7. LOCALIZAÇÃO DA SUBUNIDADE β1 DA INTEGRINA POR IMUNOFLUORESCÊNCIA Por microscopia confocal

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1 Resultados 7. LOCALIZAÇÃO DA SUBUNIDADE β1 DA INTEGRINA POR IMUNOFLUORESCÊNCIA Por microscopia confocal A marcação da integrina β1 pode ser analisada por microscopia de fluorescência confocal, utilizando para isso o anticorpo específico para a subunidade β1 da integrina, como mostra a figura 21. Células transfectadas com o shrna-syn4 e o oncogene EJ-ras apresentam uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência em verde (integrina β1) quando comparadas com a célula selvagem. Para ambas as células, a marcação se apresentou exclusivamente perinuclear, diferentemente da EC selvagem com marcação evidente no contorno das células. FIGURA 21: LOCALIZAÇÃO DA INTEGRINA β1 POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL. Células EC, shrna-syn4-ec e EJ-ras-EC não permeabilizadas, foram marcadas com o anticorpo anti- integrina β1 (verde) e o núcleo corado com DAPI (azul). EC (WT-Wild Type): Célula endotelial de aorta de coelho selvagem; EJ-ras-EC: EC transfectada com o oncogene EJ-ras; shrna-syn4-ec (clone 10+): ECs transfectadas com o vetor contendo o short hairpin RNA para o sindecam-4. A barra representa 20µm. 55

2 Resultados 8. LOCALIZAÇÃO DA FIBRONECTINA POR IMUNOFLUORESCÊNCIA Por microscopia confocal Sabendo da importância do sindecam-4 no processo de adesão célulamatriz, resolvemos analizar por microscopia de fluorescência confocal, a proteína de matriz extracelular, a fibronectina, nas células EC, EJ-ras-EC e shrna-syn4-ec. A marcação da fibronectina em verde é evidente nas diferentes células, com perfil de marcação fibrilar característico de região de matriz extracelular. As células transfectadas com shrna-syn4 apresentam uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência para a fibronectina quando comparada com as células EC e EJ-ras-EC. Aparentemente, as células EJ-ras-EC não apresentam diferenças na intensidade de fluorescência para a fibronectina quando comparadas com a EC selvagem (Figura 22). FIGURA 22: LOCALIZAÇÃO DA FIBRONECTINA POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL. Células EC, shrna-syn4-ec e EJ-ras-EC não permeabilizadas, foram marcadas com o anticorpo anti- fibronectina (verde) e o núcleo corado com DAPI (azul). EC (WT-Wild Type): Célula endotelial de aorta de coelho selvagem; EJ-ras-EC: EC transfectada com o oncogene EJ-ras; shrna-syn4-ec (clone 10+): ECs transfectadas com o vetor contendo o short hairpin RNA para o sindecam-4. A barra representa 20µm. 56

3 Resultados 9. LOCALIZAÇÃO DO PROTEOGLICANO BIGLICAM POR IMUNOFLUORESCÊNCIA Por microscopia confocal Como o silenciamento do sindecam-4 em shrna-syn4-ec mostrou um aumento da ordem de 63% na expressão de condroitim sulfato em relação a EC selvagem, resolvemos investigar a expressão de biglicam, um proteoglicano típico de matriz extracelular e que apresenta cadeias de condroitim sulfato em sua estrutura, nessas células. As células foram submetidas à imunomarcação utilizando o anticorpo para o biglicam. A figura mostra visivelmente a marcação de biglicam em verde na matriz extracelular em todas as células, sendo que, para as células transfectadas (shrna- Syn4-EC e EJ-ras-EC) a marcação do tipo fibrilar foi menos evidente, com marcação difusa pela célula. As células silenciadas para o gene de sindecam-4 mostram marcação mais intensa com distribuição distinta das células selvagens (Figura 23). FIGURA 23: LOCALIZAÇÃO DO BIGLICAM POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL. Células EC, shrna-syn4-ec e EJ-ras-EC não permeabilizadas, foram marcadas com o anticorpo anti-biglicam (verde) e o núcleo corado com DAPI (azul). EC (WT-Wild Type): Célula endotelial de aorta de coelho selvagem; EJ-ras-EC: EC transfectada com o oncogene EJ-ras; shrna- Syn4-EC (clone 10+): ECs transfectadas com o vetor contendo o short hairpin RNA para o sindecam- 4. A barra representa 20µm.. 57

4 Resultados 10. LOCALIZAÇÃO DO VEGF POR IMUNOFLUORESCÊNCIA Por microscopia confocal Avaliada a localização de diferentes proteínas nas diferentes células, resolvemos analisar ainda a localização do fator de crescimento VEGF, utilizando o anticorpo específico para este fator de crescimento. Curiosamente, ambas as células shrna-syn4-ec e endoteliais selvagem, apresentaram um perfil de marcação tanto fora como no interior das células, com distribuição perinuclear (Figura 24). Por outro lado, a célula EJ-ras-EC apresentou marcação menos intensa quando comparada as outras células, com a presença do VEGF apenas nas regiões de citoplasma e fora da célula, não apresentando marcação na região do núcleo (Figura 24). FIGURA 24: LOCALIZAÇÃO DO VEGF POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL. Células EC, shrna-syn4-ec e EJ-ras-EC permeabilizadas, foram marcadas com o anticorpo anti-vegf (vermelho) e o núcleo corado com DAPI (azul). EC (WT-Wild Type): Célula endotelial de aorta de coelho selvagem; EJ-ras-EC: EC transfectada com o oncogene EJ-ras; shrna- Syn4-EC (clone 10+): ECs transfectadas com o vetor contendo o short hairpin RNA para o sindecam- 4. A barra representa 20µm. 58

5 Discussão DISCUSSÃO O silenciamento do gene do sindecam-4 pelas células shrna-syn4-ec e a superexpressão desse proteoglicano nas células EJ-ras-EC levaram a mudanças fenotípicas e funcionais nos fenômenos de adesão célula-célula, célula-matriz e célula substrato em células endoteliais, bem como nas características morfológicas dessas células. Resultados semelhantes aos deste trabalho foram observados para células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Essas células transfectadas com vetor para a expressão do proteoglicano sindecam-4 apresentam mudanças fenotípicas em sua morfologia como, maior grau de espraiamento, forma fibroblástica com bordas côncavas e maior proeminência dos microfilamentos, quando comparadas com as CHO-K1 selvagens. Em contraste, CHO-K1 quando transfectadas com vetor para a expressão do sindecam-4 com a porção citoplasmática trucada total ou parcialmente, também apresentam mudanças fenotípicas em sua morfologia como, perda do espraiamento, acentuado grau de desordenamento, desorganização do citoesqueleto, aumento cortical dos filamentos de actina e circunferência alterada, quando comparadas com as CHO-K1 selvagens (Longley et al., 1999). A proteína Ras tem sido objeto de muitos trabalhos na literatura, em função da relação de mutações nessa proteína e incidência de cânceres. Aproximadamente 30% dos cânceres em humanos ocorrem pela mutação em Ras, sendo 90% em adenocarcinomas de pâncreas (Takai et al., 2001), em função de mutações pontuais que usualmente prejudicam a atividade GTPasica da proteína Ras (Feig, 1999). Primeiramente, Ras foi descoberta como uma proteína citosólica associada à membrana plasmática, que desencadeia diversas vias de sinalização para dentro das células em resposta a fatores de crescimento, contribuindo na regulação de eventos como crescimento, diferenciação e sobrevivência celular (Karnoub & Weinberg, 2008; Lopes et al., 2006). No entanto, com os avanços da biologia celular e molecular, tornou-se possível investigar a localização da proteína Ras nas células empregando-se 59

6 Discussão marcadores fluorescentes (GFP- green fluorescent protein). Assim, os estudos mostram que a localização de Ras não está exclusivamente associada à membrana plasmática, mas também as membranas de outras organelas, como reticulo endoplasmático rugoso, Golgi, endossomos e mitocondrias (Fehrenbacher et al., 2009). Células endoteliais transfectadas com o oncogene EJ-ras apresentam uma série de eventos celulares atípicos quando comparadas com a célula endotelial selvagem. EJ-ras-EC superexpressam o proteoglicano sindecam-4, apresentando elevada síntese de HS na fração celular e secretado para o meio de cultura (Lopes et al., 2006). Esses resultados mostram a inter-relação da proteína Ras com este proteoglicano, uma vez que, Ras faz parte da via de transdução de sinal desencadeada pelo próprio proteoglicano sindecam-4, levando a uma série de eventos celulares. Assim como a mutação da proteína Ras leva a superexpressão deste proteoglicano (Lopes et al., 2006), a diminuição da expressão de Ras ocorre quando o sindecam-4 é silenciado nessas células. O aumento da síntese de sindecam-4 em células EJ-ras-EC, implica na localização da proteína Ras principalmente na membrana plasmática. Por outro lado, o silenciamento de sindecam-4 em células shrna-syn4-ec, leva a alteração na localização de Ras nessas células, sugerindo que a sua associação esteja ocorrendo em membranas internas de região citosólica da célula. A matriz extracelular é constituída por um conjunto de macromoléculas como colágenos, proteoglicanos (PGs), glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas (fibronectina, laminina, vitronectina, entactina, entre outras), que mantém as células associadas possibilitando a organização dos tecidos e a sobrevivência celular (Aoudjit & Vuori, 2001). Além disso, é também atribuída à matriz extracelular a participação em vários eventos celulares como: adesão, migração, proliferação, diferenciação e apoptose, pela interação entre as moléculas da matriz extracelular e os receptores da superfície celular, tais como, integrinas, proteoglicanos de heparam sulfato, entre outros (Bernfield et al., 1999; Kresse & Schonherr, 2001; Schonherr & Hausser, 2000; Schonherr et al., 2005; Yamaguchi, 2000). 60

7 Discussão Trindade e colaboradores (2008) atribuem à matriz extracelular de células endoteliais, a importante função de receber estímulos extracelulares para o desencadeamento de sinais nas células para a síntese de compostos. Observaram por fluorescência de microscopia confocal, que a heparina colocaliza com a proteína fibronectina presente na matriz, regulando a síntese de proteoglicanos de heparam sulfato nessas células. Ainda, em concordância com esses dados, observaram que o efeito é dependente da presença de matriz, pois células em suspensão não são sinalizadas por heparina (Trindade et al., 2008). Integrinas e proteoglicanos de heparam sulfato agem em conjunto no processo de adesão focal, modulando as interações entre o citoesqueleto das células e as proteínas da matriz extracelular (Dreyfuss et al., 2009; Woods, 2001). Células shrna-syn4-ec apresentam diminuição na expressão de sindecam-4 na superfície celular, com subseqüente diminuição da síntese de fibronectina na matriz extracelular dessas células. Já células EJ-ras-EC ao superexpressarem o sindecam-4, apresentam desorganização da fibronectina presente na matriz extracelular O papel da integrina com receptores de matriz extracelular já é bem conhecido, sendo determinante para a sobrevivência das células agindo em conjunto com o sindecam-4, na adesão célula-célula e célula-matriz. Esta interação regula a migração celular, pelo aumento da extensão de lamelopódias, o que modula a afinidade da célula com a matriz extracelular (Dreyfuss et al., 2009; Longley et al., 1999). Longley e colaboradores (1999) ao transfectarem células CHO-K1 com vetor para a expressão do sindecam-4 com a porção citoplasmática trucada parcialmente ou inteira, analizaram por citometria de fluxo a expressão da subunidade β1da integrina nestas células, mostrando não haver diferença na quantidade de expressão desta proteína pela técnica de citometria de fluxo, quando comparada a células CHO-K1 selvagens. No entanto, ao submeter estas mesmas células a imunomarcação com o anticorpo específico para a subunidade β1da integrina, observaram por microscopia de fluorescência confocal uma marcação predominantemente difusa nas células quando 61

8 Discussão comparadas com as células selvagens que apresentaram uma marcação exclusivamente periférica (Longley et al., 1999). Os dados observados neste trabalho estão em concordância com os resultados de Longley e colaboradores (1999), pois a subunidade β1 da integrina em células deficientes em sindecam-4 pelo silenciamento (shrna- Syn4-EC) e em células que super-expressam ras (EJ-ras-EC), apresentaram um perfil de marcação difuso nestas células. Já as EC apresentaram uma marcação exclusivamente periférica, destacando a importância do sindecam-4 na expressão e disposição da integrina β1em células endoteliais. Os proteoglicanos de HS exercem uma importante função nos eventos de sinalização celular para fatores de crescimento, onde estes além de se ligarem aos seus receptores para o desencadeamento de uma série de respostas celulares são também dependentes das cadeias de HS para desempenharem sua ação, como é o caso do sindecam-4. Estruturalmente as cadeias de HS dos proteoglicanos são altamente diversificadas, o que favorece na interação com uma variedade de proteínas como, fatores de crescimento, quimiocinas, morfógenos, componentes de matriz extracelular, enzimas e entre outras. Esta interação tem um importante papel na modulação em diferentes processos biológicos como proliferação, diferenciação, sobrevivência e apoptose (Dreyfuss et al., 2009). Dentre as diversas funções do sindecam-4, é importante destacar a relevância deste proteoglicano em eventos celulares como regulação no crescimento de reparo vascular (doenças vasculares), hipóxia, angiogênese e função imune da célula (Alexopoulou et al., 2007). Nunes e colaboradores (2007), com a finalidade de comprovarem a atividade pró-angiogênica da glicoproteína trombospondina-1, submeteram células endoteliais ao tratamento com o mesmo anticorpo anti-sindecam-4 utilizado no presente trabalho, que é específico para o ectodomínio (região extracelular) do sindecam-4. Observaram que a trombospondina-1 que era capaz de induzir a formação de estruturas capilares pelas células endotelias quando plaqueadas em matrigel, não mais apresentava atividade angiogênica após o tratamento com o anticorpo antisindecam-4, comprovarando assim que a ação da trombospondina-1 é dependente do sindecam-4 para a formação de estruturas tipo capilar em cultura (Nunes et al., 2008). 62

9 Discussão Diversos trabalhos sugerem que a ligação de fatores de crescimento com o heparam sulfato proporcionaria uma proteção dos fatores à ação de proteases (Saksela et al., 1988). Tal ligação poderia servir como um "reservatório", sendo liberado de acordo com a necessidade de proliferação da célula (Moscatelli, 1988). Sabendo que células transfectadas com o oncogene EJ-ras são independentes de fatores de crescimento para se proliferarem em cultura (Kovary et al., 1989), apresentando descontrole no ciclo celular, resultando em uma constante proliferação (Lopes et al., 2006), podemos sugerir que a baixa expressão de VEGF nas células EJ-ras-EC ocorreu em decorrência da superexpressão de sincedam-4, enquanto que para as células shrna-syn4-ec a expressão de VEGF foi semelhante à da endotelial selvagem. O proteoglicano biglicam em conjunto com colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, fibronectina, laminina, vitronectina, entactina, entre outras moléculas, compõe a matriz extracelular, conferindo a ela importante papel nos eventos de adesão, migração, proliferação, diferenciação e apoptose (Schonherr & Hausser, 2000; Trindade et al., 2008). Animais deficientes de biglicam apresentam progressivamente com a idade, diminuição de massa óssea, dificuldade em produzir células da medula, redução na síntese de colágeno e relativo aumento de células em apoptose (Young et al., 2002). Nossos resultados mostraram que o silenciamento do sindecam-4 em células endoteliais levou a alteração na localização e disposição deste proteoglicano na matriz extracelular. Ainda, foi observado que o silenciamento do gene do sindecam-4 promoveu aumento na expressão de condroitim sulfato, que poderia estar glicosilado sob a forma de biglicam. 63

10 Conclusão CONCLUSÕES Células endoteliais submetidas ao silenciamento para o proteoglicano sindecam-4 (shrna-syn4-ec) ou para a super-expressão do mesmo (EJ-ras- EC) foram estudadas comparativamente com células endoteliais selvagens (EC). Este estudo comparativo nos possibilitou concluir: As células shrna-syn4-ec apresentam características morfológicas distintas das selvagens e das que super-expressam Ras, com desorganização na disposição e fraca adesão célula-célula e célulamatriz o que leva dificuldade para atingir a confluência. Por outro lado, estas últimas crescem em cultura formando multicamadas e não apresentam inibição por densidade de saturação; A presença do marcador específico de células endoteliais, o Fator de von Willebrand (vwf) foi demonstrada tanto para as células silenciadas para sindecam-4 como para as que super-expressam Ras e concomitante, super-expressam sindecam-4, mostrando inequivocamente que se tratam de células endoteliais. Diminuição na expressão do esqueleto protéico do sindecam-4 e das cadeias de HS presentes no extrato celular e no meio de cultura para as células shrna-syn4-ec. Por outro lado, as que super-expressam Ras mostram aumento na expressão do esqueleto protéico do sindecam-4 e das cadeias de glicosaminoglicanos (CS e HS) presentes no extrato celular e no meio de cultura; Diminuição na expressão da proteína Ras, com localização particular na região perinuclear foi observada para as shrna-syn4-ec, contrastando com as que super-expressam essa proteína, que mostram sua localização periférica mais intensa na região de superfície celular; Diminuição na expressão da subunidade β1da integrina na região de superfície celular, com marcação difusa pela célula tanto para a célula com silenciamento do gene do sindecam-4 como para a que apresenta aumento na expressão desse proteoglicano; 64