgG específicos para PRP depois de um período de 4-6 semanas após uma imunização completa para monitorizar o estado imunitário humoral de crianças ou outros indivíduos em risco.monitorização do estado imunitário humoral depois da vacinação. Verificação do diagnóstico de infecção por Haemophilus influenza tipo B através da monitorização repetida de concentrações de anticorpos. Avaliação do risco em doentes imunocomprometidos que leva a fracasso da vacinação com uma vacina contendo PRP. Este grupo inclui: Crianças com menos de 2 anos que tiveram uma infecção com Haemophilus influenzae de tipo B, Crianças com infecções bacterianas crónicas e recorrentes do tracto respiratório, Crianças com otite crónica, Doentes com imunodeficiência humoral confirmada (deficiência em IgG-2, deficiência em IgA), Doentes com deficiências confirmadas de granulócitos, Doentes submetidos a quimioterapia ou terapia citostática, Crianças após esplenectomia, Doentes com anemia falciforme, Doentes com Trissomia 21 (síndrome de Down) e certos grupos étnicos. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O HiB IgG é um teste ELISA de duas fases. Os poços nas tiras do teste ELISA estão revestidos com PRP. Durante a incubação de amostras de plasma ou soro diluído, os anticorpos específicos ligam-se à fase sólida (incubação de amostras). Após um procedimento de lavagem, todos os componentes não ligados e não específicos são eliminados pela água. Durante a segunda fase de incubação, uma reacção do conjugado, um anticorpo IgG anti-humano conjugado à peroxidase (HRP IgG anti-humano), marca a IgG anteriormente e especificamente ligada. Num segundo procedimento de lavagem, o conjugado não ligado é removido. Numa terceira fase de incubação, ocorre a reacção do substrato. A peroxidase do conjugado ligado oxida a tetrametilbenzidina (TMB) transformando-a numa substância azul. Esta reacção é interrompida ao adicionar ácido sulfúrico e a cor muda para amarelo. A intensidade da cor é directamente proporcional à concentração dos anticorpos específicos para PRP. A absorbância é medida com um leitor ELISA a 450 nm. A concentração de anticorpos na amostra pode ser determinada usando uma curva de referência. Version (01) 1 / 6

3 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. 10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. As tiras da microplaca são estáveis até 6 meses depois de separadas, no saco hermeticamente fechado quando armazenados de 2 a 8ºC. 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro humano, Citrate-, EDTA- ou Heparina-Plasma. Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Armazenamento: 2-8 C -20 C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Estabilidade: 6 semanas 6 meses Evitar congelar-descongelar repetidamente. Version (01) 2 / 6

4 7. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 0.3 ml ENZCONJ CONC 5 x 0.35 ml CAL x 0.35 ml POS LL, POS HL 2 x 75 ml DILBUF 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS Microplaca Revestido com PRP do virus do Haemophilus influenza tipo B; Pronto a usar. Conjugado Enzimático, Concentrado Anti-humano-IgG-peroxidase; colorido azul. Diluir antes de usar! Padrão 1-5, Concentrado (NISBC code 09/222) Soros humanos con estabilizantes e conservantes. As concentrações são específicas dos lotes, como se indica nos rótulos dos frascos. Diluir antes de usar! Controlo LL+HL, Concentrado Controlo positivo soros, LL, Low Level, HL, High Level ; soros humanos con estabilizantes e conservantes. As concentrações são específicas dos lotes, como se indica nos rótulos dos frascos. Diluir antes de usar! Diluição Tampão 0.01 M Tris/HCl; ph 7.4; Contêm: detergente; 0.01% (w/v) Timerosal; colorido vermelho. Pronto a usar. Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Contêm: tampão fosfato Solução de Substrato TMB Solução de Substrato Contêm: TMB (tetrametilbenzidina). Pronto a usar. 1 x 15 ml TMB STOP Solução de Paragem TMB Solução de Paragem, 0.5 M ácido sulfúrico. Pronto a usar. 2 pieces FOIL Película Aderente Nota: Tampão de Lavagem, Substrato e a solução de paragem pode ser trocada pelos seguintes produtos: TBEV / FSME IgG (RE57401), TBEV / FSME IgM (RE57411), Tétano (RE57441) e Difteria (RE57431). 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 20; 100; 500; 1000 µl 2. Vortex 3. Tubos para diluição de amostras 4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro Version (01) 3 / 6

5 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Preparação de Componentes Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações). Diluir / dissolver Componente com Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade 60 µl ENZCONJ CONC 6 ml DILBUF 1: ml WASHBUF CONC 270 ml Aqua dest. 1: Diluição de Padrõe, Controlos e Amostras CAL 1-5 CONTROL LL CONTROL HL Misturar cuidadosamente. Misturar cuidadosamente. 2-8 C 2-8 C diluir com Relação Observações 1 hora 8 semanas geralmente DILBUF 1:26 p.ex. 20 µl µl Soro / Plasma geralmente DILBUF 1:26 p.ex. 20 µl µl Para a determinação pela curva padrão serão necessários calibradores 1-5 e soros de controlo. Version (01) 4 / 6

6 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipetar 100 µl de cada Calibrador diluído, Controlo diluído e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. 2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min à TA (18-25 C). 3. Remover a película adesiva. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 250 μl de Tampão de Lavagem diluído. Remover o excesso de solução batendo com a placa invertida numa toalha de papel. 4. Pipetar 100 μl de Conjugado Enzimático diluído para cada poço. 5. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min à TA (18-25 C). 6. Remover a película adesiva. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 250 μl de Tampão de Lavagem diluído. Remover o excesso de solução batendo com a placa invertida numa toalha de papel. 7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de deslocamento positivo e evitar a formação de bolhas de ar. 8. Pipetar 100 μl de Solução de Substrato TMB para cada poço. 9. Incubar 30 min à TA (18-25 C). 10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 μl de Solução de Paragem TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. 11. Medir densidade óptica com um fotómetro a nm (comprimento de onda de referência: nm) nos 10 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem. 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado Eixo dos xx (log): concentração [µg/ml] Eixo dos yy (lin): Absorbância (densidade óptica) Uma boa curva é fornecida optando por por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Equação 1: Y = d+(a-d)/(1+(x/c) b ) Para o cálculo da curva de calibração deve usar todos os sinais dos padrões (pode ser omitido um outlier óbvio e pode ser usado o valor único mais plausível). A concentração da amostra pode ser lida a partir da curva de calibração. Quando houver suspeita de que as amostras contêm concentrações mais elevadas do que o padrão mais elevado, elas têm de ser diluídas com uma solução tampão de diluição. As concentrações assim obtidas têm de ser multiplicadas pelo factor 2. As concentrações obtidas do citrate plasma têm de ser multiplicadas pelo factor 1.1. Critérios de validação Ver Certificado de Controlo de Qualidade. Version (01) 5 / 6

7 14. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS A determinação de anticorpos específicos para PRP mostra o nível da reacção imunitária humoral após uma imunização com uma vacina que contenha PRP ou uma infecção clinicamente aparente ou não aparente por Haemophilus influenzae de tipo B. Quando este teste é negativo e o doente pertence a um grupo de risco (conf. "Indicações"), pode presumir-se que existe um risco de infecção por Haemophilus influenzae de tipo B. As reacções imunitárias humorais após uma infecção não tipificável por Haemophilus influenzae não são detectadas pelo HiB IgG. A incapacidade em seroconverter após a vacinação é indicadora da capacidade de reagir a antígenos bacterianos dos hidratos de carbono. Uma imunodeficiência específica para polissacarídeos pode ser observada em doentes com bronquite crónica, pneumonia recorrente, asma brônquica intrínseca ou bronquiectasias de génese indefinida. Tem sido demonstrado nas publicações [2, 8, 9, 10, 11] que uma concentração de anticorpos inferior a 0.15 µg/ml dá uma protecção insuficiente contra a Haemophilus influenzae de tipo B. As concentrações de anticorpos entre 0.15 e 1.0 µg/ml indicam que o doente foi imunizado com PRP ou teve uma infecção por HiB. Mas apenas as concentrações de anticorpos superiores a 1.0 µg/ml representam uma imunidade natural suficiente ou uma protecção adquirida após a terceira vacinação. 15. DESEMPENHO Variação intra-ensaios: 2 amostras no intervalo de concentração dos calibradores medidas 20 vezes cada com um lote em determinação dupla. A variação intra-ensaios foi de 10%. Variação inter-ensaios: Os controlos de alto e baixo nível POS foram medidos em 20 repetições em dias diferentes com um lote em determinação dupla. A precisão inter-ensaios foi entre 9 e 12% respectivamente. Limite inferior de detecção: 0.1 µg/ml (específico do lote). 16. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Barra, A. et al.: Measurement of Anti-Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J. Immunol. Meth. 115, 111 (1988) 2. Claesson, BA. et al.: Development of serum antibodies of the immuno-globulin G class and subclasses against the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B in children and adults with invasive infections. J. Clin. Microbiol. 26, 2549 (1988) 3. Dolan, K.T. et al.: An enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of Haemophilus influenzae type B polysaccharide-specific IgG1 and IgG2 in human and infant rhesus monkey sera. J. Immunoassay 12, 543 (1991) 4. Hetherington, S.V. et al.: Correlation between antibody affinity and serum bactericidal activity in infants. J. Infect. Dis. 165, 753 (1992) 5. Isaacs, D.: Infectious diseases. Editorial overview. Curr. Opin. Pediat. 4, 45 (1992) 6. Kristensen, K., Weis Bentzon, M.: Relation between enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay for the detection of antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B. Acta. path. microbiol. immunol. scand. Sect. C 100, 142 (1992) 7. Lagergard, T. et al.: Comparison between radioimmunoassay and direct and indirect enzymelinked immunosorbent assay for determination of antibodies against Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide. J. Clin. Microbiol. 26, 2554 (1988) 8. Käyhty, H. et al.: Antibodies response to capsular polysaccharides of groups A and C Neisseria meningitis and Haemophilus influenzae type b during bacteremic disease. Infect. Dis. 143, 32 (1981) 9. Anderson, P.: The protective level of serum antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B. J. Infect. Dis. 149, 1034 (1984) 10. Zielen, S. et al.: Untersuchung zur Effektivität der Haemophilus-influenzae-B-Diphtherie- Konjugatimpfung bei deutschen Kindern. Monatsschr. Kinderheilkunde 140, 852 (1992) 11. Zielen, S., Ahrens, P.: Haemophilus influenzae Typ B-Impfserologie. Ellipse 11, 15 (1994) 12. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum. 6, (2002) Version (01) 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /