Introdução a biologia celular e compar4mentalização. Curso de Ciências Biomédicas FMRP-USP (RCB 105) Prof. Dr. Luis LamberB Maio 2017

Transcrição

1 Introdução a biologia celular e compar4mentalização Curso de Ciências Biomédicas FMRP-USP (RCB 105) Prof. Dr. Luis LamberB Maio 2017

2 A célula é a unidade fundamental da vida Vida Crescer Reproduzir Processar informação Realizar reações químicas Biologia celular molecular: Bioquímica, biofísica, biologia molecular, microscopia, genética, ciência da computação, fisiologia e biologia do desenvolvimento.

3 Todos os organismos vivos são cons4tuídos por células

4 Células: grande variedade de formas e tamanhos bacteria Célula de Purkinge Leishmania (promas4gotas) Epitélio intes4nal Células sanguíneas Tecido vegetal ( esqueleto de celulose)

5 - Bacteria (eubacteria) - Archaea - Fungi (leveduras, bolores) - Plantas - Aminais - Pro4stas

6 Células possuem muitas caracterís4cas universais Células possuem cons4tuição química semelhante e suas funções básicas são realizadas por maquinarias muito similares Ancestral comum

7 Principais Modelos Experimentais Atuais da Biologia Celular e Molecular E. coli bactéria S. cerevisiae Levedura de brotamento C. elegans Nematódeo D. melanogaster Mosca da fruta M. musculus Camundongo H. sapiens ser humano A. thaliana erva estrelada

8 S. cerevisiae Figure 1-32 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

9 Arabidopsis. thaliana Figure 1-33 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

10 D. melanogaster - Nove dias para evoluir do ovo ao adulto - Genoma pequeno 170 milhões de pb em comparação com os 3.2 bilhões em humanos frequencia de duplicacao genica e muito menor Figure 1-34 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

11 Caenorhabdi>s elegans - Precisão na formação do corpo adulto 959 células (ovo ao adulto 4 dias) - Primeiro organismo mul4celular a ter o genoma sequenciado Figure 1-38 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

12 Dinâmica celular Vídeo células T citotóxicas

13 Compartimentos intracelulares (sem membrana limitante) membrana

14 Compartimentos intracelulares envoltos por membrana e direcionamento de proteínas Célula pituitária Lydia Yuan

15 Células eucarióbcas possuem comparbmentos envoltos por membrana Célula animal Célula bacteriana

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17 Principais compartimentos intracelulares envoltos por membrana de uma célula animal Figure 12-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

18 Hepatócito:

19 Figure 12-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Em hepatócitos e Células acinosas do pâncreas o RE tem uma superfície de membrana que é 25 e 12 vezes maior que a MP.

20 Topologia Origem das organelas citoplasmáticas

21 Origem das organelas citoplasmáticas Quais organelas podem ser construídas de novo?

22 Hipótese do sinal Sinais de direcionamento determinam a localização de proteínas fora do citosol Sinal de direcionamento Receptor de direcionamento

23 Sequencia sinal lineares tipicamente resíduos Sinal em Patch (extensões internas da proteína) Aminoacidos carga positiva Aminoacidos carga negativa Aminoacidos hidrofóbicos Aminoacidos hidroxilados

24 Estratégias para estudo da função de sequencias sinais e maquinaria de translocação signal sequence a or b gene encoding cytosolic protein plasmid used to transfect cells A B A B signal sequence a ( ) directs fusion protein to organelle A signal sequence b ( ) directs fusion protein to organelle B

25 Estratégias para estudo da função de sequencias sinais e maquinaria de translocação 1. The labeled protein co-fractionates with the organelle during centrifugation. signal sequence radioactively labeled protein 2. The signal sequence is removed by a specific protease that is present inside the organelle. incubated without organelle incubated with organelle protein transported into isolated organelle radioactive proteins on SDS gel protease 3. The protein is protected from digestion when proteases are added to the incubation medium, but is susceptible if a detergent is first added to disrupt the protein organelle membrane. no detergent plus detergent By exploiting such in vitro assays, one can determine what components

26 O sistema de endomembranas RE, Complexo de Golgi, endossomos, lisossomos e membrana plasmá4ca compõem a via biossinté4ca

27 Varias doenças estão relacionadas ao transporte no sistema de endomembranas I-cell Hipercolesterolemia Resistência a insulina Alzheimer Infecção HIV Fibrose Cística

28 O retículo endoplasmático (RE) é a porta de entrada de proteínas na via biossintética-secretora Micrografias fluorescentes do RE RE de planta (proteína residente no RE fusionada a GFP) (fonte: Chris Hawes lab.) Mammalian ER COS-7 cells (IF anti-bip) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

29 O retículo endoplasmático rugoso (RER) Micrografia de uma célula pancreática exócrina

30 A importação de proteínas para o rebculo endoplasmá4co rugoso ocorre predominantemente durante a tradução (é co-traducional) - RE - Núcleo - Mitocôndria - Cloroplastos - Peroxissomos

31 O RE é estruturalmente e funcionalmente diverso Reconstrução tridimensional de uma região do RE rugoso e RE liso

32 Como proteínas são endereçadas para o RE?

33 Isolamento de microssomos rugosos Quando células são processadas o RE fragmentase em pequenas estruturas vesiculares (microssomos). Microssomos com ribossomos aderidos à membrana tem uma densidade maior que a de microssomos lisos

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35 Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) A Hipótese sinalizadora

36 Entrada de proteínas no retículo endoplasmatico depende de sinais de direcionamento definidos pela sequência de aminoácidos Ex. Signal Peptide Human Prolactin: MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP Figure 15-6 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

37 Dois 4pos de proteínas são translocadas no RE Proteínas transmembrana Parcialmente translocadas, ficando embebidas na membrana do RE. Destino final é a membrana plasmática ou a membrana de uma organela da via. Proteínas hidro-solúveis Completamente translocadas, sendo despejadas no lúmen do RE. Podem ser secretadas ou mantidas no lúmen de uma organela da via.

38 Principais fatores no processo de translocação de proteínas no RE Seqüência (ou peptídeo) sinal presente na proteína sendo traduzida Partícula de Reconhecimento de Sinal (PRS ou SRP) Interage com a seqüência sinal assim que a mesma é traduzida e escolta o ribossomo (+ RNAm) à membrana do RE Receptor da PRS Proteína integral da membrana do RE, reconhece a PRS e facilita a entrada da cadeia polipeptídica nascente no canal de translocação Canal de translocação Complexo transportador que permite a passagem da cadeia polipeptídica nascente através da membrana do RE

39 Uma Partícula de Reconhecimento de Sinal (PRS) é um complexo formado por seis subunidades de proteínas e uma molécula de RNA A PRS interage com a seqüência sinal nascente e posiciona-se na interface entre as subunidades do ribossomo dificultando o acesso de fatores de elongação (pausa na tradução)

40 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER A PRS reconhece a seqüência sinal quando esta emana do ribossomo e induz uma pausa na tradução

41 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER O receptor da PRS na membrana do RE reconhece a mesma e promove a adesão do complexo à membrana

42 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Proteína atravessa a membrana por meio de um poro aquoso (dinâmico)

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44 Translocação de uma proteína Ribossomo omitido na figura!! solúvel Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

45 Translocação de uma proteína trasmembrana (com uma passagem) A sequência determina quando a translocação para Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

46 A orientação da proteína é determinada pela seqüência de aa nas proximidades da seqüência sinal Os lipídeos negativamente carregados da face citosólica da membrana tendem a reter o a porção mais positivamente carregada do lado citosólico. A seqüência sinal interna não é clivada pela pep4dase Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

47 Algumas proteínas apresentam multiplas passagens pela membrana As duas faces da membrana são portanto assimétricas. Essa assimetria é mantida na via secretoria!!! Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

48 Animação: translocação de proteínas no RE