Título- Avaliação do papel do ligando Jagged1 na regulação da angiogénese do adulto e no desenvolvimento de tumores sólidos.

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1 FUNDING I thank the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for the financial support of my individual PhD grant SFRH /BD/ /2008. And for the financial support of the following projects: SAU-ONC/116164/2009; SAU-ONC/121742/2010; PTDC/SAU- OSM/102468/2008; PTDC/CVT/115703/2009; and PEst-OE/ AGR/U10276/2014. iv

2 Título- Avaliação do papel do ligando Jagged1 na regulação da angiogénese do adulto e no desenvolvimento de tumores sólidos. Resumo- A via Notch é uma via de sinalização intercelular altamente conservada que está envolvida na determinação do destino, e na regulação da proliferação e diferenciação celulares. Jagged1 é um ligando desta via, que tem sido descrito como essencial ao processo de angiogénese durante o desenvolvimento embrinário e que desempenha um papel crucial em diversos aspectos de biologia tumoral. No processo do desenvolvimento angiogénico da retina, Jagged1 foi descrito como tendo um efeito contrário ao de outro ligando da via, o Dll4, mas esta interacção continua por demonstrar noutros contextos angiogénicos. Além de ser expresso na vasculatura, Jagged1 também é detectado em células epiteliais de vários órgãos. Em tumores já foi descrito que a expressão epitelial de Jagged1 aumenta ao longo do desenvolvimento tumoral. Jagged1 é desta forma considerado um marcador de mau prognóstico e de elevado potencial metastático em diversos tipos de cancro, nomeadamente da mama e da próstata. No entanto, o mecanismo intrínseco de sinalização Jagged1/Notch nos contextos acima referidos ainda permanence pouco compreendido. Como tal, o trabalho apresentado nesta tese descreve o papel do ligando Jagged1 na regulação da angiogénese fisiológica e sua interacção com o ligando Dll4. Descreve ainda o seu papel na angiogénese tumoral do adulto, no desenvolvimento de tumores da próstata e finalmente o potencial terapêutico do bloqueio dos ligandos Jagged no tratamento do cancro da próstata. Para investigar o papel do ligando Jagged1 no processo angiogénico do adulto recorreu-se ao uso de mutantes endoteliais específicos de ganho e perda-de-função de Jag1 (ejag1oe e ejag1cko, respectivamente) num modelo de cicatrização de feridas cutâneas. Ainda neste contexto, para investigar as interacções entre os dois ligandos Notch, Jagged1 and Dll4, os mesmos modelos genéticos foram combinados com inibição farmacológica de Dll4 ou Jagged1, respectivamente. Além disso, os mesmos mutantes endoteliais específicos foram ainda utilizados na investigação do papel do ligando Jagged1 na angiogénese tumoral. Para este fim recorreu-se a dois modelos diferentes de tumores no ratinho: o modelo de tumores transplantados subcutaneamente de células Lewis Lung Carcinoma (LLC) e o modelo autóctone de tumor da próstata murino- Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate (TRAMP). Em relação aos processos angiogénicos foram avaliados nos diferentes mutantes, e combinações, diversos parâmetros tais como: densidade, maturidade, funcionalidade e permeabilidade vasculares. Simultaneamente, as populações endoteliais e perivasculares dos diferentes mutantes foram isoladas e efectuada uma análise específica de transcrição de genes envolvidos na regulação da angiogénese nestes tipos celulares. Na avaliação do contributo do ligando Jagged1 expresso no endotélio para o desenvolvimento de tumores da próstata foram ainda analisados os pesos da próstata nos términos das experiências, as lesões v

3 classificadas histológicamente bem como outros aspectos de biologia tumoral, tais como proliferação, apoptose e diferenciação celulares e transição epitélio-mesenquimal. Foi também efectuada uma análise da transcrição e expressão dos membros da via de sinalização Notch, incluindo ligandos (Dll1, 3, 4 e Jagged1 e 2), receptores (Notch1-4) e efectores (Hes1, 2, 5 e Hey1, 2, L), em próstatas de ratinhos saudáveis e de ratinhos TRAMP. Esta análise foi efectuada para descrever a dinâmica dos membros da via de sinalização Notch na tumorigénese da próstata de forma a poder identificar membros ectopicamente expressos na próstata tumoral quando comparados com a próstata normal. Foram ainda isoladas as diferentes subpopulações celulares da próstata, basal, luminal e do estroma e os seus perfis transcripcionais comparados entre próstatas normais e com lesões tumorais (TRAMP). Por fim, avaliou-se o potencial terapêutico de um anticorpo anti-jagged1/2 no tratamento do cancro da próstata, administrando um anticorpo bloqueador anti-jagged1/2 aos ratinhos TRAMP. Estes ensaios terapêuticos foram realizados em duas janelas temporais distintas: numa fase precoce do desenvolvimento de tumores da próstata, das 12 às 18 semanas de idade e numa fase mais tardia, das 18 às 24 semanas de idade, simulando uma detecção precoce e tardia da doença nos humanos. A eficácia terapêutica foi avaliada pelos pesos da próstata no término da experiência, classificação histopatológica das lesões, análise da vasculatura, proliferação, apoptose e diferenciação celulares, alterações nos compartimentos celulares da próstata, transição epitélio-mesenquimal, e alterações da população de células cancerosas estaminais (CSCs). Nestes trabalhos foram utilizadas técnicas de imunofluorescência, imunohistoquímica, fluorescent associated cell sorting (FACS), e quantitative real time PCR (qrt-pcr). Colectivamente, os resultados aqui apresentados demonstram que Jagged1 é um ligando próangiogénico em contextos de angiogénese do adulto, tanto fisiológica como tumoral. No modelo de cicatrização de feridas foi demonstrado que os mutantes de ganho-de-função (ejag1oe) exibiam um processo de cicatrização de feridas cutâneas e de desenvolvimento de tumores sólidos acelerado, relativamente aos respectivos controlos, enquanto os mutantes de perda-de-função exibiam o fenótipo oposto. Estas diferenças fenotípicas entre os mutantes deveram-se aos primeiros exibirem uma vasculatura mais densa, com maior número de células de suporte, e portanto mais funcional e menos permeável, enquanto que os segundos exactamente o oposto. O papel pró-angiogénico do ligando Jagged1 foi também demonstrado ser exercido através de complexas interações com diferentes receptores Notch. Utilizando o modelo de cicatrização de feridas foi demonstrado que Jagged1 presente no endotélio regula negativamente a transcrição e activação de Notch1, e portanto bloqueia a activação de Notch1 mediada por Dll4. Ao contrário do que acontece com Notch1, foi também demonstrado que Jagged1 regula positivamente a transcrição e activação de Notch4. Esta observação foi vi

4 averiguada tanto no contexto angiogénico fisiológico como tumoral. Adicionalmente, a sinalização por Jagged1/Notch4 foi implicada na maturação vascular, uma vez que quer as feridas e tumores dos mutantes ejag1oe quer as feridas de ratinhos administrados com um anticorpo Notch4 agonista exibiram aumento da maturação vascular. Também foi demostrado que Jagged1 endotelial é capaz de activar Notch3/HeyL expresso nas células perivasculares e assim também contribuir para a regulação do recrutamento dessas mesmas células de suporte, tornando a vasculatura mais funcional e menos permeável, contribuindo para a cicatrização e desenvolvimento tumorais. Adicionalmente, foi demonstrado que o ligando endotelial Jagged1 contribui para a displasia tumoral não só pela sua função pró-angiogénica, limitando o aporte de nutrientes e oxigénio às células tumoriais, mas também por uma função angiócrina mediada pela activação de Notch3 e expressão de Hey1 nas células tumorais. Desta forma, este ligando regula ainda a proliferação, apoptose e diferenciação das células tumorais prostáticas, assim como o processo de transição epitélio-mesenquimal. Inclusivamente, através do estudo da expressão dos diferentes components Notch na próstata tumoral versus próstata normal, o eixo Jagged1/2/Notch3/Hey1 foi identificado como estando ectopicamente expresso no tecido prostático tumoral. Esta observação sugere então que para a regulação dos processos tumorigénicos referidos anteriormente, não só é importante o papel pró-angiogénico e angiócrino do ligando Jagged1 endotelial, mas também o seu papel directo decorrente da expressão aumentada ao nível das células tumorais. Por último, foi demonstrado que o bloqueio da sinalização Notch mediada pelos ligandos Jagged inibe o desenvolvimento e progressão de tumores da próstata do ratinho e que como tal, pode constituir uma nova potencial abordagem terapêutica no tratamento do cancro da próstata. O bloqueio de Jagged1/2 mimetizou o fenótipo vascular decorrente da perda-defunção endotelial específica de Jagged1, produzindo uma neo-vascularização menos densa, imatura e consequentemente menos funcional e mais permeável, inibindo fortemente o desenvolvimento de tumores da próstata murinos. De forma semelhante ao verificado nos mutantes de perda-de-função, o bloqueio de ambos os ligandos Jagged levou à inibição do crescimento celular próstático, restingindo a proliferação e promovendo a apoptose celular e inibindo a transição epitélio-mesenquimal. Adicionalmente, o tratamento com o anticorpo bloqueador também teve um efeito protector relativamente às alterações nos compartimentos celulares decorrentes da displasia prostática. O tratamento minimizou a perda da identidade celular luminal, inibiu a proliferação do compartimento basal e a des-diferenciação de um fenótipo luminal para um mais basal. O bloqueio de Jagged1/2 também apresentou um efeito benéfico ao nível da regulação do pool de células cancerosas estaminais da próstata, apresentado um efeito inibitório sobre a sua proliferação e sobrevivência. Adicionalmente, as amostras tratadas com anti-jagged1/2 apresentaram uma significativa sub-expressão de Notch3 e Hey1 nesta subpopulação celular. vii

5 Em conclusão, os resultados aqui apresentados contribuem para uma compreensão mais abrangente do papel do ligando Jaged1 no organismo adulto, fora do sistema nervoso central, inclusivamente em cenários tumorais, como o caso do cancro da próstata. De forma mais específica, a sinalização mediada por Jagged1, foi demonstrada ser uma rede complexa envolvendo múltiplos aspectos em diferentes tipos celulares e dependente do receptor envolvido. No endotélio Jagged1 actua como um ligando pró-angiogénico através de um efeito antagonístico a Dll4/Notch1 e mediado quer pela activação de Notch4/Hey1 no endotélio quer pela activação de Notch3/HeyL nas células perivasculares. Também foi importante verificar que ambas estas funções da sinalização por Jagged1/Notch são altamente conservadas em diferentes contextos no adulto, incluindo nos processos angiogénicos fisiológicos e patológicos. O ligando Jagged1 expresso por células endoteliais exerce ainda um papel angiócrino mediado pela activação de Notch3 e expressão de Hey1 na regulação do desenvolvimento tumoral da próstata. Esta função angiócrina juntamente com a expressão ectópica dos ligandos Jagged nos tecidos tumorais da próstata do ratinho constituem importantes fontes de regulação dos diversos aspectos da biologia tumoral. O bloqueio de Jagged1 pode desta forma vir a constituir um nova e promissora forma terapêutica no tratamento do cancro da próstata. Palavras-chave: Jagged1, Notch, angiogénese, desenvolvimento tumoral, cancro da próstata. viii

6 Title- The role of Jagged1 in adult angiogenesis and in solid tumor development. Abstract- Jagged1 (Jag1) is a Notch signaling ligand, which has been described as essential for developmental angiogenesis and to play an important role in several aspects of tumor biology. However the underlying mechanism related to Jagged1/Notch signaling still remain incompletely understood. Therefore this thesis analyzed Jagged1 driven Notch signaling enrolment in adult angiogenesis settings, and in tumor development. To address the role of endothelial Jag1 in physiological and tumoral angiogenesis, endothelial-specific Jag1 mutants driven angiogenic phenotypes were assessed in skin wound healing and in transplanted tumors and prostatic autochthonous tumor growth, respectively. An extensive transcription and expression analysis of Notch signaling members in the tumorigenic development of the mouse prostate was also performed to identify ectopically expressed Notch members. Lastly, the therapeutic potential of an Anti- Jagged1/2 antibody in mouse prostate cancer was evaluated. Altogether, results presented here demonstrate that Jagged1 is a pro-angiogenic ligand due to its ability to antagonize Dll4/Notch1 mediated signaling. It also has a pro-maturation function by both endothelial Notch4 and perivascular Notch3 mediated signaling. Both these functions contribute to accelerated wound healing and tumor growth, by inducing a more functional vasculature. Moreover, we have identified a new angiocrine function for endothelial Jagged1, mediated through Notch3/Hey1 activation in tumor cells. Finally, we have demonstrated that either by mediated endothelial-specific angiocrine function or by tumor cells mediated Jagged1 ectopic expression, this ligand regulated tumor cell proliferation, apoptosis, de-differentiation, epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem-like cells proliferation and survival. Ultimately, we have demonstrated that blocking Jagged-mediated Notch signaling inhibited development and progression of mouse prostate cancer and therefore constitutes a promising therapeutic approach in prostate cancer treatment. Keywords: Jagged1, Notch, angiogenesis, tumor development, prostate cancer. ix