Caracterização citogenética de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez)

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1 Caracterização citogenética de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) Acadêmicos de Iniciação Científica: Thalline Rodrigues da Silva 1 - PVIC/UEG Camila Lariane Amaral- PVIC/UEG Colaboradores: Sandra Morelli (UFU) Joseliana Aparecida Vaz Fernades (UEG) Orientador: Robson José de Oliveira Júnior 2 UEG-Unidade Ipameri, Brasil. 1 thalliner@hotmail.com 2 robson_junr@yahoo.com.br Palavras-chave: Mangaba; Análise cromossômica 1 INTRODUÇÃO A diversidade vegetal brasileira abrange cerca de 60 mil espécies, incluindo entre elas 500 espécies de frutíferas nativas, na maioria pouco estudada (VALOIS, 1999). O Cerrado é considerado a savana de maior biodiversidade vegetal do mundo, com uma área de 204 milhões de hectares, distribuídos principalmente nos Estados de Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins, Bahia, Piauí, Maranhão e Distrito Federal (PEREIRA ET AL., 2001). Todavia, a expansão das áreas agricultáveis e o seu mau uso, com monoculturas, o desmatamento e o extrativismo predatório, estão destruindo o Cerrado. Para reverter o processo de degradação das terras, com a manutenção da produtividade e integridade ambiental, sugere-se a exploração econômica das fruteiras nativas, que têm grande potencial, por causa do aproveitamento alimentar, proteção ambiental e florestal, controle da erosão e a conservação de nascentes de rios e lagos, bem como proteção e conservação de espécies animais e vegetais em vias de extinção (MELO, 1999). 1

2 A mangabeira (Hancornia speciosa Gómez) surge como mais uma alternativa para a diversificação da produção de frutas bem como seus produtos, tendo a vantagem de ser uma espécie endêmica do Brasil (SOUSA ET AL., 2007). Pertence à família das apocináceas e possui porte arbustivo. É uma planta típica das restingas do litoral nordestino e dos cerrados do Centro-Oeste. No Cerrado, a mangabeira ocorre principalmente em encostas pedregosas. Devido ao excelente sabor e aroma, a mangaba é uma das mais populares frutas do Nordeste do Brasil, constituindo-se em uma das mais importantes matérias primas para a indústria de sucos e sorvetes desta região. A planta está entre as dez espécies selecionadas como de altíssima prioridade pelo programa Plantas do Futuro do CNPq/World Bank/GEF/MMA/Probio, com maior potencial de uso imediato entre as fruteiras nativas da região Nordeste (JUNQUEIRA ET AL., 1997; VIEIRA NETO, 2002; FERREIRA ET AL., 2005). A polpa da mangaba pode ser utilizada para a fabricação de sorvetes, sucos, compotas e doces, além do látex que produz borracha e apresenta propriedades medicinais, sendo empregado também na farmacologia caseira, como ajuda no tratamento de combate à tuberculose, como estimulante das funções hepáticas (uso interno) e no tratamento de úlceras rebeldes, dermatose e verrugas, no uso externo. Uma outra fonte de renda é a madeira, que pode ser utilizada na carpintaria (ALOUFA ET AL., 2003). A devastação das mangabeiras nativas tem sido agravante, principalmente na região Nordeste. Este fator coincide com a crescente demanda da fruta nas indústrias locais de polpas, sorvetes e sucos. No Nordeste, onde é explorada de forma extrativista, esta espécie vem sofrendo acelerado processo de erosão genética em razão da expansão imobiliária na baixada litorânea e da monocultura da cana-de-açúcar nos tabuleiros do litoral nordestino (PINHEIRO ET AL., 2001). Os recursos genéticos vegetais são o componente o componente da biodiversidade necessário ao desenvolvimento sustentável da agricultura e da agroindústria. Esses recursos são estratégicos para o Brasil e, para que esta riqueza seja corretamente preservada e utilizada, colaborando para o desenvolvimento 2

3 tecnológico e econômico, são necessários esforços para conhecê-las. Para tanto, a caracterização citogenética é uma das ferramentas disponíveis. Pode ser aplicada como ferramenta para a avaliação de plantas regeneradas in vitro e de plantas transformadas; em estudos de evolução e citotaxonomia. O uso mais imediato da citogenética é evitar anos de insucesso na condução de trabalhos de conservação, multiplicação e uso de germoplasmas, além de fornecer informações valiosas, de uso direto em programas de pré-melhoramento e melhoramento de plantas (PEÑALOZA, 2005). Segundo Guerra (1988), uma caracterização clara e precisa do cariótipo de uma espécie é de fundamental importância quando se quer comparar citogeneticamente espécies diferentes, ou examinar a variação entre indivíduos da mesma espécie. Desde o início do século XX, a citogenética vem sendo amplamente utilizada em trabalhos que envolvem caracterização taxonômica e estudos de evolução e filogenia (STUESSY, 1990). O destaque principal é a citotaxonomia clássica que se caracteriza pela observação do número e da morfologia dos cromossomos mitóticos e do seu comportamento na meiose (STEBBINS, 1971). Esses parâmetros têm se tornado um dos mais importantes instrumentos para a compreensão das relações de parentesco e dos mecanismos envolvidos na evolução cariotípica, tanto em níveis hierárquicos inferiores (espécies, gêneros) quanto superiores (famílias). Informações sobre cromossomos são relevantes em estudos sistemáticos e evolutivos, abrangendo, desde a simples contagem, até detalhes da citogenética molecular que são a fronteira da pesquisa atual (STACE, 2000). Historicamente, quando estudos citogenéticos de espécies arbóreas são comparados aos de espécies cultivadas e/ou nativas com valor agronômico, sua limitação é evidente, restringindo-se a informações básicas sobre sua estrutura genômica e a inclusão dessas espécies em programas de melhoramento e conservação. Dentre as espécies arbóreas, o grupo das gimnospermas é o mais estudado citogeneticamente, destacando-se estudos com coníferas e pináceas (SCHLARBAUM, 2000). 3

4 É extremamente importante a caracterização citogenética do germoplasma presente no bioma cerrado, uma vez que muitas das espécies nele presentes podem chegar à extinção sem nem mesmo ter sido conhecida pela humanidade. Assim, o presente trabalho teve como objetivo aplicar metodologias clássicas de citogenética para caracterizar os cromossomos de Hancornia speciosa Gómez. 2 MATERIAIS E MÉTODOS Foi analisada citogeneticamente,a especie Mangaba (Hancornia speciosa Gómez),uma frutífera nativas do Cerrado de Ipameri. As coletas dos frutos para a germinação e obtenção de meristemas radiculares foram feitas no município de Ipameri-GO. 2.1 Obtenção dos cromossomos mitóticos Para a obtenção do material para a análise cromossômica foram utilizados meristemas radiculares pré-tratados com PDB por vinte horas a 5 ºC. As amostras foram fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético 3:1, v/v) à temperatura ambiente por até 12 horas. Em seguida as raízes foram diretamente utilizadas no preparo de lâminas ou mantidas a -20ºC até o uso. Para a coloração convencional as raízes foram hidrolisadas em uma solução de HCl 5M por 20 minutos a temperatura ambiente, dissecadas em uma gota de ácido acético 45% e esmagadas com uma lamínula. As lamínulas foram retiradas após congelamento em nitrogênio líquido e as lâminas coradas em giemsa/tampão fosfato 2%. As contagens cromossômicas foram feitas em pelo menos 20 células por indivíduo da população. As lâminas foram observadas em microscópios ópticos, sendo que as células com boas condições para a contagem dos cromossomos foram fotografadas utilizando-se uma câmera digital. Foram calculados os índices CTC (Comprimento Total da Cromatina) que é a somatória dos comprimentos de todos os cromossomos 4

5 do complemento diplóide das duas espécies. Para a caracterização morfológica dos cromossomos foi utilizado o índice centromérico (HUZIWARA, 1962) e a nomenclatura de Levan et al. (1964), modificada por Guerra (1986). CTC = Σy (y = comprimento dos cromossomos) TF% = Σc x 100 / CTC (c = braço curto dos cromossomos) Ic = c x 100 / c+l (c = braço curto e l = braço longo) 2.2 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs) Técnica de impregnação por nitrato de Prata (HOWELL; BLACK, 1980). 1. Pingar sobre a lâmina, preparada conforme a técnica adotada para cromossomos mitóticos, 25μl de solução aquosa de gelatina a 2% (acrescida de ácido fórmico na proporção de 1ml para cada 100ml de solução); 2. Adicionar 50μl de solução aquosa de nitrato de Prata a 50% e 25μl de água deionizada. Misturar bem e cobrir com lamínula; 3. Incubar em estufa a 60 ºC, por um período de, aproximadamente, 5 minutos, dependendo de um monitoramento de coloração da lâmina e dos cromossomos ao microscópio; 4. Após o tempo apropriado, quando os cromossomos assumem uma tonalidade amarelada e as NORs e os nucléolos uma coloração preta ou marrom, lavar em água deionizada, possibilitando que a lamínula seja retirada naturalmente pela própria água. 2.3 Análises estatísticas As análises estatísticas referentes à distribuição cromossômica nas diferentes populações foram realizadas utilizando-se um intervalo de confiança para proporções pelo teste t-student a 0,05 de significância. Os gráficos e as análises 5

6 estatísticas serão realizados utilizando o programa Statview for Windows versão 4.57 (Abacus Concepts, Inc., Copyright ). Valores de p < 0,05 serão considerados estatisticamente significante. 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES Testes preliminares mostraram que o PDB foi o agente antimitótico mais efetivo para a espécie estudada no presente trabalho. A Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) é uma espécie que apresenta cromossomos muito pequenos e de difícil visualização e difícil obtenção de sementes (frutificam uma vez por ano) para a coleta dos meristemas radiculares. As análises cromossômicas em Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) revelaram um número cromossômico de 2n=20 (Figura 1). Apesar das pesquisas bibliográficas, não foi encontrada a descrição do número cromossômico de mangaba, nem mesmo no Index to Plant Chromosome Numbers (IPCN), que é uma página da internet onde são depositadas as informações sobre o número cromossômico especificamente de plantas. Desta maneira, o presente trabalho traz pela primeira vez a descrição do número cromossômico da espécie. 6

7 Figura 1 Metáfases de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) submetidas à coloração convencional com Giemsa. O índice CTC (Comprimento Total da Cromatina) obtido foi de 59,5 µm (± 2). Não foi possível fazer o cálculo do TF%, uma vez que a morfologia dos cromossomos obtidos não permite a detecção do centrômero e consequentemente não tem como diferenciar braço longo e braço curto. As medidas cromossômicas utilizadas no cálculo do CTC foram obtidas através do programa micro-measure 3.3, utilizando o padrão de condensação cromossômica da metáfase da figura 3. Quando coradas com nitrato de Prata, as células de mangaba apresentaram de um a dois nucléolos marcados (Figura 2), sugerindo que a espécie apresenta NOR simples. Apesar dos esforços, não foi possível obter um padrão de coloração cromossômica evidenciando os cromossomos portadores da NOR. O trabalho também é pioneiro na caracterização dos nucléolos de mangaba. 7

8 Figura 2 Células de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) coradas com nitrato de Prata. As regiões mais escuras apontadas pelas setas são os nucléolos. Para a detecção da heterocromatina constitutiva através do bandamento C foi utilizada a técnica descrita por SUMNER (1972) com diversas alterações nos tempos e temperaturas das soluções, no entanto não foi obtido sucesso em nenhuma tentativa. Também foi utilizada a metodologia proposta por GUERRA (2002) e não foi obtido nenhum padrão de marcação. 4 CONCLUSÕES No presente trabalho foi descrito pela primeira vez o número cromossômico de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez), que apresentou 2n=20 cromossomos, um índice CTC de 59,5 µm (± 2) e possui sistema de NOR simples. O resultado foi muito importante, pois poderá ser utilizado como referência para outras pesquisas. A espécie estudada apresentou melhor resposta ao PDB em comparação com o 8-HQ. Os dados obtidos no presente projeto foram importantes para a 8

9 caracterização das populações locais, além de ser pioneiro na descrição do número diplóide da Mangaba. Os resultados poderão auxiliar no estudo da evolução cariotípica da espécie e até mesmo em estudos de eventuais processos de especiação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALOUFA, M. A. I et al. Multiplicação e conservação in vitro de mangabeira. In: Simpósio brasileiro sobre a cultura da mangaba, Aracaju, SE. Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros, CD-ROM. FERREIRA, E. G.; LEMOS, E. E. P.; SOUZA, F. X.; LOURENÇO, I. P.; LEDERMAN, I. E.; BEZERRA, J. E. F.; SILVA JUNIOR, J. F. da; BARROS, L. M.; RUFINO, M. S. M.; OLIVEIRA, M. E. B. Frutíferas. In: SAMPAIO, E. V. S. B.; PAREYN, F. G. C.; FIGUEIRÔA, J. M. de; SANTOS JUNIOR, A. G. (Orgs.). Espécies da flora nordestina de importância econômica potencial. Recife: Associação Plantas do Nordeste, p GUERRA, M.S. Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al., Rev. Pros. Genet. IX, v.4, pp , GUERRA, M. Introdução à citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara, p. GUERRA, M.; SOUZA, M.J. Como observar cromossomos: um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto, SP: FUNPEC-Editora,2002. p131 HOWELL, W. M.; BLACK, D. A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, v.36, p , HUZIWARA, Y.; Karyotype analysis in some genera of Compositae. VIII. Further studies on the chromosome of Aster. American Journal of Botanic, v.49, pp , JUNQUEIRA, N.T.V.; SILVA, J.A.; CHARCHAR, M.J.A.; ANDRADE, L.R.M. Controle integrado da podridão de raízes (Cylindrocladium clavatum) de mudas de mangabeira. In: EMBRAPA. Centro de Pesquisa Agropecuária dos Cerrados (Planaltina, DF). Relatório Técnico Anual do Centro de Pesquisa Agropecuária dos Cerrados: 1991 a Planaltina. p , LEVAN A, FREDGA K, SANDBERG AA: Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 1964, 52: MELO, J.T. de. Respostas de mudas de espécies arbóreas do cerrado a nutrientes em Latossolo Vermelho Escuro p. Tese (Doutorado) - Universidade de Brasília, Brasília. PEÑALOZA, A.P.S. II Curso de citogenética aplicada a recursos genéticos vegetais. Brasília: Embrapa recursos genéticos e biotecnologia. 89p

10 PEREIRA, A.V.; PEREIRA, E.B.C.; JUNQUEIRA, N.T.V. Propagação e domesticação de plantas nativas do cerrado com potencial econômico. Horticultura Brasileira, v.19, Suplemento. CD-ROM. PINHEIRO, C. S. R. et al. Germinação in vitro de mangabeira (Hancornia speciosa Gomez) em diferentes meios de cultura. Revista Brasileira de Fruticultura, v.23, p , SCHLARBAUM, S. E. Cytogenetics studies of forest trees: looking to the past to meet challenges in the future. In: GUTTENBERGER, H. et al. Cytogenetics Studies of Forest Trees and Shrubs Review, Present Status, and Outlook on the future., Zvolen, Slovakia :Arbora Publishers, p SOUSA, C. S.; MOREIRA, M. J. S.; BASTOS, L. P.; COSTA, M. A. P. C.; ROCHA, M. A. C.; HANSEN, D. S. Germinação e Indução de Brotações in vitro Utilizando Diferentes Reguladores Vegetais em Mangabeira (Hancornia speciosa). Revista Brasileira de Biociências, v. 5, p , STACE, C. A. Cytology and cytogenetics as a fundamental taxonomic resource for the 20 st and 21 st centuries. Taxon 49, p , STEBBINS, G.L. Cromossomal variation in higher plants. London: Edward Arnold, p. STUESSY, F.O.D.F. Plant taxonomy: a sistematic evolution of comparative data. New York: Columbia University Press, p. SUMNER, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, v.74, p , VALOIS, A. C. C. A biodiversidade e os recursos genéticos. In: QUEIROZ, M. A.; RAMOS, S. R. R Recursos genéticos e melhoramento de plantas para o Nordeste brasileiro. Petrolina: Embrapa-CPATSA. (Livro eletrônico). VIEIRA NETO, R. D. Mangaba. In: VIEIRA NETO, R. D. Fruteiras potenciais para os tabuleiros costeiros e baixada litorânea. Aracaju: Embrapa-CPATC/Emdagro. p ,