UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM ALGUMAS ESPÉCIES DE LORICARIIDAE (TELEOSTEI, SILURIFORMES) DA REGIÃO DE TRANSPOSIÇÃO DO RIO PIUMHI PARA O RIO SÃO FRANCISCO Ernani de Oliveira Mendes Neto SÃO CARLOS 2008

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3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM ALGUMAS ESPÉCIES DE LORICARIIDAE (TELEOSTEI, SILURIFORMES) DA REGIÃO DE TRANSPOSIÇÃO DO RIO PIUMHI PARA O RIO SÃO FRANCISCO Ernani de Oliveira Mendes Neto Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Evolução, área de concentração: Genética e Evolução. SÃO CARLOS 2008

4 Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar M538ec Mendes Neto, Ernani de Oliveira. Estudos citogenéticos em algumas espécies de Loricariidae (Teleostei, Siluriformes) da região de transposição do rio Piumhi para o rio São Francisco / Ernani de Oliveira Mendes Neto. -- São Carlos : UFSCar, f. Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, Citogenética de peixes. 2. Loricariidae. 3. Transposição de águas. 4. Fish - DNAr 18S. 5. Fish - DNAr 5S. I. Título. CDD: (20 a )

5 Orientador Prof. Dr. Orlando Moreira Filho

6 Dedico este trabalho aos meus pais Denise e Ernani

7 AGRADECIMENTOS Os meus agradecimentos vão para toda a estrutura institucional e humana que possibilitaram a realização deste trabalho. À Fundação de Amparo e à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa concedida (Proc.: 06/ ), a qual foi muito útil durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio concedido durante toda a minha formação científica e durante a elaboração deste trabalho. Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Evolução, ao Laboratário de Citogenética de Peixes do Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos e ao Laboratório de Citogenética e Evolução da Universidade Estadual de Ponta Grossa pelo suporte e auxílio no desenvolvimento deste trabalho. Ao meu orientador, Prof. Dr. Orlando Moreira Filho, por ter acreditado em mim e me ter proporcionado a realização deste mestrado. Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari, por toda ajuda e ensinamento a mim concedida durante toda a minha formação científica. Ao amigo Marcelo pelo apoio e pelos momentos de descontração. Aos Profs. Drs. Mara Cristina de Almeida Matiello e Roberto Ferreira Artoni do Laboratório de Citogenética e Evolução da UEPG, por terem acreditado em mim e me dado a oportunidade de ingressar no meio científico. Aos meus pais Denise e Ernani que mesmo com alguma dificuldade me possibilitaram realizar meus estudos. Aos meus irmãos Erenise, Edelize, Rodrigo e Giovanna.

8 Aos meus melhores amigos Camila Gadens, Camila Sanches e Fabiano pelos momentos de descontração e principalmente por me agüentarem nos momentos mais estressantes. Aos amigos Camila e Cleverson por toda ajuda e hospitalidade, sempre que eu precisava de um abrigo em Ponta Grossa. Aos amigos e colegas do Laboratório de Citogenética de Peixes da UFSCar: Daniel Blanco, Elisângela, Rosângela, Wellington, Daniel Magrão, Viviane, Karina, Marcelo, Celeste, Débora, Marceléia e Maressa. Aos amigos que fiz em São Carlos: Vagner, Tathianna, Simone, Tatiana, Andréa, Thaís e Eder. Aos amigos e colegas do Departamento de Genética e Evolução. Aos amigos do Laboratório de Citogenética e Evolução da UEPG. A todos aqueles que direta ou indiretamente me ajudaram neste trabalho, mas que me esqueci de nomear, meu muito obrigado.

9 Nós vamos morrer, e isso nos torna afortunados. A maioria das pessoas nunca vai morrer, porque nunca vai nascer. As pessoas potenciais que poderiam estar no meu lugar, mas que jamais verão a luz do dia, são mais numerosas que os grãos de areia da Arábia. Certamente esses fantasmas não nascidos incluem poetas maiores que Keats, cientistas maiores que Newton. Sabemos disso porque o conjunto das pessoas possíveis permitidas pelo nosso DNA excede em muito o conjunto das pessoas reais. Apesar dessas probabilidades assombrosas, somos você e eu, com toda nossa banalidade, que aqui estamos. Richard Dawkins

10 RESUMO A família Loricariidae é a segunda mais numerosa entre os peixes, com 716 espécies distribuídas entre 96 gêneros e seis subfamílias. Neste trabalho foram caracterizadas citogeneticamente, por meio de ferramentas convencionais e moleculares, cinco espécies desta família que ocorrem na região de cabeceira da bacia do rio São Francisco, município de Piumhi: quatro espécies do gênero Hypostomus (Hypostomus sp.1a, Hypostomus sp.1b, Hypostomus sp.2 e Hypostomus regani) e uma espécie do gênero Rineloricaria (Rineloricaria cf. latirostris). Hypostomus sp.1a e Hypostomus sp.1b foram consideradas pelo especialista como uma única espécie. Entretanto, os marcadores cromossômicos utilizados no presente trabalho mostraram-se concisos, podendo demonstrar que se trata de duas espécies distintas. A ocorrência de Hypostomus regani e Rineloricaria cf. latirostris para o rio São Francisco é relatada pela primeira vez. Os dados citogenéticos para estas duas espécies sugerem que elas são formas invasoras para o rio São Francisco, originadas da bacia do Alto Paraná. A citogenética molecular mostrou-se útil na identificação e diferenciação de espécies da família Loricariidae. Principalmente o cístron 5S demonstrou ser um conciso marcador espécie/específico. Este estudo demonstra claramente que as ferramentas citogenéticas foram muito eficientes na distinção de algumas espécies crípticas e/ou problemáticas sobre o ponto de vista taxonômico, bem como no rastreamento e no mapeamento de algumas espécies da família Loricariidae do rio Piumhi, consideradas invasoras para a bacia do rio São Francisco.

11 ABSTRACT The Loricariidae is the second largest family among fishes, with 716 species, distributed in 96 genera and 6 subfamilies. Five species of this family, four species of the Hypostomus genus (Hypostomus sp.1a, Hypostomus sp.1b, Hypostomus sp.2 e Hypostomus regani) and one specie of the Rineloricaria genus (Rineloricaria cf. latirostris), which are found in the headwaters of the São Francisco River, in Piumhi town, were cytogenetically characterized using conventional and molecular tools. One specialist considered Hypostomus sp.1a and Hypostomus sp.1b to be only one specie. However, the chromosomal markers used in this present work have been shown concise, so they could demonstrate that those two species are, in fact, distinct. The occurrence of Hypostomus regani and Rineloricaria cf. latirotris in the São Francisco River is reported for the first time. The cytogenetic data for these two species suggest that they are invasive forms for the São Francisco River, originated from the upper Paraná River basin. The molecular cytogenetic has been shown useful for the identification and differentiation of species of the Loricariidae family. Mainly, the cistron 5S ended up as a very concise specie/specific marker. This study clearly shows that the cytogenetic tolls were very efficient at distinguishing some cryptic and/or problematic species in the taxonomic point of view, so as at finding and mapping of some species of the Loricariidae family of the Piumhi River, considered invasive for the headwaters of the São Francisco River.

12 LISTA DE FIGURAS Figura 01 Bacia do rio São Francisco Figura 02 Em a): Rio Piumhi antes da construção da Represa da Usina Hidroelétrica de Furnas. O ribeirão da Água Limpa está indicado pelo número 1. Em b): Transposição das águas do rio Piumhi: (1) canal de transposição, (2), (3) lago artificial formado pela drenagem do baixo Piumhi após a construção do dique de Capitólio, (4) dique de Capitólio, (5) lago de furnas, (6) Represa de Furnas no rio Grande. (Fonte: MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005) Figura 03 Local de coleta dos espécimes analisados. Quadrado Azul = Hypostomus regani, Estrela Laranja = Rineloricaria cf. latirostris, Círculo Amarelo = Hypostomus sp.1a, Círculo Verde = Hypostomus sp.1b e Triângulo Vermelho = Hypostomus sp.2. (Fonte: MOREIRA- FILHO & BUCKUP, 2005 modificado por Wellington Adriano Moreira Peres) Figura 04 Cariótipo de Hypostomus regani corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata Figura 05 Cromossomos mitóticos de Hypostomus regani submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm Figura 06 Cariótipo de Hypostomus sp.1a. (a) coloração convencional; (b) bandamento C; (c) cromossomos portadores de Ag-RONs Figura 07 Hibridação fluorescente in situ evidenciando a localização de sítios de DNAr 18S (a) e 5S (b) em Hypostomus sp.1a. Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm Figura 08 Cariótipo de Hypostomus sp.1b corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata Figura 09 Cromossomos mitóticos de Hypostomus sp.1b submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm Figura 10 Cariótipo de Hypostomus sp.2. (a) coloração convencional; (b) bandamento C; (c) cromossomos portadores de Ag-RONs... 35

13 Figura 11 Hibridação fluorescente in situ evidenciando a localização de sítios de DNAr 18S (a) e 5S (b) em Hypostomus sp.2. Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm Figura 12 Cariótipo de Rineloricaria cf. latirostris corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata Figura 13 Cromossomos mitóticos de Rineloricaria cf. latirostris submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm... 39

14 SUMÁRIO 1) INTRODUÇÃO: ) Família Loricariidae: ) Estudos citogenéticos na família Loricariidae ) Endemismo em riachos: ) Bacia do rio São Francisco: ) Rio Piumhi ) Transposição do rio Piumhi ) OBJETIVOS ) MATERIAL E MÉTODOS ) Material e Locais de Coleta ) Metodologia ) Indução de Metáfases ) Obtenção dos Cromossomos Mitóticos ) Análise Cromossômica ) Detecção das Regiões Heterocromáticas ) Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) ) Hibridação Fluorescente in situ ) Análises Cariotípicas ) RESULTADOS ) Hypostomus regani ) Hypostomus sp.1a ) Hypostomus sp.1b ) Hypostomus sp ) Rineloricaria cf. latirostri...37

15 5) DISCUSSÃO ) Diversidade Cromossômica na família Loricariidae ) A Transposição do rio Piumhi e Espécies Invasoras ) CONCLUSÃO ) REFERÊNCIAS...66

16 1 1) INTRODUÇÃO: 1.1) Família Loricariidae: Os loricariídeos são comumente reconhecidos por possuírem o corpo recoberto por placas dérmicas (o que lhes confere o nome popular de cascudos ) e a boca em forma de ventosa localizada na região ventral. A família Loricariidae é a segunda mais numerosa entre os peixes, com 716 espécies, distribuídas entre 96 gêneros (FERRARIS, 2007). Estes peixes estão distribuídos por toda a região Neotropical, estendendo-se da Costa Rica à Argentina (REIS et al., 2003). Desde o reconhecimento de Loricariidae como uma família, sob o nome de Gonyodontes, por Spix e Agassiz em 1829 (GOSLINE, 1947), muitas formas de agrupamento das espécies foram propostas por ictiólogos. Em 2003 REIS et al. propuseram que a família Loricariidae seria composta por seis subfamílias: Ancistrinae, Hypoptopomatinae, Hypostominae, Lithogeneinae, Loricariinae e Neoplecostominae. ARMBRUSTER (2004), através da análise cladística de um número maior de características reordenou esta distribuição, propondo a criação de uma nova subfamília composta pelos gêneros Delturus e Upsilodus e a extinção das subfamílias Ancistrinae e Lithogeneinae. Nesta proposta os integrantes da subfamília Ancistrinae passariam para a subfamília Hypostominae na forma de tribo. Desta forma a sub-família Hypostominae passaria a ter cinco tribos: Ancistrini, Corymbophanini, Hypostomini, Pterygoplichthini e Rhinelipini. O único gênero representante de Lithogeneinae, Lithogenes, passaria à família Astroblepidae, juntamente com o gênero Astroblepus. Assim sendo, a família Loricariidae passaria a ser dividida em cinco subfamílias: Delturinae, Hypoptopomatinae, Hypostominae, Loricariinae e Neoplecostominae.

17 2 Entretanto, REIS et al. (2006) propuseram uma nova filogenia, similar à apresentada por ARMBRUSTER (2004), onde eles descrevem a subfamília Delturinae e alocam Ancistrinae como tribo de Hypostominae. No entanto, eles mantêm Lithogeneinae como subfamília de Loricariidae. Seguindo este último estudo cladístico realizado na família, têm-se seis subfamílias para Loricariidae: Loricariinae, Hypoptopomatinae, Hypostominae, Neoplecostominae, Lithogeneinae e Delturinae. 1.2) Estudos citogenéticos na família Loricariidae Embora Loricariidae seja uma família muito ampla, apenas 111 das 716 espécies pertencentes a ela foram estudadas citogeneticamente. A família Loricariidae possui grande variabilidade tanto no que se refere ao número diplóide, que pode variar de 2n=34 em Ancistrus sp. 1 e Ancistrus sp. 2 (OLIVEIRA, 2006) a 2n=96 em Upsilodus sp. (KAVALCO, et al., 2004), quanto à macroestrutura cariotípica, que podem apresentar fórmula cariotípica variando de cariótipos formados apenas de cromossomos meta e submetacêntricos, como no caso de Otocinclus affinis que possui 2n=54 e NF=108 (ANDREATA, et al., 1994) a cariótipos formados predominantemente por cromossomos subtelo e acrocêntricos, como no caso de Hypostomus strigaticeps que possui 2n=74 e NF=86 (MICHELE et al., 1977), entre outros. Os estudos citogenéticos já realizados na família Loricariidae não abrangem espécies de todas as seis subfamílias. Entre as subfamílias analisadas, a representatividade não é a mesma. Na subfamília Lithogeneinae, que possui apenas uma espécie descrita taxonomicamente ainda não foram realizados estudos nesta

18 3 área. A sub-família Hypostominae é sem dúvida a que apresenta o maior número de espécies estudadas pela citogenética, com 61 representantes. Nesta subfamília observa-se que o número modal varia de 2n=34 em Ancistrus sp. 1 e Ancistrus sp. 2 (OLIVEIRA, 2006) a 2n=80 em Hypostomus sp. E (ARTONI & BERTOLLO, 1996). A subfamília Loricariinae apresenta 21 espécies com estudos cromossômicos e apresenta uma variação no número cromossômico de 2n=36 em Rineloricaria latirostris (GIULIANO-CAETANO, 1998) a 2n=74 em Sturisoma cf. nigrirostrum (ARTONI & BERTOLLO, 2001). Análises cromossômicas em 15 espécies de Hypoptopomatinae demonstraram em 13 espécies (ANDREATA et al., 1992, 1993, 1994, 2006; CAMILO & MOREIRA-FILHO, 2005) o número cromossômico conservado de 2n=54, e apenas duas espécies com números diplóides divergentes. Em Hisonotus gibbosos evidenciou-se 2n=58 (ANDREATA et al., 2000) enquanto em Otocinclus aff. vestitus foi relatado 2n=72 (ANDREATA et al., 1994). Entre as seis subfamílias de Loricariidae, doze espécies foram estudadas de Neoplecostominae, (ALVES, 2000; ALVES et al., 2003, 2005; KAVALCO et al., 2004), mantendo o número cromossômico (2n= 54) conservado. Delturinae apresenta apenas uma espécie (Upsilodus sp.) estudada, a qual apresenta 2n=96 (KAVALCO et al., 2004). Sistemas de cromossomos sexuais têm sido relatados na família Loricariidae. Os sistemas de cromossomos sexuais encontrados vão desde os sistemas simples, como o XX/XO em Ancistrus n. sp. 1 (ALVES et al., 2003), o XX/XY em Hypostomus ancistroides e H. macrops (Michele et al., 1977), Pseudotocinclus tietensis (ANDREATA et al., 1992), Ancistrus cf. dubius (MARIOTTO & MIYAZAWA, 2006), Ancistrus sp.1, Ancistrus sp.2 e Ancistrus n.sp.5, (Oliveira, 2006) e o ZZ/ZW em

19 4 Microlepdogaster leucofrenatus (ANDREATA et al., 1993), Loricariichthys platymetopon (SCAVONE & JULIO JR., 1995), Hypostomus sp. G (ARTONI et al., 1998) e Ancistrus cf. dubius (MARIOTTO et al., 2004), Ancistrus ranunculus, Ancistrus sp. 6 e Hemiancistrus spilomma (Oliveira, 2006; Oliveira et al., 2007), até sistemas de cromossomos sexuais múltiplos, como o XX/XY 1 Y 2 em Harttia carvalhoi (CENTOFANTE et al., 2006) e Ancistrus sp. 8 (Oliveira, 2006) e Z 1 Z 1 Z 2 Z 2 /Z 1 Z 2 W 1 W 2.em Ancistrus sp. 3 (OLIVEIRA, 2006). Polimorfismos cromossômicos interpopulacionais também foram relatados em algumas espécies da família Loricariidae, como no caso de Ancistrus cf. dubius (MARIOTTO et al., 2004; MARIOTTO & MIYAZAWA, 2006) que apresenta entre as populações tanto em número cromossômico como aestrutura cariotípica divergente. Hypostomus ancistroides, apesar de manter o número cromossômico de 2n=68, demonstra fórmulas cromossômicas diferentes para cada uma das sete populações estudadas, sendo que uma delas evidencia sistema de cromossomos sexuais do tipo XX/XY (MICHELE, 1977; ARTONI & BERTOLLO, 1996; ALVES et al., 2006; RUBERT, 2007). Em duas populações de Hypostomus paulinus e as seis populações de Hypostomus strigaticeps (MICHELE, 1977; RUBERT, 2007) foram evidenciados números cromossômicos distintos. Já em duas populações de Neoplecostomus microps (ALVES et al., 2005; KAVALCO et al., 2005) evidenciaramse fórmulas cariotípicas divergentes. A mesma situação foi evidenciada em três populações de Hypostomus regani que apresentaram 2n=72 (ARTONI & BERTOLLO, 1996; ALVES et al., 2006; RUBERT, 2007). Em Liposarcus anisitsi o número diplóide de 2n=52 também se manteve conservado nas três populações estudadas (ALVES et al., 2006; ARTONI & BERTOLLO, 1999), mas a fórmula cariotípica variou.

20 5 Polimorfismos cromossômicos intrapopulacionais também foram relatados, como no caso descrito por GIULIANO-CAETANO (1998) para Rineloricaria latirostris, que apresentou variação no número cromossômico dentro de cada uma das quatro populações estudadas, além de ter evidenciado que alguns espécimens de uma das populações não apresentaram um número modal característicos. Outro tipo de polimorfismo cromossômico encontrado nesta família refere-se à presença de cromossomos supranumerários. Estes foram relatados apenas em Microlepdogaster leucofrenatus (ANDREATA et al., 1993), Loricaria prolixa, Loricaria sp. (SCAVONE & JULIO JR., 1994) e Rineloricaria pentamaculata (ERRERO- PORTO, 2007). Muitas espécies deste grupo de peixes têm sido estudadas citogeneticamente, entretanto, somente em poucas foram realizados estudos de citogenética molecular, através de hibridização fluorescente in situ, sendo que estes se referem à localização dos sítios de DNAr 18S e 5S. Um estudo realizado por KAVALCO et al. (2004, 2005), localizou os sítios de DNAr 5S e 18S em quatro espécies de Loricariidae, sendo elas: Neoplecostomus microps, pertencente à subfamília Neoplecostominae; Harttia loricariformis, pertencente à subfamília Loricariinae, Upsilodus sp., pertencente à subfamília Delturinae e Hypostomus affinis, pertencente à subfamília Hypostominae. As espécies analisadas apresentaram apenas um par cromossômico marcado com a sonda de DNAr 18S, o qual correspondeu com os sítios de Ag-RON, exceto H. affinis que apresentou cinco cromossomos marcados com a sonda de DNAr 18S e de dois a cinco sítios de Ag-RON. Os sítios de DNAr 5S variaram de dois a oito. Sua localização foi mais freqüente na região intersticial dos braços cromossômicos, sendo que apenas

21 6 Hypostomus affinis apresentou sítios localizados na região terminal. Harttia loricariformis apresentou sítios de DNAr 5S em sintenia com o sítio de DNAr 18S. CENTOFANTE et al. (2006), analisando uma população de Harttia carvalhoi, pertencente a subfamília Loricariinae, verificou que nesta espécie o sítio de DNAr 18S encontra-se em um único par cromossômico, coincidindo com a posição das RONs e que a espécie possui dois pequenos loci de DNAr 5S, sendo que um dos loci encontra-se em sintenia com o sítio de DNAr 18S. 1.3) Endemismo em riachos: Espécies endêmicas são aquelas restritas a uma região ou localidade específica. Uma vez que uma espécie recém formada ocupa uma área restrita, sua distribuição fica limitada por barreiras que circundam sua área de origem. O tamanho absoluto dos sistemas de rios tropicais de grande porte é um importante fator no processo evolutivo dos peixes, pois permite que muitas espécies de peixes se isolem geograficamente nas cabeceiras de seus tributários através de barreiras físicas, químicas ou bióticas (LOWE-MCCONNEL, 1969). As espécies de peixes descritas em riachos são, geralmente, de pequeno porte e apresentam caracteres redutivos (CASTRO, 1999). Estes peixes, de modo geral possuem uma capacidade de deslocamento relativamente baixa, não realizando migrações extensas durante suas vidas (CASTRO, op. cit.). Este fato deve facilitar em muito a ocorrência de eventos de vicariância, levando à multiplicação, por especiação alopátrica, de espécies de peixes de riacho caracterizadas por distribuição geográfica restrita (CASTRO, 1999). BUCKUP (1999) afirma que a identificação de áreas de endemismo

22 7 associadas à ocorrência de eventos de vicariância é um campo bastante promissor para estudos de diversidade e conservação, corroborando as recomendações de BÖHLKE et al. (1978) que enfatizaram a necessidade de se coletar e estudar peixes de áreas com endemismo acentuado, como cabeceiras de rios. De modo geral, a fauna de peixes de riachos é formada por um conjunto de espécies pouco conhecidas e ameaçadas pela ação antrópica, especialmente no sudeste do Brasil (MENEZES et al., 1990 apud BUCKUP, 1999). Nos últimos anos o número de publicações sobre a citogenética de peixes tem aumentado consideravelmente, mas referem-se, principalmente, a espécies que habitam calhas de rios ou ambientes lênticos. Trabalhos relativos a ambientes de cabeceiras de rios são raros, restringindo-se, geralmente, a levantamentos faunísticos, abordagens taxonômicas ou distribuição longitudinal de espécies (CARAMASCHI, 1986; LANGEANI-NETO, 1989; GARUTTI, 1998). 1.4) Bacia do rio São Francisco: A bacia hidrográfica do rio São Francisco (Figura 01), em seu sentido amplo, de recepção, transporte e deposição de toda a drenagem superficial e subterrânea, abrange uma área de ,2 km², o que equivale a cerca de 7,4% do território nacional, contida aproximadamente entre as coordenadas de Lat. S e Log. W Gr. Trata-se da terceira bacia hidrográfica do Brasil, e a primeira contida inteiramente em território brasileiro, segundo o mesmo critério. Considerando-se o trecho tradicional ou histórico, o rio São Francisco nasce no Chapadão dos Zagaias, nos altos orientais da Serra da Canastra e percorre km até a foz. Para o trecho geográfico, considerando-se suas nascentes verdadeiras nas nascentes do rio

23 8 Samburá, sua extensão passa a ser de km. O rio São Francisco abrange as regiões Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste, cortando os estados de Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia, Minas Gerais, Goiânia e o Distrito Federal (PAIVA, 1982, 1983, CETEC apud KOHLER, 2003; SILVA et al., 2003). Ao longo do seu curso, o São Francisco estende-se por superfícies de altitude variável (entre 400 e 1000m) sendo caracterizado como um típico rio de planalto, com algumas corredeiras, quedas e cascatas. A bacia é tradicionalmente dividida em três segmentos: superior, médio e inferior. O vale superior compreende da nascente até a corredeira de Pirapora, numa extensão de 630 km; o médio, com km, estende-se da corredeira de Pirapora até a cachoeira de Paulo Afonso (onde se encontra o complexo hidrelétrico de Paulo Afonso) e, finalmente, o trecho mais curto com 274 Km o baixo, que se estende de Paulo Afonso até a foz (PAIVA, 1982). O alto curso é caracterizado por águas rápidas, frias e oxigenadas; o médio por ser rio de planalto, com menor velocidade e sujeito a grandes cheias; o submédio está praticamente barrado e o baixo, por ser trecho de planície, é mais lento e encontra-se sob influência marinha (SATO & GODINHO, 1999). Excluídas as espécies diádromas (aquelas que migram entre o mar e a água doce), são registradas cerca de 158 espécies de peixes de diversas famílias, sendo muitas delas caracterizadas pelo endemismo (BRITSKI et al. 1988; SATO & GODINHO, 1999), mas novas espécies tem sido descritas com freqüência. PAIVA (1983) sugere que, com relação à distribuição de peixes pelo rio São Francisco, devem ser levadas em consideração algumas características: 1) o São Francisco é um rio perene e que cruza o Brasil de oeste para leste; 2) na região do vale superior, as águas são torrenciais, frias e com pouco material em suspensão; 3) no vale

24 9 médio, as águas possuem pequena velocidade, com temperaturas mais elevadas e com um pouco mais de material orgânico em suspensão; 4) no vale inferior, nas proximidades do estuário, as lagoas marginais são verdadeiros criadouros de peixes, com água sedimentada, rica em nutrientes. Grande parte da fauna de peixes do São Francisco concentra-se em seus afluentes permanentes e de água com pouco material em suspensão, sendo que são nas lagoas marginais que muitas espécies desovam, principalmente durante a piracema. A época predominante de reprodução tem início em outubro, antecedendo os meses mais chuvosos, com a chegada dos quais tem início a piracema (PAIVA, 1983).

25 Figura 01 Bacia do rio São Francisco. 10

26 11 1.5) Rio Piumhi A cabeceira do rio Piumhi está localizada entre os municípios de Vargem Bonita e Piumhi, no centro oeste do estado de Minas Gerais, Brasil a aproximadamente 930 metros de altitude (MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005). Segundo as folhas cartográficas de Vargem Bonita, rio Piumhi, Piumhi e Capitólio (escala 1:50.000), os principais afluentes do rio Piumhi, à margem direita, são córregos da Jorça, da Confusão e da Estiva, ribeirão dos Pavões, córregos dos Bois, da Onça, do Servo, Campão Grande, do Fumo, Mutuca, Penedo, ribeirão da Cachoeira e córregos Àgua Limpa, dos Soares e Araujo. Os afluentes da margem esquerda são córregos do Destêrro, das Almas, ribeirão dos Almeidas, córrego Capão da Olaria, ribeirão das Minhocas e os córregos Pari Velho e Engenho da Serra. Ressalta-se que até o inicio dos anos 60 os córregos da Onça, Mutuca, do Servo, Campão Grande, do Fumo e Capão da Olaria não desaguavam diretamente nas margens do rio Piumhi, mas sim no grande pantanal por onde percorria o rio Piumhi (Figura 02a) 1.6) Transposição do rio Piumhi Em julho de 1958 iniciou-se a construção da Usina Hidrelétrica de FURNAS, a qual está localizada no curso médio do rio Grande, no trecho denominado "Corredeiras das FURNAS", entre os municípios de São José da Barra e São João Batista da Glória, no estado de Minas Gerais. O reservatório, um dos maiores do Brasil, com altura máxima de 127m, km 2 e km de perímetro, banha 34 municípios de Minas Gerais e é alimentado pelos rios Grande e Sapucaí. Após o fechamento das comportas dessa hidrelétrica as águas da bacia do rio Grande escoariam até a bacia do rio São Francisco alagando o município de

27 12 Capitólio. Esse problema foi contornado pela construção de um dique (dique de Capitólio) nessa cidade. Entretanto, o dique represou também o rio Piumhi. Aproveitando a topografia da região do pantanal (por onde corria o leito do rio Piumhi, suas lagoas marginais e seus 22 afluentes) foi efetuado um sistema de drenagem, com a construção de aproximadamente 18 km de canais, alterando o curso do rio Piumhi, o qual foi desviado para o leito do córrego Água Limpa, que deságua no ribeirão Sujo, um dos afluentes da margem direita do rio São Francisco. Para efetuar o desvio, foi necessário alterar o leito do córrego Água Limpa, que foi totalmente dragado e alargado para receber todo o volume de águas vindas do rio Piumhi, de seus afluentes e da drenagem do pântano. O mesmo procedimento teve de ser feito em parte do leito do ribeirão Sujo (Figura 02b). Assim, a transposição do rio Piumhi, da bacia do rio Grande para a bacia do rio São Francisco, acarretou diversas alterações ambientais, tais como (a) a formação de um conjunto de lagos no antigo leito do rio Piumhi, na região do município de Capitólio, (b) a construção de canais, por onde corre atualmente o rio Piumhi, (c) a drenagem do pântano e, finalmente, (d) a alteração dos leitos dos córregos e ribeirões. Além dos impactos comumente associados à implantação das grandes represas, a construção de FURNAS trouxe outro problema ainda pouco conhecido, a transposição de fauna (MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005). Inevitavelmente, a transposição de águas colocou em contato peixes de distintas bacias hidrográficas, que estavam separados há milhões de anos. Assim, toda a ictiofauna do rio Piumhi (bacia rio Grande), que representava uma parcela da ictiofauna do sistema hídrico do Alto Paraná, foi transposta para a bacia do rio São Francisco.

28 13 Dentre todos os impactos ambientais ocasionados pela transposição do rio Piumhi para a bacia do rio São Francisco, a mistura das duas ictiofaunas, sem dúvida alguma, é o que mais chama a atenção dos ictiologistas. Entretanto, o contato dessas duas importantes bacias passou despercebido por mais de 40 anos pela comunidade científica (MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005).

29 Figura 02 Em a): Rio Piumhi antes da construção da Represa da Usina Hidroelétrica de Furnas. O ribeirão da Água Limpa está indicado pelo número 1. Em b): Transposição das águas do rio Piumhi: (1) canal de transposição, (2), (3) lago artificial formado pela drenagem do baixo Piumhi após a construção do dique de Capitólio, (4) dique de Capitólio, (5) lago de furnas, (6) Represa de Furnas no rio Grande. (Fonte: MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005) 14

30 15 2) OBJETIVOS a) Com o intuito de contribuir para a compreensão da evolução cariotípica da família Loricariidae, propôs-se neste trabalho caracterizar citogeneticamente, através das ferramentas convencionais e moleculares, algumas espécies desta família que ocorrem na região de cabeceira da bacia do rio São Francisco. b) Testar a citogenética como uma ferramenta na identificação de espécies invasoras na bacia do São Francisco devido à transposição do rio Piumhi para o rio São Francisco.

31 16 3) MATERIAL E MÉTODOS 3.1) Material e Locais de Coleta Foram analisados exemplares de quatro espécies de Loricariidae pertencentes a cinco populações distribuídas por riachos da cabeceira do rio São Francisco na região dos municípios de Piumhi e Pimenta MG (Figura 03). Foram analisados oito exemplares machos e oito exemplares fêmeas de Hypostomus regani coletados na foz do rio Piumhi no rio São Francisco (Figura 03), quatro exemplares machos, seis exemplares fêmeas e um exemplar de sexo não definido de Rineloricaria cf. latirostris coletados na foz do rio Piumhi no rio São Francisco (Figura 03), onze exemplares machos, quinze exemplares fêmeas e um exemplar cujo sexo não foi identificado de Hypostomus sp.1a coletados no ribeirão dos Patos (Figura 03), trinta e quatro exemplares machos e vinte e seis exemplares fêmeas de Hypostomus sp.1b coletados no ribeirão das Araras (Figura 03) e dezessete exemplares machos e dez exemplares fêmeas de Hypostomus sp.2 coletados no ribeirão das Araras (Figura 03). A Autorização de Coleta número foi concedida pelo IBAMA e a Licença de Pesca número 091/07 foi concedida pelo Instituto Estadual de Floresta de Minas Gerais.

32 Figura 03 Local de coleta dos espécimes analisados. Quadrado Azul = Hypostomus regani, Estrela Laranja = Rineloricaria cf. latirostris, Círculo Amarelo = Hypostomus sp.1a, Círculo Verde = Hypostomus sp.1b e Triângulo Vermelho = Hypostomus sp.2. (Fonte: MOREIRA-FILHO & BUCKUP, 2005 modificado por Wellington Adriano Moreira Peres) 17

33 18 3.2) Metodologia Os espécimens analisados foram coletados com tarrafas e transportados vivos para o Laboratório de Citogenética de Universidade Federal de São Carlos, onde foram mantidos em aquários até o processamento para obtenção das suspensões celulares e análise dos materiais ) Indução de Metáfases Para uma boa análise cromossômica, faz-se necessária a obtenção mais consistente de cromossomos metafásicos, tanto em qualidade como em quantidade. Uma vez que para a obtenção de cromossomos necessita-se de células em divisão, o primeiro passo em um estudo citogenético é observar locais (tecidos, órgãos) no organismo onde atividades de divisão celular estejam ocorrendo, quer seja de forma natural quer sobre determinados estímulos. Em peixes, o órgão utilizado para obtenção destas células é o rim que também possui função hematopoiética, ou seja, produzir células de defesa do organismo. Visando aumentar o índice mitótico nos animais a serem preparados foi utilizada a técnica descrita por LEE & ELDER (1980: 1. Injetar intraperitonialmente suspensão de levedura (0,5g de fermento biológico + 1,5g de dextrose + 6mL H 2 O) na proporção de 1mL/100g de peso animal. Transcorridas 48 horas processa-se o material para a preparação de cromossomos mitóticos.

34 ) Obtenção dos Cromossomos Mitóticos Os cromossomos mitóticos foram obtidos de células do rim dos animais, por meio da técnica de preparação cromossômica segundo FORESTI et al. (1993) com algumas adaptações. 1. Anestesiar o exemplar em solução de benzocaína 0,01% e sacrificar o animal em seguida; 2. Retirar uma porção do rim anterior, colocar em solução de Hanks, dissociar e incubar durante 25 minutos com 1-2 gotas de colchicina 0,025%; 3. Centrifugar a 900 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta pasteur e acrescentar 10mL de solução hipotônica de KCl 0,075mol/L; 4. Incubar a solução celular por 25 minutos em estufa a 37 C; 5. Adicionar seis gotas de fixador Carnoy I (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético glacial), homogeneizar o material e centrifugar por 10 minutos a 900 rpm; 6. Descartar o sobrenadante. Adicionar cerca de 10mL de fixador, re-suspender o material. Centrifugar por 10 minutos a 900 rpm; 7. Repetir o passo 6 por mais duas vezes; 8. Adicionar de 0,5 a 1mL de fixador, homogeneizar e acondicionar o material em frascos do tipo Ependorff. Nesta etapa o material pode ser armazenado em freezer a -20 C. Alternativamente, utilizou-se a técnica descrita por BERTOLLO et al. (1978): 1. Injetar intraperitonialmente colchicina 0,025% na proporção de 1mL para cada

35 20 100g do animal; 2. Após 30 minutos sacrificar o animal, retirar o rim e dissociar em solução hipotônica de KCl 0,075mol/L; 3. Incubar a solução celular por 25 minutos em estufa a 37 C; 4. Proceder a fixação conforme o protocolo anterior, a partir do passo ) Análise Cromossômica Foram colocadas de duas a três gotas da suspensão celular sobre uma lâmina de vidro coberta por uma lâmina d água a 50ºC. A lâmina foi corada com Giemsa 5% em tampão fosfato (ph= 6,8) por 10 minutos ) Detecção das Regiões Heterocromáticas A identificação das regiões de heterocromatina constitutiva foi feita através da técnica de obtenção de bandas C, descrita por SUMNER (1972), com algumas adaptações. 1. Tratar uma lâmina contendo a suspensão celular com HCl 0,2 N à temperatura ambiente durante 9 minutos; 2. Lavar a lâmina em água corrente e deixar secar ao ar. 3. Colocar a lâmina em solução aquosa de hidróxido de bário (Ba(OH) 2 8H 2 O) 5%, recém-preparada e filtrada, a 28 o C, durante 1 a 2 minutos; 4. Para interromper a ação da solução de hidróxido de bário, submergir rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2 N, lavar em água corrente e deixar secar ao ar.

36 21 5. Colocar a lâmina em solução salina 2xSSC a 60 o C durante 20 minutos; 6. Lavar a lâmina em água corrente e secar ao ar. 7. Corar com solução de Giemsa diluída a 2% em tampão fosfato (ph=6,8), durante 8 minutos ) Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) A identificação das Regiões Organizadoras de Nucléolo seguiu a técnica de impregnação pelo nitrato de prata descrita por HOWELL & BLACK (1980), com algumas adaptações. 1. Colocar sobre uma lâmina contendo as preparações cromossômicas 3 gotas de solução aquosa de gelatina a 2% (acrescida de ácido fórmico na proporção de 1 ml para cada 100 ml de solução); 2. Adicionar 6 gotas de solução aquosa de nitrato de prata a 50%. Misturar bem e cobrir com lamínula; 3. Incubar em estufa a 60 C o tempo necessário para que os cromossomos e núcleos assumam uma coloração amarelada e os nucléolos e as RONs uma coloração marrom escura ou preta. Este tempo varia de 2 a 3 minutos; 4. Retirar a lamínula com um jato de água destilada, lavar bem e deixar secar ao ar ) Hibridação Fluorescente in situ A localização dos sítios de rdna 18S e 5S nos cromossomos foram mapeadas usando hibridação fluorescente in situ (FISH) de acordo com PINKEL et al. (1986), com sondas obtidas de Prochilodus lineatus (Teleostei, Prochilodontidae)

37 22 obtidas por HATANAKA & GALETTI JR. (2004) e de Leporinus elongatus (Teleostei, Anostomidae) obtidas por MARTINS & GALETTI JR. (2001), respectivamente. Marcação da Sonda As sondas foram marcadas com biotina através da reação de Nick Translation com o kit Bionick TM Labeling System da Invitrogem, seguindo-se as instruções do fabricante. A solução de hibridação consistiu de 200µL de formamida (50% de formamida), 80µL de Sulfato de Dextrano a 50% (concentração final de 10%), 40µL de 20xSSC (concentração final 2xSSC) e 80µL de H 2 O q.s.p., à qual foram adicionados 1,5µg de sonda (DNA marcado com biotina). A solução de hibridação foi submetida a um banho fervente, por 10 minutos, e imediatamente transferida par um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. Preparação das Lâminas As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram lavadas em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente. Desidratadas em série alcoólica de etanol a 70%, 85% e 100%, 5 minutos cada banho. As lâminas foram tratadas em solução de RNAse (100µg/mL) por 1 hora em câmara úmida, a 37 C. Foram lavadas duas vezes em solução salina de 2XSSC por 10minutos cada e em solução PBS por 5 minutos. Seguiu-se fixação em formaldeído 1% / PBS 1x / MgCl 2 50mM por 10 minutos em temperatura ambiente. Lavagem em PBS 1x por 5 minutos e desidratação em

38 23 serie de etanol 70%, 85% e 100%, 5 minutos cada. As lâminas foram então tratadas em formamida 70%, diluída em 2xSSC a 70 C por 5 minutos e desidratas novamente em série alcoólica de etanol 70%, 85% e 100% por 5 minutos cada banho. Hibridação e Detecção dos Sinais Foram aplicados sobre as lâminas cerca de 50µL de solução de hibridação contendo solução de formamida 60% em 2xSSC ph 7,0. As lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37 C, overnight. As lâminas foram lavadas em solução de formamida 50% em 2xSSC ph 7,0 por 20 minutos a 42 C e, em seguida, lavadas em 0,1xSSC a 60 C por 15 minutos. Logo a seguir foram lavadas em Tween 20, por e minutos, seguido de incubação em tampão NFDM a 5% por 15 minutos. Para a detecção das ondas marcadas com biotina foram colocadas sobre as lâminas 90µL de avidina-fitc (Fluoresceina Isotil Cianato-avidina conjugada) a 0,25µg/µL, permanecendo por 30 minutos a 37 C, em câmara úmida. As Lâminas foram lavadas 3 vezes em Tween 20, cinco minutos cada. O sinal de hibridação foi intensificado colocando-se cerca de 90µL de anti-avidina biotina-conjugada sobre as lâminas, por 30 minutos, seguindo-se 3 lavagens com solução de Tween 20, 5 minutos cada. Este ciclo foi repetido por mais uma vez e complementado novamente pelo tratamento com avidina-fitc e posterior lavagem com Tween 20. Seguiu-se desidratação em série de etanol a 70%, 85% e 100% à temperatura ambiente, 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram então corados com DAPI + antifade (0,2 µg/ml).

39 ) Análises Cariotípicas As preparações cromossômicas convencionais foram analisadas em microscópio de campo claro, estabelecendo-se o número diplóide modal presente em cada espécie/população amostrada no presente trabalho. As melhores metáfases foram capturadas em um foto microscópio Olympus BX50, com a utilização do software CoolSNAP-pro, Image Pro Plus, 4,1 (Media Cybernetics). Os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), de acordo com o tamanho e razão de braços, segundo proposta de LEVAN et al. (1964). A montagem dos cariótipos foi feita de acordo com o tamanho e morfologia dos cromossomos, os quais foram dispostos em ordem decrescente e em pares, em cada grupo cromossômico. Os pares foram numerados e os cromossomos homólogos tentativamente emparelhados, para facilidade de apresentação e comparação. O Número Fundamental (NF) foi calculado levando-se em consideração que os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos apresentam dois braços e os cromossomos acrocêntricos apenas um.

40 25 4) RESULTADOS 4.1) Hypostomus regani Todos os exemplares de Hypostomus regani analisados apresentaram 2n=72 cromossomos, com fórmula cariotípica composta de 4 pares de cromossomos metacêntricos, 8 submetacêntricos, 10 subtelocêntricos e 14 acrocêntricos (8m+16sm+20st+28a) e Número Fundamental (NF) = 116 (Figura 04a). A heterocromatina constitutiva encontra-se distribuída em pequenos blocos (Figura 04b). A região intersticial dos braços longos dos pares cromossômicos 15, 18 e 20 (subtelocêntricos) e 23, 25, 26, 27 e 33 (acrocêntricos) apresentaram blocos bem evidentes. O par cromossômico metacêntrico 1 mostra uma marcação mais pálida na região intersticial do braço curto. Os pares cromossômicos 13, 15 e 36 apresentam blocos heterocromáticos na região centromérica e o par cromossômico 31 apresenta a região telomérica do braço longo heterocromática. As regiões organizadoras de nucléolo marcadas pelo Nitrato de Prata foram evidentes apenas no braço curto do par cromossômico submetacêntrico 8 (Figura 04c). Todas as células analisadas apresentaram heteromorfismo em relação ao tamanho das Ag- RONs. A hibridação fluorescente in situ confirmou a presença de DNAr 18S coincidente com as Ag-RONs, bem como o heteromorfismo de tamanho dos sítios (Figura 05a). Os sítios de DNAr 5s foram localizados em cinco pares cromossômicos, sendo localizados na região terminal do braço curto de três pares acrocêntricos e na região centromérica de dois pares submetacêntricos (Figura 05b).

41 Figura 04 Cariótipo de Hypostomus regani corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata. 26

42 Figura 05 Cromossomos mitóticos de Hypostomus regani submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm. 27

43 28 4.2) Hypostomus sp.1a Dos exemplares de Hypostomus sp.1a coletados no Ribeirão dos Patos apenas três machos e uma fêmea não deram resultados. Os demais espécimens apresentaram 2n= 76 cromossomos distribuídos em seis cromossomos metacêntricos, oito submetacêntricos, dezesseis subtelocêntricos e quarenta e seis acrocêntricos (6m+8sm+16st+46a) e NF= 106 (Figura 06a). A heterocromatina constitutiva localizou-se na região centromérica do par cromossômico 13 e do par acrocêntrico 16, no telômero dos pares cromossômicos acrocêntricos 24, 25 e 27 e na região intersticial do braço longo do par cromossômico acrocêntrico 31 (Figura 06b). A RON foi observada no telômero do braço longo do par cromossômico subtelocêntrico 13 (Figura 06c). As marcações encontradas com as sondas de DNAr 18S utilizadas na hibridação fluorescente in situ coincidiram com as marcações encontradas com Nitrato de Prata (Figura 07a). A hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 5S evidenciou dois pares cromossômicos marcados (Figura 07b). Um par de cromossomos acrocêntricos que apresentou a marcação na região centromérica e um par de cromossomos subtelocêntricos que também apresentou marcação na região centromérica.

44 Figura 06 Cariótipo de Hypostomus sp.1a. (a) coloração convencional; (b) bandamento C; (c) cromossomos portadores de Ag-RONs. 29

45 Figura 07 Hibridação fluorescente in situ evidenciando a localização de sítios de DNAr 18S (a) e 5S (b) em Hypostomus sp.1a. Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm. 30

46 31 4.3) Hypostomus sp.1b Dos 60 exemplares de Hypostomus sp.1b coletados no Ribeirão das Araras, 51 deram resultados. O cariótipo desta população é constituído por 76 cromossomos, com fórmula cariotípica 6m+8sm+16st+46a e NF=106 (Figura 08a). O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva foi de poucos blocos heterocromáticos pálidos. Estes localizados na região telocêntrica de alguns cromossomos acrocêntricos, na região intersticial do braço longo do par cromossomômico subtelocêntrico número 9. O braço curto dos cromossomos submetacêntricos 4 apresentou-se totalmente heterocromático (Figura 08b). Foi observada uma constrição secundária na região terminal do braço longo do par cromossômico metacêntrico número 2, coincidindo com as marcações com Nitrato de Prata (Figura 08). A hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S confirmou a localização do cístron ribossômico 18S na região telomérica do par cromossômico 2 (Figura 09a). A sonda de DNAr 5S apresentou 6 cromossomos marcados (Figura 09b). Estas marcações aparecem no centrômero de dois pares cromossômicos acrocêntricos e de um par cromossômico submetacêntrico.

47 Figura 08 Cariótipo de Hypostomus sp.1b corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata. 32

48 Figura 09 Cromossomos mitóticos de Hypostomus sp.1b submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm. 33

49 34 4.4) Hypostomus sp.2 Todos os espécimens da população de Hypostomus sp.2 do Ribeirão das Araras apresentaram 2n= 74 cromossomos, organizados em 10m+6sm+16st+42a e NF= 106 (Figura 10a). Não se observou diferença na constituição cromossômica entre machos e fêmeas. A heterocromatina constitutiva foi localizada na região centromérica dos cromossomos meta e submetacêntricos, e na região intersticial do braço longo de quase todos os cromossomos acrocêntricos. Os pares 23 e 30 apresentam blocos bem evidentes de heterocromatina (Figura 10b). Esta população apresentou a RON localizada na região telomérica do braço longo de um par de cromossomo submetacêntrico, sendo provavelmente o par 6 (Figura 10). O hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S mostrou 4 cromossomos com marcações na região telomérica (Figura 11a). A sonda de DNAr 5S revelou 6 marcações, sendo duas na região telomérica dos cromossomos e uma na região centromérica (Figura 11b).

50 Figura 10 Cariótipo de Hypostomus sp.2. (a) coloração convencional; (b) bandamento C; (c) cromossomos portadores de Ag-RONs. 35

51 Figura 11 Hibridação fluorescente in situ evidenciando a localização de sítios de DNAr 18S (a) e 5S (b) em Hypostomus sp.2. Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm. 36

52 37 4.5) Rineloricaria cf. latirostri Os espécimens de Rineloricaria cf. latirostris analisados apresentaram 2n=48 com fórmula cromossômica 14m/sm+34st/a e NF=62 (Figura 12a). O par cromossômico 6 apresentou uma constrição secundária em toda a extensão do braço curto. Dos onze espécimens examinados uma fêmea não apresentou resultados, nas análises comparativas entre os exemplares não foi observado polimorfismo cromossômico. A heterocromatina constitutiva encontra-se distribuída pela região centromérica de quase todos os cromossomos (Figura 12b). As RONs foram evidentes em apenas um par cromossômico, o número dez, coincidindo com a constrição secundária (Figura 12). A hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S mostrou duas grandes marcações no braço curto de um cromossomo acrocêntrico, coincidente com as marcações com Nitrato de Prata e com a constrição secundária (Figura 13a). As sondas de DNAr 5r mostrou dois pares cromossômicos acrocêntricos marcados na região centromérica (Figura 13b).

53 Figura 12 Cariótipo de Rineloricaria cf. latirostris corado com Giemsa em (a). (b) apresenta o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva evidenciada pelo bandamento C. A caixa (c) apresenta os cromossomos impregnados pelo Nitrato de Prata. 38

54 Figura 13 Cromossomos mitóticos de Rineloricaria cf. latirostris submetidos à hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S (a) e 5S (b). Setas= sítios evidenciados pela técnica. Barra= 10µm. 39

55 40 5) DISCUSSÃO 5.1) Diversidade Cromossômica na família Loricariidae Com 716 espécies e 96 gêneros a família Loricariidae é a segunda maior família entre os peixes, e provavelmente também uma das mais taxonomicamente complexa (ISBRÜCKER apud DE PINNA, 1998; FERRARIS, 2007). Sua morfologia altamente especializada faz dos loricariídeos um dos grupos de Siluriformes melhor caracterizados, reconhecidos como um táxon desde as primeiras classificações. As evidências para a monofilia dos Loricariidae são muito fortes, uma vez que este grupo possui muitas sinapomorfias morfológicas (DE PINNA, 1998). Entretanto, devido à complexidade da família, os taxonomistas encontram algumas dificuldades em agrupar as espécies em subfamílias. Os trabalhos mais recentes reconhecem seis subfamílias para este grupo (REIS et al., 2006), mas estudos posteriores podem reorganizar estas famílias, bem como excluir algumas ou descrever novas, como vem ocorrendo nos últimos anos (REIS et al., 2003; ARMBRUSTER, 2004). A família Loricariidae apresenta uma grande diversidade morfológica e muita divergência entre os taxonomistas, em relação a alguns grupos. Entretanto, algumas subfamílias são relativamente bem definidas. Uma revisão dos dados de citogenética disponíveis para as espécies da família Loricariidae foi realizada e resumida na Tabela 01. Através desta, é possível verificar que a alta diversidade encontrada em relação às características morfológicas também é encontrada em nível cromossômico, tanto no número diplóide como na estrutura cariotípica.