Processamento de proteínas no RE e tráfego intracelular de vesículas. Profa. Ana Paula Biologia Molecular e Celular II

Transcrição

1 Processamento de proteínas no RE e tráfego intracelular de vesículas Profa. Ana Paula Biologia Molecular e Celular II IFSC, 2015

2 Retículo Endoplasmático Muitas proteínas transportadas enovelam-se e são montadas no lúmen do RE; Muitas estão em rota para outros destinos; Outras são residentes Proteínas importantes residentes no RE: PDI: catalisa oxidação de grupos SH livres para formar S-S Chaperona BiP: transporte pós-traducional de prot. p/ RE.

3 Modificações nas proteínas e controle de qualidade no RE As proteínas que passam pelo RE podem sofrer 4 modificações principais antes de alcançarem seu destino final: 1. Adição e processamento de carboidratos no RE (Nglicosilação); 2. Formação de ligações dissulfeto no RE; 3. Dobramento apropriado e montagem de subunidades no RE; 4. Clivagens proteolíticas específicas no RE, Golgi e vesículas secretoras.

4 A maioria das proteínas sintetizadas no RE rugoso é glicosilada. Oligossacarídeo precussor N-ligado

5 Adição e processamento inicial dos oligossacarídeos N-ligados ao RE rugoso das células de vertebrados.

6 Os oligossacarídeos marcam o estado de enovelamento

7 Degradação de proteínas mal enoveladas no RE (ERAD = ER associated protein degradation) Review in: Protein dislocation from the ER. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes, Vol. 1808, March 2011, Pages Misfolded soluble proteins in the ER lumen are translocated back into the cytosol, where they are deglycosylated, ubiquitylated, and degraded in proteasomes. Misfolded membrane proteins follow a similar pathway. Misfolded proteins are exported through the same type of translocator that mediated their import; accessory proteins that are associated with the translocator allow it to operate in the export direction.

8 Ubiquitina

9 Controle de qualidade do enovelamento no RE Proteassomo degrada proteínas indesejadas no citosol. (A) ME de proteassomos (B) Imagem ampliada digitalmente (C) Esquema do funcionamento: as bolas vermelhas representam peptídeos de ubiquitina na proteína (verde).

10 Endereçamento de Proteínas 1. Transporte mediado : importação p/ o núcleo por poros nucleares: funcionam como portões seletivos. 2. Translocadores proteicos: realizam o transporte de proteínas através das membranas das organelas. 3. Transporte Vesicular: vesículas carregam proteínas a partir do RE.

11 Transporte vesicular: visão geral das vias secretora e endocítica de distribuição de proteínas Qual o caminho das proteínas a partir do RE? Como são carregadas?

12 O tráfego vesicular é organizado só a proteína a ser transportada deve estar na vesícula A fusão de membranas deve ocorrer só na membrana alvo Cada organela participante deve manter sua identidade (composição) distinta. Todos esses eventos de reconhecimento dependem de proteínas associadas com as membranas das vesículas de transporte

13 Brotamento de vesículas A maioria das vesículas que brotam das membranas têm uma capa protéica VESÍCULAS REVESTIDAS Depois de formada, a vesícula perde seu revestimento, permitindo sua interação com a membrana destino. Funções da capa: - dar forma à membrana no brotamento; - Concentrar proteínas numa região específica, ajudando na captura de moléculas p/ o transporte Ex. vesículas com capas de clatrina; COPs.

14 A estrutura de uma capa de clatrina (A) Micrografia eletrônica de trisquélions de clatrina sombreados por platina. (B) Um desenho esquemático do provável arranjo dos trisquélions na superfície citosólica da vesícula com capa de clatrina. (C) Reconstrução da estrutura tridimensional de uma capa de clatrina (36 trisquélions arranjados em 12 pentágonos e 6 hexágonos)

15 Micrografia eletrônica da estrutura de clatrina que envolve as vesículas transportadoras revestidas A clatrina em si não toma parte na captura das moléculas para o transporte. Isto é feito pelas proteínas adaptadoras (diferentes para cada membrana), as quais seguram" a capa de clatrina à membrana vesicular e ajudam na seleção das moléculas para o transporte; Vesículas revestidas de clatrina, vistas por ME Pequenas GTPases recrutadoras (Arf, Sars) de revestimento participam na montagem e desmontagem do revestimento As moléculas a serem transportadas têm sinais reconhecidos por receptores de carga, localizados na membrana

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17 Modelo proposto para recrutamento de clatrina e AP2 (proteína adaptadora 2 em azul) durante os primeiros 5 segundos da formação da vesícula. Fonte: The first five seconds in the life of a clathrin-coated pit. Cell August 3; 150(3): doi: /j.cell

18 A hidrólise de GTP pela dinamina é nessária para o desprendimento das vesículas de clatrina Broto de vesícula Dinamina (GTPase com domínio de ligação a PIP 2 ) Preparação de terminações nervosas que foram incubadas com GTP não hidrolisável, tratada com anticorpos anti-dinamina marcados com ouro e analisados por MET. Broto com longo pescoço que não pode se desprender uma vez que a hidrólise de GTP não ocorre.

19 Veja a animação:

20 Como a vesícula encontra seu destino? A vesícula é transportada ativamente ao longo do citoesqueleto; Marcadores de superfície identificam a origem da vesícula e o tipo de carga; Atingida a organela alvo a vesícula tem que reconhecer os marcadores e ancorar nela; A especificidade de ancoramento depende das - SNAREs Rabs Proteínas transmembrana que certificam a seleção e auxiliam no ancoramento. GTPases de direcionamento

21 Modelo de fusão mediado por SNAREs. v-snare em verde, t-snare em rosa. Adaptado de Cell 92 (6). O modelo postula que a fusão se dá pela interação das SNAREs forçando as membranas a um contato próximo. As SNAREs formam um extenso coiled-coil ancorado por regiões transmembranas de v- e t-snares. A interação deve induzir um estresse local na membrana, resultando na fusão.

22 Modelo para fixação e fusão das vesículas de transporte nas membranas alvo

23 A fusão da bicamada é proposta ocorrer em múltiplas etapas

24 Table 13-1Subcellular Locations of Some Rab Proteins PROTEIN ORGANELLE Rab1 ER and Golgi complex Rab2 cis Golgi network Rab3A synaptic vesicles, secretory granules Rab4 early endosomes Rab5A plasma membrane, clathrin-coated vesicles Rab5C early endosomes Rab6 medial and trans Golgi cisternae Rab7 late endosomes Rab8 secretory vesicles (basolateral) Rab9 late endosomes, trans Golgi network (Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition)

25 Rotas secretoras

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27 RE ou Golgi: o que determina se a proteína fica no RE ou segue a rota de exocitose? Só proteínas enoveladas saem do RE - aquelas parcialmente ou não enoveladas são retidas - complexos proteicos são montados antes de sair; - proteínas mal enoveladas são direcionadas para o citosol para degradação. Proteínas que devem funcionar no RE: muitas têm sinal de retenção no C-terminal. Se saírem, voltam... - Solúveis- KDEL: reconhecido por uma proteína receptora ligada à membrana do RE. - De membrana: KKXX Sinais de saída do Golgi : não são bem conhecidos

28 O Aparelho de Golgi A) Reconstrução tridimensional a partir de micrografia eletrônica do aparelho de Golgi de uma célula animal secretora. A face cis do Golgi e a mais próxima do ER. (B) Detalhe da zona de transição entre RE e Golgi de uma cél. animal. (C) Uma micrografia eletrônica do aparelho de Golgi da alga Chlamydomonas em seção transversal.

29 RE Processamento de oligossacarídeos nos compartimentos de Golgi Fonte: Alberts et al. 2010

30 Modelo de maturação das cisternas x transporte vesicular The Golgi Complex.FEBS Letters.Volume 583, Issue 23, 3 December 2009, Pages

31 Transporte a partir do trans-golgi LISOSSOMO Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

32 Rota endocítica Captura fluidos, moléculas grandes e pequenas. O material a ser ingerido é progressivamente capturado numa vesícula de membrana plasmática (endocítica) Pode ser mediada por receptor ou não; O ph ácido dos endossomos pode levar a dissociação do receptor da carga: a carga é entregue aos lisossomos e o receptor é reciclado. se houver a dissociação a carga seguirá outro destino.

33 Endocitose Endocitose mediada por receptor (ex. LDL = lipoproteína de baixa densidade)

34 O Transporte retrógrado

35 Transporte retrógrado da ricina, uma proteína inativadora de ribossomos, em células de mamíferos Hartley & Lord, 2004

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