Compartimentos intracelulares e transporte

Transcrição

1 Compartimentos intracelulares e transporte

2 Célula endotelial bovina corada: verde, membranas do RE; em laranja, mitocôndrias

3 Compartimentos envoltos por membranas nas células eucarióticas Núcleo RE Aparelho de Golgi Lisossomos Endossomos Peroxissomos Mitocôndrias Cloroplastos Circundado pelo envelope nuclear com poros; Síntese de DNA e RNA Sua membrana é contínua a membrana ext. nuclear. Sintetiza a maior parte de lipídeos e proteínas p/ distribuição Recebe e modifica proteínas e lipídeos vindos do RE e despacha para outros sítios na célula Pequenos sacos com enzimas digestivas. Degradam organelas esgotadas e materiais endocitados. Compartimento de distribuição de materiais endocitados Contém enzimas utilizadas em reações oxidativas que degradam lipídeos e destroem moléculas tóxicas. Sítio de fosforilação oxidativa. Síntese de ATP e fixação de CO 2 pela fotossíntese

4 Visão geral da principal via de distribuição de proteínas em células eucarióticas

5 Mecanismos de importação pelas organelas O destino de uma proteína sintetizada no citosol depende de sua seqüência de aminoácidos; Sinal de distribuição Se não há sinal: residem no citosol; Sinais diferentes podem direcionar p/: núcleo, mitocôndrias, cloroplastos, peroxissomos ou RE.

6 Como a proteína pode ser importada? 1. Transporte por poros nucleares: importação p/ o núcleo. Os poros funcionam como portões seletivos. 2. Translocadores protéicos: localizados na membrana, utilizados por proteínas importadas pelas organelas. 3. Vesículas de transporte: proteínas que se movem do RE adiante. Todos requerem energia!

7 Qual o compartimento destino? Seqüência sinal (15 a 60 aminoácidos) Sinal de distribuição típico. Freqüentemente é removido após a síntese As seqüências-sinal que especificam o mesmo destino podem variar. Propriedades físicas mais importantes que a seqüência exata.

8 Destino: núcleo Envelope nuclear: 2 membranas concêntricas. O envelope nuclear é perfurado por POROS NUCLEARES Formam canais para o trânsito de macromoléculas Entram: proteínas nucleares Saem: RNAm maduro (mrnps= complexo mrna+proteínas) e subunidades ribossomais, trnas Seqüência-sinal = 1 ou 2 seq. curtas contendo várias K ou R Sinal de localização nuclear

9 Micrografia eletrônica (criofratuta) de uma ponta de raiz de cebola mostrando o núcleo e os poros nucleares. Fonte:

10 Complexo poro nuclear (~120 milhões de Daltons; 100 diferentes proteínas em vertebrados) RE Membrana nuclear externa Espaço perinuclear Membrana nuclear interna Complexo poro nuclear Cesta nuclear Anel distal Fibrilas citoplasmáticas Anel citoplasmático Membrana ext. Domínio luminal Membrana int. Anel nuclear

11 Membrana nuclear externa Fibrilas citoplasmáticas Membrana nuclear interna cesta nuclear Fibrila nuclear Lâmina nuclear

12 Complexo poro nuclear Acima: microscopia-eletrônica de uma fina fatia do envelope nuclear (250 nm), não fixada e não corada revelando complexos poronucleares individuais. Abaixo: mudanças estruturais reversíveis mediadas por cálcio visualizados por AFM. O anel distal (seta) pode agir como um diafragma, abrindo após a adição de quantidades milimolares de cálcio e fechando após a remoção de cálcio.

13 Destino: núcleo A interação de uma proteína direcionada ao núcleo com o poro nuclear requer auxílio de Receptores de importação nuclear Ligam-se ao sinal de localização nuclear Ajudam a direcionar a proteína por interação com as fibrilas dos poros. A transferência utiliza energia da hidrólise do GTP

14 Proteína precurssora Importação de proteínas para o interior da matriz mitocondrial Hsc 70 citosólica Destino: mitocôndria e cloroplastos As proteínas se desdobram para entrar; possuem uma seq.-sinal, geralmente clivada após a translocação; O transporte a um sítio específico na organela requer outra seqüênciasinal; Seqüência de direcionamento p/ a matriz Receptor de importação citosol Espaço intermembrana Matriz mitocondrial proteína ativa Poro principal de importação Sítio de contato Protease de processamento da matriz Seqüência de direcionamento clivada

15 Setas identificam locais de contato entre a membrana externa e interna na mitocôndria

16 Fonte: Lodish et al., 2004.

17 Destino: Retículo Endoplasmático (RE) Porta de entrada p/ : Golgi, endossomos, lisossomos e secreção; Recebe 2 tipos de proteínas do citosol: Hidrossolúveis, que são completamente translocadas pela membrana do RE e liberadas no lúmen secreção. Transmembrânicas, que são parcialmente translocadas pela membrana do RE e tornam-se embebidas nela. As proteínas entram enquanto são sintetizadas...

18 A seqüência-sinal é guiada 1. Por uma partícula reconhecedora de sinal (PRS ou SRP) presente no citosol, liga-se à seqüência-sinal de RE exposta 2. Pelo receptor de SRP, embebido na membrana do RE. Há sítios moleculares de posicionamento conectando os ribossomos que estão sintetizando proteínas aos canais de translocação disponíveis.

19 Síntese de proteínas solúveis e seu transporte co-traducional através da membrana do RE (Partícula reconhecedora de sinal) Seqüência sinal citosol

20 Síntese de proteínas transmembranas na bicamada lipídica do RE Nem todas as proteínas que entram no RE são liberadas no lúmen... Algumas permanecem na membrana do RE (ou outras organelas) unipasso multipasso

21 Síntese e inserção na membrana do RE das proteínas unipasso do tipo I citosol Translocon aberto Peptidase sinal Lúmen do ER Seqüência sinal clivada Seqüência de finalização de transferência

22 Síntese e inserção na membrana do RE das proteínas unipasso do tipo II citosol Lúmen do ER Sequência sinalâncora interna

23 Arranjo das sequências topogênicas nas proteínas de membrana unipasso e multipasso inseridas na membrana do RE

24 Algumas proteínas são presas à membrana por uma âncora fosfolipídica Glicosilfosfatidilinositol (GPI)

25 Transporte vesicular: visão geral das vias secretora e endocítica de distribuição de proteínas Qual o caminho das proteínas a partir do RE? Como são carregadas?

26 O tráfego vesicular é organizado só a proteína a ser transportada deve estar na vesícula A fusão de membranas deve ocorrer só na membrana alvo; Cada organela participante deve manter sua identidade (composição) distinta. Todos esses eventos de reconhecimento dependem de proteínas associadas com as membranas das vesículas de transporte

27 Brotamento de vesículas Vesículas que brotam das membranas têm uma capa protéica VESÍCULAS REVESTIDAS Depois de formada, a vesícula perde seu revestimento, permitindo sua interação com a membrana destino Funções da capa: - dar forma à membrana no brotamento - ajudar na captura de moléculas p/ o transporte Ex. vesículas com capas de clatrina; COPIs.

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29 Micrografia eletrônica da estrutura de clatrina que envolve as vesículas transportadoras revestidas A clatrina em si não toma parte na captura das moléculas para o transporte. Isto é feito pelas adaptatinas, proteínas que seguram a capa de clatrina à membrana vesicular e ajudam na seleção das moléculas para o transporte; As moléculas a serem transportadas têm sinais reconhecidos por receptores de carga, localizados na membrana

30 vesícula dinamina

31 Como a vesícula encontra seu destino? A vesícula é transportada ativamente ao longo do citoesqueleto; Atingida a organela alvo a vesícula tem que reconhecêla e ancorar nela; A especificidade de ancoramento depende das SNAREs Proteínas transmembrana que certificam a seleção e auxiliam no ancoramento.

32 Modelo de fusão mediado por SNAREs. v-snare em verde, t- SNARE em rosa. Adaptado de Cell 92 (6). O modelo postula que a fusão se dá pela interação das SNAREs forçando as membranas a um contato próximo. As SNAREs formam um extenso coiled coil ancorado por regiões transmembranas de v- e t-snares. A interação deve induzir um estresse local na membrana, resultando na fusão.

33 Figura adaptada de: Littleton, J. T. et al. Synaptotagmin mutants reveal essential functions for the C2B domain in Ca2+-triggered fusion and recycling of synaptic vesicles in vivo. J. Neurosci. 21, (2001).

34 Rotas secretoras

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36 Modificações nas proteínas e controle de qualidade no RE As proteínas que passam pelo RE sofrem 4 modificações principais antes de alcançarem seu destino final: 1. Adição e processamento de carboidratos no RE e Golgi (S e T, O-ligados e N, N-ligados); 2. Formação de pontes dissulfeto no RE 3. Dobramento apropriado e montagem de subunidades no RE; 4. Clivagens proteolíticas específicas no RE, Golgi e vesículas secretoras.

37 Destino : Golgi

38 RE ou Golgi O que determina se a proteína fica no RE ou segue a rota de exocitose? Só proteínas enoveladas saem do RE aquelas não ou parcialmente enoveladas são retidas Proteínas mal enoveladas são direcionadas para o citosol para degradação proteassômica. Proteínas que devem funcionar no RE: têm sinal de retenção no RE, reconhecido por uma proteína receptora ligada à membrana do RE.

39 Rota endocítica Captura fluidos, moléculas grandes e pequenas. O material a ser ingerido é progressivamente capturado numa vesícula de membrana plasmática (endocítica) Pode ser mediada por receptor ou não; O ph ácido dos endossomos pode levar a dissociação do receptor da carga: a carga é entregue aos lisossomos e o receptor é reciclado. se houver a dissociação a carga seguirá outro destino.

40 Endocitose Endocitose mediada por receptor (ex. LDL = lipoproteína de baixa densidade)

41 Modelo de entrada para ricina