Estudos Citogenéticos e Moleculares em Representantes da Família Erythrinidae (Teleostei, Characiformes)

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1 Universidade Estadual de Maringá Departamento de Biologia Celular e Genética Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular RENATA DA ROSA Estudos Citogenéticos e Moleculares em Representantes da Família Erythrinidae (Teleostei, Characiformes) Maringá - PR Abril 2009

2 RENATA DA ROSA Estudos Citogenéticos e Moleculares em Representantes da Família Erythrinidae (Teleostei, Characiformes) Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Doutora em Ciências Biológicas Maringá - PR Abril 2009

3 Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina. Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) R788e Rosa, Renata da. Estudos citogenéticos e moleculares em representantes da família Erythrinidae : (teleostei, characiformes) / Renata da Rosa. Maringá, f. : il. + anexos no final da obra. Orientador: Martins-Santos, Isabel Cristina. Co-orientador: Lucia Giuliano-Caetano. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Biologia Celular e Genética, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Inclui bibliografia. 1. Citogenética animal Teses. 2. Hoplerythrinus unitaeniatus Teses. 3. Cariotipos Teses. 4. Cromossomos sexuais Teses. I. Martins-Santos, Isabel Cristina. II. Giuliano-Caetano, Lucia. III. Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Biologia Celular e Genética. Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas. IV. Título. CDU :597

4 RENATA DA ROSA Estudos Citogenéticos e Moleculares em Representantes da Família Erythrinidae (Teleostei, Characiformes) Orientadora: Prof a Dr a Isabel Cristina Martins-Santos Co-Orientadora: Prof a Dr a Lucia Giuliano-Caetano

5 BIOGRAFIA Renata da Rosa nasceu em Cascavel/PR em 18/09/1982. Possui graduação em Ciências Biológicas, modalidade Bacharelado, pela Universidade Estadual do Oeste do Paraná ( ) e Mestrado em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Estadual de Londrina (2006). Em abril de 2006 iniciou o curso de doutorado no Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, tendo como orientadora a Prof a Dr a Isabel Cristina Martins dos Santos da Universidade Estadual de Maringá, e como co-orientadora a Prof a Dr a Lucia Giuliano-Caetano da Universidade Estadual de Londrina. Tem experiência na área de Genética Animal, atuando principalmente em citogenética e genética molecular de peixes neotropicais.

6 A percepção do desconhecido é a mais fascinante das experiências. O homem que não tem os olhos abertos para o misterioso passará pela vida sem ver nada. Albert Einstein

7 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus, por me contemplar com tantas coisas boas, família, amigos e colegas. Por me dar força e coragem para realizar meus sonhos. E por proporcionar uma felicidade muito grande, tanto no meu trabalho quanto na minha vida pessoal. Aos meus pais, Celomar e Tânia, por me apoiarem em todas as minhas escolhas e pela educação dada a mim, e que tornou quem eu sou. Aos meus irmãos, Ricardo e Rodrigo, longe e ao mesmo tempo tão perto. Vocês são peças fundamentais em minha vida. Ao meu amado Carlos. Por ser um companheiro maravilhoso. Pelos momentos felizes, pela força e ajuda emocional e profissional, durante todo esse período das nossas vidas. Agradeço a Deus todos os dias por ter te conhecido... À minha grande amiga e companheira Marceléia, com a qual divido a vida profissional há anos, e mesmo depois de tanto tempo continuamos firmes e fortes, servindo de apoio uma à outra. À adorada Angélica Marese, amiga de muitos anos, companheira de muitas (e olha que foram muitas) batalhas, exemplo de amizade e vida. Loira, você foi, é e sempre será importante em minha vida. À querida amiga Larissa Pires. Por todos os momentos difíceis que passamos juntas e que fortaleceram nosso triângulo de amizade. Também pelos vários momentos alegres que vivemos durante esse tempo, ah... pelas conversas sobre o Paraguai também... Ao amigo Rafael, companheiro de doutorado. Todo esse tempo do doutorado em convivência. Pelas viagens engraçadas e divertidas a Maringá.

8 Às companheiras de doutorado Juliane e Cláudia. Pelos momentos passados durante esse curso, pelas risadas, pelas manhãs e tardes passadas juntas estudando bioquímica. Obrigada pelo companheirismo... Aos amigos do laboratório de Citogenética de Peixes da UEM: Ana Luiza, Fernanda, Paulo, Ana Paula, Luciana, Alexandre, Edner, Léo, Paula e Bibiana. Pelos momentos de trabalho e diversão que tivemos no tempo que estive aí. À grande amiga Suzana... pela amizade, companheirismo, apoio e teto... Sua amizade foi muito importante esse tempo que estive aí... À minha querida Mazé. Pela atenção, carinho e disposição que teve comigo. Você foi uma pessoa fundamental durante o tempo que passei em Maringá. Obrigada mãezona Mazé Pop... Aos queridos amigos do laboratório de Citogenética de Peixes da UEL: Angélica, Vivian, Tatiane, Michelle, Vítor, Gabriel, Jamille, Fábio, Natália, Vanessa, Josi, Rosiley e Ana Cláudia. Pelos vários momentos de diversão. Desculpem o mau humor de vez em quando e a pegação no pé... tá bom Angélica... Aos colegas Melissa e Dário pelo auxílio em todos os momentos. Ao querido amigo Marquinhos. Obrigada pelos ensinamentos, pela paciência e pelo companheirismo nas altas horas do laboratório. Ao Prof Dr André L. L. Vanzela, pela convivência dentro e fora do laboratório. Pelos ensinamentos, idéias e conselhos, e pelo apoio fundamental no desenvolvimento do meu trabalho. À Prof a Dr a Ana Lúcia Dias, mais do que uma professora, uma amiga. Por me aturar todo esse tempo, me auxiliar em tudo que precisei e por me apoiar em vários momentos durante o doutorado.

9 À Prof a Dr a Lucia Giuliano Caetano, pela co-orientação, apoio, confiança, amizade, incentivo, compreensão, fundamentais para a realização desse trabalho. Devo meu crescimento profissional e pessoal a você. À Prof a Dr a Isabel Cristina Martins dos Santos. Por aceitar o desafio de me orientar e por confiar no meu trabalho. Por estar disposta a me ajudar sempre que necessário e por me compreender durante todo esse tempo. Obrigada pela oportunidade. Aos membros da comissão examinadora, por aceitarem o convite de compor a banca e pelas críticas e sugestões apresentadas. Ao programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular da Universidade Estadual de Maringá e ao corpo docente do mesmo. À CAPES pelo auxílio financeiro. À Universidade Estadual de Maringá e à Universidade Estadual de Londrina pelo suporte. Enfim, a todos que diretamente ou indiretamente ajudaram no desenvolvimento dessa tese.

10 APRESENTAÇÃO Esta tese é composta de quatro artigos científicos. Inicialmente há uma abordagem sobre a localização de seqüências cromossômicas encontrada na espécie Hoplerythrinus unitaeniatus associadas a sua distribuição geográfica, no artigo intitulado Tendência evolutiva em Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae). O segundo artigo tem como título Marcadores cromossômicos diferenciais entre citótipos simpátricos de Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae), e traz a ocorrência de citótipos simpátricos na espécie e demonstra a diferenciação dos citótipos em relação a diversos marcadores cromossômicos. Em seguida o artigo Coexistência de citótipos e mosaicismo cromossômico em Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae) mostra a ocorrência de citótipos em simpatria, com a existência de um mosaico genético derivado de um dos citótipos, este sendo confirmado por marcadores moleculares. A tese encerra com o artigo Evolução do cromossomo Y no sistema sexual X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y de Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae) do baixo Paranapanema o qual traz a ocorrência de diferentes formas do cromossomo Y na espécie bem como os possíveis rearranjos cromossômicos que levaram a diferenciação do mesmo. Em consonância com as regras do Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas, os artigos foram redigidos de acordo com as revistas às quais serão e estão submetidos. Capítulo I Renata da Rosa, Marceléia Rubert, Isabel Cristina Martins-Santos e Lucia Giuliano-Caetano. Tendência evolutiva em Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae). Heredity.

11 Capítulo II - Renata da Rosa, Marceléia Rubert, Lucia Giuliano-Caetano e Isabel Cristina Martins-Santos. Marcadores cromossômicos diferenciais entre citótipos simpátricos de Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae). International Review of Hydrobiology. Capítulo III - Renata da Rosa, Marceléia Rubert, Luiz Antonio Carlos Bertollo, Isabel Cristina Martins-Santos e Lucia Giuliano-Caetano. Coexistência de citótipos e mosaicismo cromossômico em Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae). Biological Research. Capítulo IV Renata da Rosa, Marceléia Rubert, Lucia Giuliano-Caetano e Isabel Cristina Martins-Santos. Evolução do cromossomo Y no sistema sexual X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y de Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae) do baixo rio Paranapanema. Cytogenetic and Genome Research.

12 RESUMO A Família Erythrinidae compreende peixes predadores de hábitos noturnos e carnívoros, distribuídos na região Neotropical e endêmicos à América do Sul e Central. É composta por três gêneros: Erythrinus, Hoplerythrinus e Hoplias. Citogeneticamente, esse grupo torna-se um interessante objeto de estudo, já que seus representantes apresentam uma grande variação cariotípica, sendo algumas vezes considerados como complexo de espécies. Em Hoplias malabaricus sete citótipos foram descritos até o momento, onde alguns não apresentam cromossomos sexuais visíveis, outros com sistemas sexuais simples e sistemas sexuais múltiplos. Para Hoplerythrinus unitaeniatus, dois grandes grupos são formados quanto ao número diplóide, um com 2n = 48 e outro com 2n = 52. Dentro deles é observada uma variação quanto à fórmula cariotípica. Neste trabalho foram analisados os padrões genéticos de duas espécies da família Erythrinidae, Hoplerythrinus unitaeniatus e Hoplias malabaricus, por meio de diferentes marcadores cromossômicos e moleculares. Foram analisadas populações de H. unitaeniatus, com 2n = 48 para todas as populações, entretanto, diferenças quanto à fórmula cariotípica e NF foram observadas. Os bandamentos cromossômicos foram semelhantes entre as populações. A variabilidade em H. unitaeniatus, a relação entre os citótipos descritos até o momento e a distribuição geográfica dos mesmos são discutidas. Para Hoplias malabaricus, três diferentes casos foram vistos. No primeiro foi observado a simpatria entre duas carioformas (citótipo D e A) sem detecção de híbridos. Corroborando a existência de um complexo de espécies. No segundo, foi observada outra população com duas formas cariotípicas em simpatria (A e C), e dois exemplares sem 2n definido. A análise por marcadores de RAPD foi realizada para verificar a origem dos indivíduos com 2n indefinido. Essas análises permitiram evidenciar que esses exemplares são resultados de mosaicismo cromossômicos em indivíduos do citótipo A. No terceiro caso, foram analisadas diferentes populações de H. malabaricus com sistema sexual X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y. Nelas, os machos diferiram quanto ao número e posição de regiões heterocromáticas e 18S rdna no cromossomo Y. Provavelmente essa diferenciação seja resultado de inversões pericêntricas. A presente tese, além de apresentar a grande variação cromossômica que ocorre entre diferentes populações das espécies estudadas, corrobora a idéia de um complexo de espécies para H. malabaricus e demonstra a variabilidade cariotípica acentuada na espécie H. unitaeniatus, sendo possível verificar que a família Erythrinidae caracteriza-se por apresentar uma grande variabilidade cromossômica.

13 ABSTRACT The Family Erythrinidae comprises predatory fish of nocturnal and carnivores habits, distributed in the Neotropical region and endemic to Central and South America. It is a composed of three genera: Erythrinus, Hoplerythrinus and Hoplias. Cytogenetically, this group is a interesting study object, because your members show a great karyotypic variation, sometimes considered as species complex. In Hoplias malabaricus seven cytotypes were described until, where some have no visible sex chromosomes, others with simple sexual systems and multiple sexual systems. To Hoplerythrinus unitaeniatus, two main groups are formed as the diploid number, one with 2n = 48 and other with 2n = 52. Among them a variation on the karyotypic formula is observed. In this study were analyzed the genetic patterns of two species of the family Erythrinidae, Hoplerythrinus unitaeniatus and Hoplias malabaricus, using different chromosomal and molecular markers. Cytogenetic analyses were performed in populations of H. unitaeniatus, with 2n= 48 for all populations, however, differences in karyotypic formula and FN were observed. Chromosomal bandings were similar among populations. The variability in H. unitaeniatus, the relation among the cytotypes described until and geographical distribution of them are discussed. To Hoplias malabaricus, three different cases were seen. In first, were observed sympatry among two karyoforms (cytotype D and A) without hybrids. Corroborating the existence of a species complex. In second, was observed other population with two karyotypic forms in sympatry (A and C), and two samples without 2n defined. The analysis by RAPD markers was performed to verify the origin of samples with 2n undefined. These analysis have show that these samples are results of chromosomal mosaicism in individuals of the cytotypes A. In the third case, we analyzed different populations of H. malabaricus with X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y sexual system. There, the males differed in the number and position of heterochromatic regions and 18S rdna on Y chromosome. Probably, this difference is result of pericentric inversions. This study, besides presented the great chromosomal variation that occurs among different populations of the species studied, supports the idea of a complex of species to H. malabaricus and demonstrates the to highlighted karyotypical variability in species H. unitaeniatus, being possible verify that the family Erythrinidae is characterized by presenting a high chromosomal variability.