Transporte Intracelular. Tráfego vesicular: ER e Complexo de Golgi

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1 Transporte Intracelular Tráfego vesicular: ER e Complexo de Golgi Prof. Dr. Luis Lamber0 Maio 2017

2 O sistema de endomembranas RE, Complexo de Golgi, endossomos, lisossomos e membrana plasmá6ca compõem a via biossinté6ca

3 Varias doenças estão relacionadas ao transporte no sistema de endomembranas I-cell Hipercolesterolemia Resistência a insulina Alzheimer Infecção HIV Fibrose Cística

4 Dois 6pos de proteínas são translocadas no RE Proteínas transmembrana Parcialmente translocadas, ficando embebidas na membrana do RE. Destino final é a membrana plasmática ou a membrana de uma organela da via. Proteínas hidro-solúveis Completamente translocadas, sendo despejadas no lúmen do RE. Podem ser secretadas ou mantidas no lúmen de uma organela da via.

5 Principais fatores no processo de translocação de proteínas no RE Seqüência (ou peptídeo) sinal presente na proteína sendo traduzida Partícula de Reconhecimento de Sinal (PRS ou SRP) Interage com a seqüência sinal assim que a mesma é traduzida e escolta o ribossomo (+ RNAm) à membrana do RE Receptor da PRS Proteína integral da membrana do RE, reconhece a PRS e facilita a entrada da cadeia polipeptídica nascente no canal de translocação Canal de translocação Complexo transportador que permite a passagem da cadeia polipeptídica nascente através da membrana do RE

6 Uma Partícula de Reconhecimento de Sinal (PRS) é um complexo formado por seis subunidades de proteínas e uma molécula de RNA A PRS interage com a seqüência sinal nascente e posiciona-se na interface entre as subunidades do ribossomo dificultando o acesso de fatores de elongação (pausa na tradução)

7 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER A PRS reconhece a seqüência sinal quando esta emana do ribossomo e induz uma pausa na tradução

8 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER O receptor da PRS na membrana do RE reconhece a mesma e promove a adesão do complexo à membrana

9 A seqüência sinal e a PRS direcionam ribossomos e o polipeptídeo nascente à superfície do ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Proteína atravessa a membrana por meio de um poro aquoso (dinâmico)

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11 Translocação de uma proteína Ribossomo omitido na figura!! solúvel Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

12 Translocação de uma proteína trasmembrana (com uma passagem) A sequência determina quando a translocação para Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

13 A orientação da proteína é determinada pela seqüência de aa nas proximidades da seqüência sinal Os lipídeos negativamente carregados da face citosólica da membrana tendem a reter o a porção mais positivamente carregada do lado citosólico. A seqüência sinal interna não é clivada pela pep6dase Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

14 Algumas proteínas apresentam multiplas passagens pela membrana As duas faces da membrana são portanto assimétricas. Essa assimetria é mantida na via secretoria!!! Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

15 Animação: translocação de proteínas no RE

16 Dobramento e montagem de proteínas no lúmen do RE

17 Proteínas são modificadas quimicamente no RE Formação de Pontes Dissulfeto (dissulfeto isomerase) Cadeia lateral Figure 4-26 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

18 Proteínas são modificadas quimicamente no RE Formação de pontes dissulfeto Glicosilação de proteínas Formação de glicoproteínas

19 A glicosilação de proteínas é uma das principais funções biossintéticas do RE Adição de um oligossacarídeo (pré-formado) ao aminoácido asparagina no contexto: N-X-S ou N-X-T 14 resíduos de açúcar O Oligossacarideo é transferido ao grupo NH 2 da cadeia lateral do aa Asparagina N-ligado Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

20 Lipídeo Prende o oligossacarídeo precursor à membrana do RE (lúmen) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

21 Os oligossacarídeos em glicoproteínas podem ter diversas funções - Podem ser necessários para o enovelamento correto da proteína - Servir de sinal de endereçamento Ex.: enzimas digestivas (Lisossomos) - Conferir estabilidade Ex.: Fibronectina (componente da matriz extracelular) - Essencial para a funcionalidade da proteína Ex.: várias Glicoproteínas da superfície celular - Controle de Qualidade: etiquetas para marcar o estado do enovelamento de proteínas

22 O RE controla a qualidade de seus produtos Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

23 O RE controla a qualidade de seus produtos Remoção de 2 das 3 glicoses inicialmente ligadas pela Glicosidase I e pela Glicosidase II Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

24 O RE controla a qualidade de seus produtos Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25 O RE controla a qualidade de seus produtos Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

26 Proteínas enoveladas incorretamente, ou subunidades de proteínas multiméricas não montadas, são transportadas para o citosol para degradação Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Muitas das moléculas de proteína que entram no RE (mais de 80% em alguns casos) acabam não atingindo a conformação correta.

27 Proteínas enoveladas incorretamente, ou subunidades de proteínas multiméricas não montadas, são transportadas para o citosol para degradação Deslocação ou retrotranslocação deglicosilação e ubiquitilação Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Não é claro como o RE discerne entre intermediários de enovelamento e proteínas irremediavelmente malenoveladas

28 Quais os destinos seguintes de uma proteina após entrada no lúmen ou inserção na membrana do RE? Se reconhecida como permanentemente mal-dobrada : - Retrotranslocada para degradação no citosol Se reconhecida como dobrada e montada corretamente: - Permanecer na membrana ou no lúmen do RE (proteínas residentes) - Entrar em uma vesícula formada no RE com destino ao Complexo de Golgi

29 Fibrose cística Grave doença genética: formação de muco alta viscosidade vias aéreas e trato digestivo Causa: mutação no regulador transmembrana de fibrose cística CFTR CFTR é um canal de Cl - A mutação é na Fenilalanina 508 em até 90% dos casos. Tratamento: reverter sintomas (vida média 22 anos) Selvagem ΔF508 Porque dos sintomas? Porque a mutação F508 no CFTR é tão devastadora? Qual é a perspectiva de novas terapias? Células do Epitélio ciliado das vias aéreas. CFTR marcado em verde (retirado de Riordan, 2008)

30 O HIV utiliza a via de degradação associada ao RE e o proteassoma para eliminar moléculas de CD4 da célula hospedeira Magadán J G, Bonifacino J S J. Virol. 2012;86: Magadán et al., PLoS Pathog ;6(4):e

31 Resposta à proteínas desenoveladas (Unfolded Protein Response) Exemplo:

32 Visão Geral das Rotas de Transporte nas Vias Secretora ou Biosintética e Endocítica Transporte vesicular Proteínas não precisam cruzar membranas novamente para atingir as demais organelas da via ou serem secretadas Figure 13-3a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

33 O transporte entre organelas destas vias é mediado por vesículas Figure 13-3b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

34 Caracterização Inicial da Via Secretória George Palade (Prêmio Nobel 1974) Pulse (3 ) Chase (7 ) - Modelo: Células Pancreáticas Exócrinas - Estratégia: Microscopia Eletrônica + Pulse and Chase Chase (37 ) Chase (117 ) Principais Conclusões: - Proteínas Secretadas passam pelo Ap. de Golgi antes de serem secretadas - Proteínas Secretadas nunca se misturam às proteínas celulares no citosol (estão incorporadas em vesículas durante todo o trajeto). Jamielson and Palade (1966). PNAS

35 Fonte: Jennifer Lippincott-Schwartz Lab Célula expressando VSVG-GFP 1) Incubação 40 o C 2) Incubação 37 o C + droga para inibir a síntese proteica

36 - Quais as moléculas envolvidas na transferência de material entre os compartimentos? - Apesar da constante troca de material, como os compartimentos mantêm sua identidade?

37 Sec4 25oC Sec7 37oC Sec15 25oC Sec16 37oC Novick and Schekman (1979); Novick et al., (1980)

38 Vesículas brotam do compartimento doador contendo carga a ser transportada ao compartimento alvo. A topologia da membrana é conservada no processo!!! Figure 13-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

39 Como vesículas brotam da membrana doadora?

40 Brotamento: Vesículas brotam da membrana são cobertas por uma capa de proteínas Vesículas revestidas por Clatrina Funções da capa: - Ajuda a selecionar carga da vesícula - Deformar a membrana formando o broto

41 Existem pelo menos três tipos de capas vesiculares Micrografia eletrônica de vesículas revestidas por Clatrina, COPI e COPII Figure 13-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

42 Vesículas distintas operam em diferentes rotas de transporte Figure 13-5 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

43 Vesículas revestidas por clatrina são as melhores estudadas Trisquélion Cada molécula de clathrina consiste de 6 cadeias polipetidicas que juntas formam uma estrutura chamada trisquélion

44 Clatrina ajuda na deformação da membrana induzindo a formação de vesículas. Clatrina, deforma a membrana

45 Como vesículas selecionam carga apropriada? carga

46 Seleção de Carga Extracelular/ Lumenal Sinal (seq. consenso) Proteína carga Adaptador NPxY LDLR, LRP Dab1, Dab2... Citosol Sinal de direcionamento Adaptador CAPA

47 Seleção de carga Carga possui sinais específicos que são reconhecidos por receptores na membrana da organela doadora Proteínas adaptadoras (ex. Adaptinas) reconhecem sinais nos receptores transmembrana e recrutam clatrina do citosol.

48 Fissão e perda do reves0mento Dinamina é uma GTPase mutante de Dinamina

49 Como vesículas reconhecem sua membrana alvo?

50 Etapas envolvidas na fusão da vesícula na membrana alvo APRISIONAMENTO ANCORAMENTO Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

51 GTPases Rab direcionam vesículas aos compartimentos alvo

52 SNAREs auxiliam na fusão de vesículas com seu o alvo correto

53 A dissociação de pares de SNAREs pela ATPase NSF permite a reciclagem das SNAREs para novos ciclos de fusão

54 Transporte Vesicular: Visão Geral Bonifacino and Glick (2004). Cell

55 Transporte a partir do RE e através do aparelho de Golgi

56 Transporte a partir do RE e através do aparelho de Golgi

57 Capa COPII O recrutamento da capa vesicular à membrana doadora depende da ação de GTPases O desencapamento é necessário antes da fusão!!

58 O recrutamento de carga em vesículas de transporte do RE (COPII) - Transporte mediado por receptor - Transporte independente de receptor (default) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

59 O transporte anterógrado mediado por COPII é contrabalanceado pelo transporte retrógrado no sentido oposto mediado por COPI

60 O transporte anterógrado mediado por COPII é contrabalanceado pelo transporte retrógrado no sentido oposto mediado por COPI Reciclagem

61 Proteínas residentes no RE possuem sinais para retorno ao RE - Proteínas transmembrana possuem sinais na sua cauda citosólica que interagem com componentes da capa COPI Ex. seqüência KKXX Mas o que ocorre com as proteínas solúveis residentes no RE??? KDEL (Lys,Asp,Glu,Leu)

62 O próximo destino de proteínas que entram o ER é o Complexo de Golgi

63 O Aparelho de Golgi consiste de uma serie ordenada de compartimentos