Compartimentos intracelulares e endereçamento. FFI0710- Biologia Molecular e Celular II IFSC, 2015

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1 Compartimentos intracelulares e endereçamento FFI0710- Biologia Molecular e Celular II IFSC, 2015

2 Célula endotelial bovina corada: verde, membranas do RE; em laranja, mitocôndrias

3 Mecanismos de importação pelas organelas O destino de uma proteína sintetizada no citosol depende de sua seqüência de aminoácidos; Sinal de distribuição Se não há sinal: residem no citosol; Sinais diferentes podem direcionar p/: núcleo, mitocôndrias, cloroplastos, peroxissomos ou RE.

4 Visão geral da principal via de distribuição de proteínas em células eucarióticas

5 Como a proteína pode ser importada? 1. Transporte mediado: as proteínas se movimentam entre o citosol e o núcleo por meio dos poros nucleares (funcionam como portões seletivos). 2. Transporte transmembrana: proteínas translocadoras transportam diretamente proteínas entre citosol-organelas. 3. Transporte vesicular: carregam proteínas a partir do RE. Todos requerem energia!

6 Qual o compartimento destino? Seqüência sinalizadora (15 a 60 aminoácidos) Sinal de distribuição típico. Freqüentemente é removido após a síntese As seqüências-sinal que especificam o mesmo destino podem variar. Região sinalizadora Arranjo específico tridimensional de átomos na superfície protéica. Persistem após a síntese. Podem direcionar para o núcleo e lisossomos, p.e. Propriedades físicas mais importantes que a seqüência exata.

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8 Transporte mediado: citosol-núcleo Envelope nuclear: 2 membranas concêntricas. O envelope nuclear é perfurado por POROS NUCLEARES Formam canais para o trânsito de macromoléculas Entram: proteínas nucleares Saem: RNAm maduros (mrnps= complexo mrna+proteínas) e subunidades ribossomais, trnas Seqüência-sinal = 1 ou 2 seq. curtas contendo várias K ou R Sinal de localização nuclear

9 Micrografia eletrônica de varredura (criofratuta) de uma ponta de raiz de cebola mostrando o núcleo e os poros nucleares. Fonte:

10 Complexo do poro nuclear (NPCs) (~80 milhões de Daltons nos vertebrados; 50 diferentes proteínas em múltiplas cópias) cél. típica de mamífero: 3 a 4 mil NPCs RE Membrana nuclear externa Espaço perinuclear Membrana nuclear interna Complexo poro nuclear Cesta nuclear Anel distal Fibrilas citoplasmáticas Anel citoplasmático Membrana ext. Domínio luminal Membrana int. Anel nuclear

11 Modelo simplificado de translocação via NPC a) Esquema do NPC. NE, nuclear envelope; CF, cytoplasmic filament; NF, nuclear filament. The FG-surface is formed by FG nucleoporins. b) Ions and small neutral proteins can pass via the selective filter by diffusion. c) Large molecules or complexes penetrate via NPC only within transport complexes. REVIEW: Nucleocytoplasmic Transport of Proteins (DOI: / S )

12 Destino: núcleo A interação de sinais de localização nuclear com o poro nuclear requer auxílio de Receptores de importação nuclear (importinas) Ligam-se ao sinal de localização nuclear Receptores ajudam a direcionar a proteína por interação com as nucleoporinas. A transferência utiliza energia da hidrólise do GTP

13 Mudanças conformacionais da importina-β Structure, Vol. 16, Issue 6, Pages , 2008.

14 Ran é a GTPase que dirige o transporte

15 Transporte citoplasma-núcleo Volume 11, Issue 12, 2001, Pages

16 AS NUCLEOPORINAS FG Antonin, W. Don t get stuck in the pore". The EMBO Journal (2013) 32, doi: /emboj

17 Como a proteína pode ser importada para organelas? 1. Transporte mediado: citosol-núcleo através dos poros nucleares que funcionam como portões seletivos. 2. Translocadores protéicos: proteínas translocadoras transmembrana transportam diretamente proteínas entre citosol-organelas. 3. Transporte vesicular: carregam proteínas a partir do RE.

18 Destino: mitocôndria e cloroplastos As proteínas estão desdobradas para entrar; possuem uma seq.-sinal, geralmente clivada após a translocação; as seq-sinais são necessárias e suficientes para importação; Proteína precurssora Hsp 70 citosólica Seqüência de direcionamento p/ a matriz O transporte a um sítio específico na organela requer outra sequência-sinal;

19 Proteína precurssora Importação de proteínas para o interior da matriz mitocondrial Hsp 70 citosólica Seqüência de direcionamento p/ a matriz Receptor de importação citosol Poro principal de importação Sítio de contato Espaço intermembranas Matriz mitocondrial proteína ativa Hsp70 da mitocondrial Protease de processamento da matriz Seqüência de direcionamento clivada

20 Setas identificam locais de contato entre a membrana externa e interna na mitocôndria

21 Destino: Retículo Endoplasmático (RE) Porta de entrada p/ : Golgi, endossomos, lisossomos e secreção; Recebe 2 tipos de proteínas do citosol: Hidrossolúveis, que são completamente translocadas pela membrana do RE e liberadas no lúmen. Transmembrânicas, que são parcialmente translocadas pela membrana do RE e tornam-se embebidas nela. As proteínas geralmente entram enquanto são sintetizadas... (co-traducional)

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23 A seqüência-sinal é guiada 1. Por uma partícula reconhecedora de sinal (PRS ou SRP) presente no citosol, liga-se à sequência-sinal de RE exposta 2. Até o receptor de SRP, embebido na membrana do RE. Há sítios moleculares de posicionamento conectando os ribossomos que estão sintetizando proteínas aos canais de translocação disponíveis.

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25 Síntese de proteínas solúveis e seu transporte co-traducional através da membrana do RE (Partícula reconhecedora de sinal) Seqüência sinal citosol

26 = protein conducting channel Mammalian Sec61 Complex in: Science. 2009; 326(5958): doi: /science

27 Síntese de proteínas transmembranas na bicamada lipídica do RE Nem todas as proteínas que entram no RE são liberadas no lúmen... Algumas permanecem na membrana do RE (ou outras organelas) unipasso multipasso

28 Modelo de translocação de proteína transmembrana unipasso

29 Síntese e inserção na membrana do RE das proteínas unipasso do tipo II citosol Lúmen do ER Sequência sinalâncora interna

30 Experimentos com microssomos

31 Algumas proteínas são presas à membrana por uma âncora fosfolipídica Glicosilfosfatidilinositol (GPI)

32 Transporte vesicular: visão geral das vias secretora e endocítica de distribuição de proteínas Qual o caminho das proteínas a partir do RE? Como são carregadas?