Título do Projeto de Pesquisa: Estudos citogenéticos em amostras da espécie Apteronotus bonapartii coletadas em rios da região amazônica

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA Relatório Técnico - Científico Período: 08/ /2015 ( ) Parcial (X) Final à IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO: Título do Projeto: Biogeografia e citogenômica de um grupo de peixes Neotropicais da região Amazônica utilizando mapeamento genômico comparativo por Pintura Cromossômica e DNA Barcoding. Nome do Orientador: Cleusa Yoshiko Nagamachi Titulação do Orientador: Pós-doutora Departamento: Genética Unidade: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Citogenética Título do Projeto de Pesquisa: Estudos citogenéticos em amostras da espécie Apteronotus bonapartii coletadas em rios da região amazônica Nome do Bolsista: Fabricio dos Anjos Santa Rosa Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/UFPA 1

2 01- INTRODUÇÃO 1.1- A Ordem dos Gymnnotiformes A ordem Gymnotiformes é um grupo de peixes neotropicais cuja distribuição é extremamente ampla nas Américas Central e do Sul, entretanto, possui sua maior diversidade na Bacia Amazônica. Tem como característica mais marcante a presença de órgãos elétricos e eletro receptores distribuídos pelo corpo, que proporcionam a estes animais a capacidade de gerar e detectar campos elétricos na água. Estes atributos diferenciados são utilizados para localizar objetos, possíveis predadores ou presas e demais organismos (eletrolocalização) e para estabelecimento de contato com indivíduos da mesma espécie (eletrocomunicação). Seguindo a filogenia proposta por Albert (2001) a Ordem é dividida em cinco famílias: Apteronotidae, Gymnotidae, Hipopomidae, Rhamphichthyidae e Sternopygidae. Possuem 31 gêneros e 176 espécies válidas atualmente, sendo desta forma uma Ordem extremamente diversa. Estimativas apontam que o número de espécies pode chegar a Citogenética de Gymnotiformes Os trabalhos relacionados à citogenética de Gymnotiformes estão restritos a poucas espécies, mas, com o passar dos anos os resultados obtidos com essa ordem vem crescendo de forma considerável, principalmente nos gêneros Gymnotus (Gymnotidae) e Eigenmannia (Sternopygidae), que são os mais estudados do grupo (MILHOMEM et al., 2008, 2012a,b; SILVA et al., 2009). O número diplóide (2n) na Ordem varia de 2n=22, 24 para Apteronotus albifrons (HINEGARDNER & ROSEN, 1972; ALMEIDA-TOLEDO et al., 1981) com descrição de cromossomos B (MENDES et al., 2012) a 2n=74 para Rhabdolichops sp. (BARROSO et al., 2013). A família Apteronotidae possui pouca informação citogenética na literatura, sendo que boa parte dos resultados presentes estão restritos à 2

3 espécie Apteronotus albifrons (2n=22 e 24) e mais recentemente ao trabalho de Silva et al. (2014) que descreveram o cariótipo de três espécie de Apteronotidae: Parapteronotus hasemani (2n=52), Sternarchogiton preto (2n=52) and Sternarchorhamphus muelleri (2n=32). Este projeto tem como finalidade desenvolver estudos citogenéticos em espécies da família Apteronotidae. No período deste relatório estudamos o cariótipo da espécie Apteronotus bonapartii. 02- JUSTIFICATIVA A citogenética de Gymnotiformes é de fundamental importância para auxiliar na catalogação de novas espécies, enriquecer dados filogenéticos além de deixar estes mais assertivos. A partir do reconhecimento destas novas espécies e da maior consistência dos dados, a Citogenética proporciona às outras ciências o suporte necessário para estudos posteriores. O presente trabalho tem como objetivo enriquecer a literatura científica com o estudo do cariótipo da espécie Apteronotus bonapartii, utilizando-se das técnicas da Citogenética Clássica e Molecular. Este estudo é extremamente importante pela relevância que este grupo possui no estudo da biodiversidade amazônica. 3- OBJETIVOS 3.1- Objetivo Geral O objetivo principal deste trabalho é acrescentar dados à literatura científica da espécie Apteronotus bonapartii a partir da realização de técnicas de Citogenética Clássica e Molecular Objetivos Específicos 1- Fazer um levantamento bibliográfico sobre o estudo em questão; 3

4 2- Aprender a fazer coletas de campo; 3- Extrair cromossomos de peixes; 4- Saber esterilizar materiais; 5- Fazer a diluição de soluções; 6- Fazer a coloração convencional; 7- Contar cromossomos no microscópio (marcação de pontos); 8- Fotografar as metáfases em microscópios ópticos e de fluorescência; 9- Montar e medir metáfases em Adobe Photoshop; 10- Fazer bandeamentos C e NOR; 11- Realizar a técnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) com diversas sondas; 12- Analisar comparativamente as metáfases; 13- Elaborar o relatório; 14- Apresentar os resultados parciais em eventos científicos. 04- MATERIAL E MÉTODOS 4.1- Amostra A coleta que proporcionou os espécimes que foram utilizados no desenvolvimento do trabalho foi feita no alto do Rio Solimões no estado do Amazonas. Ao todo foram utilizados dois indivíduos da espécie Apteronotus bonapartii, sendo ambos de sexo indeterminado Coletas Nas coletas, foi utilizado um detector de descarga elétrica, para a localização do animal, puçás de nylon para a captura deste e para melhor visualização do ambiente utilizou-se lanternas. As coletas eram realizadas pela parte da noite, já que as espécies da ordem tem hábitos noturnos, e nas margens de rios, onde estes são localizados com mais frequência. O transporte dos animais coletados foi feito em baldes com capacidade 4

5 para 20 litros, que tinham em sua estrutura bombas de oxigênio e água. Posteriormente os indivíduos coletados foram levados ao Laboratório de Citogenética da UFPA e devidamente armazenados em tanques ou aquários até o momento do processamento Técnica de Indução de Mitoses e Obtenção de Cromossomos Metafásicos A técnica de indução de mitoses por fermento, descrita por Bertollo (1986) foi utilizada para elevar o índice mitótico do animal. A extração foi feita de maneira direta, pela técnica, adaptada para peixes, elaborada por Bertollo et al (1978). O material biológico utilizado para extração foi o tecido renal. Para a preparação do material e posterior obtenção de metáfases foram utilizadas as seguintes etapas: Injetar dorso-lateralmente uma solução aquosa de fermento biológico (0,5g de fermento biológico Fleischmann, 0,5g de sacarose dissolvido em 7 ml de água destilada) na proporção de 1ml/100g de peso do animal; Deixar o animal por horas em um aquário bem iluminado e areado; Injetar dorso-lateralmente uma solução de colchicina a 0, 025% na proporção de 1ml/100g de peso do animal; Manter o peixe em aquário areado por 30 minutos e em seguida sacrificá-lo e retirar o rim; Colocar o rim em uma placa de Petri contendo 5 ml de solução hipotônica de cloreto de potássio (5,9g de cloreto de potássio para 1 litro de água destilada); Dissociar bem o material com a ajuda de um macerador; Levar a suspensão obtida para estufa a 37 C por 30 minutos; Após esse tempo, adicionar 4 gotas de fixador Carnoy 3:1 (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético); 5

6 Ressuspender cuidadosamente o material com o auxílio de uma pipeta Pasteur e em seguida transferi-lo para um tubo de centrífuga; Centrifugar por 10 minutos a 900 rpm, descartar o sobrenadante e adicionar, com cuidado, 5 ml do fixador Carnoy; Ressuspender cuidadosamente o material e novamente centrifugá-lo; Descartar o sobrenadante e armazená-lo no freezer Preparação Citológica das Lâminas Para a maximização do desenvolvimento do trabalho se faz necessário a preparação citológica das lâminas, que consiste nas seguintes etapas: Com auxilio de uma pipeta Pasteur ressuspender o material a ser pingado nas lâminas; Com uma micropipeta, pinga-se 12 µl do material gelado sobre uma lâmina contendo uma película de água; Deixa-se o material sobre a lâmina secar em temperatura ambiente ou sobre uma chapa a 45ºC; As lâminas são armazenadas em caixas plásticas apropriadas e mantidas em temperatura ambiente até o momento de utilização Técnica de Coloração Convencional A análise convencional da lâmina foi feita a partir de uma substância que age como corante, a Eosina Azul de Metileno, segundo descrito por Giemsa (Merck). Para este procedimento 0,4 ml de corante foi diluído em 3 ml de tampão fosfato ph 6,8 (solução final a 10%, quantidade estabelecida para cada lâmina); a solução foi despejada sobre a lâmina, deixando-a corar por 10 minutos; posteriormente a lâmina foi lavada com água destilada e secada em temperatura ambiente. o Preparação das Soluções: Tampão Fosfato ph 6,8; 6

7 Ø Solução A: dissolver 8,1658 g de Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4) em água deionizada até o volume de 1L, ph 5,6; Ø Solução B: dissolver 10,6794 g de Fosfato de Sódio Bihidratado (Na2HPO4.2H2O) em água deionizada até o volume de 1L, ph 9,8; Ø Solução de uso: misturar volumes iguais de cada solução, ajustando o ph 6,8 com as próprias soluções A e B Técnica de Detecção de NOR pelo Nitrato de Prata (Ag-NOR) A marcação das regiões organizadoras de Nucléolo (NOR) foi realizada utilizando-se da impregnação por Nitrato de Prata (AgNO 3 ), descrita por HOWELL & BLACK (1980), com modificações. A lâmina que foi utilizada para esta técnica primeiramente foi introduzida em uma solução de HCl 0,2 por 10 minutos, posteriormente sendo deixada para secar em temperatura ambiente. Após o período de secagem, utilizando-se de pipetas Pasteur, a lâmina foi tratada com uma gota de solução de gelatina e duas gotas de solução de Nitrato de Prata; em seguida, uma lamínula de vidro foi introduzida em cima da lâmina, fazendo com que as soluções abrangessem maior área. Esse procedimento completa-se com a introdução da lâmina em uma câmara escura úmida (Placa de Petri revestida com papel laminado, contendo suporte para a lâmina e algodão úmido) em banho Maria a 60ºC pelo período de 5 minutos. Após o término deste período na câmara escura, a lâmina foi retirada e imediatamente lavada com água destilada, fazendo com que a lamínula fosse descartada e o excesso de reagentes, expulso. A necessidade do acréscimo de corante, para melhor visualização do material, foi satisfeita com a utilização de Giemsa, diluído em tampão fosfato ph 6,8 na proporção 1:12 por 15 segundos. Após este período de tempo, a lâmina foi colocada para secar em temperatura ambiente. o Preparação das Soluções: Solução de Gelatina 2%: 7

8 Ø Dissolver 0,1 g de Gelatina em pó, incolor e insípida, em 4 ml de água deionizada a 60ºC. Após o resfriamento da solução, acrescenta-se 10 ul de Ácido Fórmico. Solução de Nitrato de Prata (AgNO3) 50%: Ø Dissolver 1 g de AgNO 3 em 2 ml de água deionizada, mantendo em um frasco escuro Técnica de Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) Ø Lavar uma lâmina citologicamente preparada em solução de pepsina (50 ml de HCl 4,8 N para 0,5 ml de pepsina) por 5 minutos; Ø Lavar a lâmina em 2 x SSC por 3 vezes, 2 minuto em cada; Ø Desidratar os cromossomos em uma bateria de álcool (2x70% por 2 minutos, 2x90% por 2 minutos cada e 1x100% por 15 minutos); Ø Deixar a lâmina em estufa a 65 C por 1 hora; Ø Incubar a lâmina por 40 segundos em formamida a 65 0C; Ø Colocar a lâmina em etanol 70% gelado por 5 minutos; Ø Desidratar novamente os cromossomos em uma bateria de álcool (1x70% por 2 minutos, 2x90% por 2 minutos cada e 1x100% por 4 minutos); Ø Diluir a sonda (telomérica) em tampão de hibridização (2 µl de sonda marcada com biotina para 10 µl de tampão); Ø Desnaturar a sonda a 65º C por 15 minutos; Ø Pingar 12 µl de solução contendo a sonda na lâmina, cobrir Ø para 100 µl de Tween) a 40º C por 2 minutos; com lamínula e deixar hibridizar durante 48 horas em câmera úmida na estufa 37º C; Ø Após as 48h, retirar a lamínula e colocar a lâmina em formamida 50% a 40ºC por 4 minutos; Ø Incubar em 2XSSC por 2 minutos a 40ºC Colocar a lâmina em detergente 4XSSC Tween (200 ml de 4 x SSC Ø Com a lâmina seca, adicionar aproximadamente 100 µl de solução de detecção (100 µl de 4XSSC Tween acrescido de 0,4 µl de 8

9 avidina-cy3 ou antidigoxigenina FITC) e incubar em câmera úmida na estufa de 37ºC por 30 minutos; Ø Colocar a lâmina três vezes em 4 x SSC Tween a temperatura ambiente, por 2 minutos cada; Ø Colocar 12 µl de Antifade com DAPI Vectashield H-1000 (Vector) e cobrir com uma lamínula de vidro 24 x 50 mm. 05- RESULTADOS Os exemplares analisados apresentam 2n=52 cromossomos, sendo em sua maioria submetacêntricos, possuindo NF=94. O Bandeamento C evidenciou marcação na região pericentromérica de todos os cromossomos, sendo que o par 2, submetacêntrico, apresenta um bloco heterocromático em todo o braço curto. As Regiões Organizadoras de Nucléolo estiveram presentes em dois cromossomos submetacêntricos. A FISH com sonda de rdna 5S evidenciou marcação em dois cromossomos submetacêntricos (par 7) e a FISH com sonda de rdna 18S evidenciou marcação em dois cromossomos submetacêntricos (par 3). A FISH com sonda telomérica evidenciou marcação nas regiões distais de todos os cromossomos. 9

10 FIGURA 2: Cariótipo representativo da espécie Apteronotus bonapartii com Bandeamento C. FIGURA 3: FISH (Hibridização in situ fluorescente) com sonda de rdna 5S marcada com CY3 que emite cor vermelha. 10

11 FIGURA 4: FISH (Hibridização in situ fluorescente) com sonda de rdna 18S marcada com CY3 que emite cor vermelha. FIGURA 5: FISH (Hibridização in situ por fluorescência) com sonda Telomérica marcada com FITC que emite cor verde. 11

12 06- DISCUSSÃO O cariótipo da espécie Apteronotus bonapartii é considerado simétrico pelo fato de apresentar grande similaridade morfológica entre seus cromossomos, não havendo desta forma grande diferença de tamanho entre a maioria dos cromossomos da espécie (GUERRA, 1988). A Heterocromatina é considerada um importante marcador em diversos grupos de peixes neotropicais (PAZIAN, 2008). A marcação na região pericentromérica dos cromossomos, que foi encontrada no cariótipo dessa espécie, é recorrente em todos os grandes grupos de organismos. A partir da utilização da técnica Ag-NOR para a marcação das regiões organizadoras do nucléolo observou-se um par heteromórfico (diferença de tamanho evidente entre as marcações) apresentando marcação. A aplicação da técnica de coloração por nitrato de prata permite evidenciar as Ag-NORs, mas apresenta a limitação de que a prata não se liga às regiões de rdna mas sim às proteínas associadas a estrutura nucleolar, limitando-se a identificar apenas as Ag-NORs que estavam ativas na interfase anterior (PAZIAN, 2008). A FISH com sonda de rdna 18S evidenciou marcação simples em dois cromossomos, com a mesma diferença de tamanho identificada na Ag-NOR, confirmando que não há presença de NOR múltipla no cariótipo dessa espécie. O heteromorfismo de NORs nos cariótipos de peixes é um evento comum, tendo sido descrito em Gymnotiformes da família Sternopygidae (SILVA et al., 2009), Gymnotidae (SCACCHETTI, 2009; FONTELES et al., 2008), Rhamphichthyidae (DA SILVA et al., 2013) e Hypopomidae (CARDOSO et al., 2011). O heteromorfismo pode ser explicado, por crossing-over desigual. A FISH com sonda de rdna 5S evidenciou marcação única em apenas um par de cromossomos, diferentemente do observado em um estudo anterior realizado no mesmo gênero na espécie Apteronotus albifrons onde se observou duas marcações no mesmo par cromossômico, uma no braço curto e outra no braço longo. A FISH com sonda telomérica evidenciou marcação nas regiões distais 12

13 de todos os cromossomos, não sendo observada nenhuma sequência telomérica intersticial (ITS). 07- PUBLICAÇÕES Os resultados obtidos até o momento foram apresentados na 4º Reunião Brasileira de Citogenética, realizada na cidade de Atibaia (São Paulo) no período entre 26 e 29 de maio de CONCLUSÃO O presente trabalho descreve pela primeira vez o cariótipo da espécie Apteronotus bonapartii (2n=52; NF=94). O cariótipo desta espécie é bem diferente do cariótipo de Apteronotus albifrons, uma espécie deste gênero que apresenta cariótipo descrito na literatura, que apresenta o menor 2n descrito para Gymnotiformes (2n=22 e 24; NF=40). Estes resultados demonstram a grande diversidade cromossômica entre as espécies deste gênero de peixes elétricos. Maiores estudos são necessários para melhor compreender a diversidade cromossômica deste grupo de peixes elétricos, cujas informações 13

14 cariotípicas são bastante escassas, e assim, entender a evolução cromossômica do grupo. 09- ATIVIDADES PARA OS PRÓXIMOS MESES Para o próximo período, pretende-se ampliar os estudos nesta espécie utilizando novos marcadores moleculares para a FISH, assim como, estudar novas espécies deste gênero e/ou da família Apteronotidae, dependendo da espécie que conseguirmos coletar em rios da bacia Amazônica. 10- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Albert JS (2001). Species diversity and phylogenetic systematics of American knifefishes (Gymnotiformes, Teleostei). Division of Ichthyology, Museum of Zoology, University of Michigan. Almeida-Toledo LF, Foresti F & Toledo S (1981). Constitutive heterochromatin and nucleolus organizer region in the knifefish, Apteronotus albifrons (Pisces, Apteronotidae). Experientia, 37(9): Artoni RF, Vicari MR & Bertollo LAC (2000). Citogenética de peixes neotropicais: métodos, resultados e perspectivas. Biological and Health Sciences 6: Guerra M. (1988). Introdução à Citogenética Geral. Rio de Janeiro: Ed. Guanabara, p Bertollo LAC (1986). Estimulação de mitoses em peixes. I Simpósio de Citogenética Evolutiva e Aplicada de Peixes Neotropicais. V.1 p.30. Cardoso AL, Pieczarka JC, Feldberg E, Milhomem SSR, Moreira-Almeida T, Silva DS, Silva PC & Nagamachi CY (2011). Chromosomal characterization of two species of genus Steatogenys (Gymnotiformes: Rhamphichthyoidea: Steatogenini) from the Amazon basin: sex chromosomes and correlations with Gymnotiformes phylogeny. Reviews in Fish Biology and Fisheries 21(3): Fonteles S, Lopes CE, Akama A, Fernandes F, Porto-Foresti F, Senhorini JA, Daniel-Silva MFZ, Foresti F & Almeida-Toledo LFD (2008). Cytogenetic characterization of the strongly electric Amazonian eel, Electrophorus electricus (Teleostei, Gymnotiformes), from the Brazilian rivers Amazon and 14

15 Araguaia. Genetics and Molecular Biology 31(1): Hinegardner R & Rosen DE (1972). Cellular DNA content and the evolution of teleostean fishes.the American Naturalist 106: doi: / Howell W & Black DA (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: Mendes VP, Portela-Castro ALB & Júlio-Júnior HF (2012). First record of supernumerary (B) chromosomes in electric fish (Gymnotiformes) and the karyotype structure of three species of the same order from the upper Paraná River basin. Comparative cytogenetics 6(1): 1. Milhomem SSR, Pieczarka JC, Crampton WG, Silva DS, De Souza AC, Carvalho JR, & Nagamachi CY (2008). Chromosomal evidence for a putative cryptic species in the Gymnotus carapo species-complex (Gymnotiformes, Gymnotidae). BMC genetics 9(1): 75. Milhomem SSR, Crampton WGR, Pieczarka JC, Shetka GH, Silva DS & Nagamachi CY (2012). Gymnotus capanema, a new species of electric knife fish (Gymnotiformes, Gymnotidae) from eastern Amazonia, with comments on an unusual karyotype. Journal of fish biology 80(4): Milhomem SSR, Crampton WGR, Pieczarka JC, Silva DS, Cardoso AL, Silva PC, Oliveira JA & Nagamachi CY (2012). Chromosomal and electric signal diversity in three sympatric electric knifefish species (Gymnotus, Gymnotidae) from the Central Amazon Floodplain. Reviews in Fish Biology and Fisheries 22(2): Oliveira C, Ameida-Toledo LF, Foresti F, Britski HA & Toledo-Filho AS (1988). Chromossome formulae of neotropical freswater fishes. Brazilian Journal of Genetics 11: Pazian, MF (2008) Citogenética de populações de Piabina argêntea (Teleostei, Characiformes, Characidae) das bacias dos rios Paranapanema e Tietê f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu. 15

16 Scacchetti, PC (2011) "Mapeamento físico de genes ribosomais 18S e 5S nos cromossomos de espécies simpáticas do gênero Gymnotus (Teleostei, Gymnotiformes, Gymnotidae): 78-f. Silva DS, Milhomem SSR, Pieczarka JC & Nagamachi CY (2009). Cytogenetic studies in Eigenmannia virescens (Sternopygidae, Gymnotiformes) and new inferences on the origin of sex chromosomes in the Eigenmannia genus. BMC genetics 10(1): 74. Silva FHR, Pieczarka JC, Cardoso AL, Silva PC, Oliveira JA & Nagamachi CY (2014). Chromosomal diversity in three species of electric fish (Apteronotidae, Gymnotiformes) from the Amazon Basin.Genetics and molecular biology 37(4): Silva PC, Nagamachi CY, Silva DS, Milhomem SSR, Cardoso AL, Oliveira JA & Pieczarka JC (2013). Karyotypic similarities between two species of Rhamphichthys (Rhamphichthyidae, Gymnotiformes) from the Amazon basin. Comparative cytogenetics 7(4): 279. PARECER DO ORIENTADOR: O Estudante mostra estar gostando do trabalha e demonstra interesse em desenvolver o projeto. O aluno já está conseguindo aprender as técnicas, tanto de coleta de amostras biológicas, quanto de obtenção de cromossomos metafásicos e técnicas de citogenética clássica e molecular, estando alcançando os primeiros resultados do projeto. Assim, considero que o aluno tem tido um bom desempenho, fazendo jus à bolsa recebida DATA : 10/09/2015 ASSINATURA DO ORIENTADOR 16