TÍTULO: TESTE DE CAPACIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS

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1 TÍTULO: TESTE DE CAPACIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS INSTITUIÇÃO: FACULDADE ANHANGUERA DE BRASÍLIA AUTOR(ES): TUANE CRISTINA DIAS DOS SANTOS ORIENTADOR(ES): GILDEMAR JOSÉ BEZERRA CRISPIM COLABORADOR(ES): FLAVIA FRANCISCA DE ALMEIDA

2 TESTE DE CAPACIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE BACTÉRIAS GRAM- POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS Resumo As bactérias são seres procarióticos que se reproduzem por divisão assexuada. Conforme as características presentes na parede celular, às bactérias podem ser classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, os fatores de ataque ou agressão, as células Gram-positivas e Gram-negativas se caracterizam por diferentes graus de virulência. Esses microrganismos podem se multiplicar desordenadamente e o indivíduo ser acometido por doenças denominada infecções. O tratamento para essas doenças são os medicamentos alopáticos conhecidos como, antibióticos, porém existem inúmeras espécies de bactérias que adquiriram multirresistência a esses medicamentos. As plantas têm sido uma alternativa para essa resistência, entre elas encontra-se o Stryphnodendron adstringens (Barbatimão) onde se constatou atividade antimicrobiana. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método disco-difusão, o crescimento das cepas foi em meio Agar Muller Hinton, onde foram colocados aros de papel filtro embebido dos extratos glicólicos e hidroalcoólicos bruto e nas concentrações de 5, 15, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 90, 100, 150 e 200μL/ml durante 24 horas e o crescimento das colônias foi analisado após 24 horas de incubação 35 C. Foi observado que o as cepas de Staphylococcus aureus ATCC foi sensível ao extrato hidroalcoólico do barbatimão na diluição de 50μL/ml e as cepas de S. typhimurium ATCC sensíveis ao extrato hidroalcoólico na diluição de 100μL/ml, onde se constatou o maior halo de inibição do crescimento de 21mm no extrato hidroalcoólicos 1:50 e o menor de 10mm na diluição 1:100. Palavras-Chave: bactérias, plantas medicinais, extratos glicólicos, extratos hidroalcoólicos. Introdução As bactérias são seres procarióticos que se reproduzem por divisão assexuada. São formados por diversas estruturas, porém existe uma estrutura fundamental, a membrana citoplasmática. A maioria das bactérias possui

3 externamente uma membrana espessa e rígida, a parede celular, que é extremamente resistente. Envolvendo a parede, pode aparecer uma terceira camada, a cápsula.(junqueira; CARNEIRO, 1997; MURRAY et al., 2002, apud VIOLANTE, 2008a, p. 17). Conforme as características presentes na parede celular, às bactérias podem ser classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas. A diferença está em suas propriedades de permeabilidade e nos componentes de superfície (SCHAECHTER et al., 2002, p. 642). O principal componente estrutural da parede é o peptideoglicano, que consiste em um polímero de açúcares e aminoácidos. Nas bactérias Grampositivas o peptideoglicano forma uma camada espessa (20-80nm) constituindo uma estrutura extremamente forte, enquanto as Gram-negativas possuem uma camada menos espessa (5-10nm) consequentemente mais frágil (TRABULSI et. al., 1999a, apud VIOLANTE, 2008b, p. 18). As bactérias Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus utilizadas no estudo são caracterizadas por causarem diversas doenças na população e apresentarem versatilidade a antimicrobianos. Em geral os microrganismos apresentam habilidade genética de adquirir e de transmitir resistência às drogas utilizadas como agentes terapêuticos, através de mutações e mecanismos de transdução, transformação e conjugação (COHEN, 1992; TAVARES, 2000, apud VIOLANTE, 2008c. p. 22). Uma das alternativas proposta é a utilização dos medicamentos fitoterápicos, que é caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade, e de acordo com a legislação sanitária brasileira, são o medicamento obtido exclusivamente matérias-primas ativas vegetais (BRASIL, 2004, apud CARVALHO et. al., 2008, p. 314). Portanto a importância do estudo e caracterização de medicamentos alternativos para o combate a esses microrganismos. Objetivos

4 Identificar o potencial dos extratos glicólicos e hidroalcoólicos do Stryphnodendron adstringens para inibição das bactérias Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus. Testando diferentes concentrações de fitoterápicos que substituam os medicamentos alopáticos no combate a essas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Metodologia O estudo foi realizado no laboratório de Faculdade Anhanguera de Brasília, onde foi avaliada a capacidade antimicrobiana dos extratos glicólicos e hidroalcoólicos do Stryphnodendron adstringens. A espécie Stryphnodendron adstringens é conhecido popularmente como barbatimão (CAMARGO, 1985, apud FERREIRA et al., 2010a. p. 27). Para o preparo dos extratos glicólicos foram utilizadas as cascas secas do S. adstringens provenientes da Chácara Araguaia localizada na Quadra 3 - Chácaras Araguaia, Novo Gama - Goiás. Para a obtenção do extrato, foi realizada a triagem e a secagem do S. adstringens em temperatura de 60 C durante 48 horas. Para o extrato hidroalcoólicos foram utilizados 100 gramas do material seco e triturado, adicionados a 100 ml de etanol 70 % e mantido em repouso por 24 horas, posteriormente foi filtrado e concentrado em capela de exaustão por 96 horas em temperatura ambiente. O extrato glicólico utilizou-se 100 gramas do material seco e triturado adicionados a 100 ml de propilenoglicol e 50 ml de água destilada sendo agitado durante um período de 14 dias a temperatura ambiente. Após a obtenção dos extratos concentrados, foram realizadas diluições para se obter as concentrações equivalentes. Foram usadas as cepas de Salmonella typhimurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Staphylococcus aureus ATCC 25923, o crescimento das colônias bacterianas foi em meio Agar Muller Hinton, esse meio é utilizado para testes de avaliação da resistência aos microbianos. São utilizados aros de papel filtro (1 cm de diâmetro) devidamente esterilizados, que ficarão imersos por 24 horas nos extratos, e depois colocadas nas placas recém inoculadas com cerca de 10 8 UFC/mL das respectivas bactérias.

5 No tratamento foram utilizadas as dosagens 5, 15, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 90, 100, 150 e 200μL/ml onde foi medido o tamanho do halo de inibição do crescimento após 24 horas, a difusão do antimicrobiano leva à formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano. O método consiste na aplicação de 10 a 20μL da solução de agente antimicrobiano em discos de papel de filtro de 1 cm de diâmetro, nas diferentes concentrações a serem testadas como descrito por e Bauer (1966). Os halos são medidos em milímetros usando um paquímetro ou uma régua, que é encostado na parte de trás da placa de petri invertida. Desenvolvimento O S. adstringens (Barbatimão) planta utilizada como agente antimicrobiano, possui ampla distribuição no cerrado brasileiro conhecida popularmente como antisséptico e bactericida, no tratamento de várias infecções cutâneas, além de ainda ser empregada no tratamento de gonorreia, leucorreia, hérnia, feridas hemorrágicas, diarreias, gastrite, dores de garganta, hemorroidas e em forma de gotas sua utilização para conjuntivite (ALMEIDA et. al., 1998; CRUZ, 1985; NUNES et. al., 2003; MACEDO, 2007, apud SOARES, 2008a. p. 142). A espécie S. adstringens tem como principal princípio ativo o tanino e que, na medicina popular, dentre outras indicações terapêuticas, destaca-se como cicatrizante (COUTINHO et al., 2004, apud SOARES, 2008b, p. 142). Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água e precipitadores de proteínas (SILVA; SILVA, 1999; LIMA et al., 2010, apud RODRIGUES et al., 2013a. p. 1587). Este composto é responsável em propriedades biológicas, como controle de insetos, fungos e bactérias (AERTS; BARRY; MCNABB, 1999, apud PANSERA et al. 2003, p. 18). A biodiversidade brasileira, considerada como uma das mais ricas do planeta contém muitas plantas com propriedades antibióticas (MELO et al., 2008, apud PINHO et al., 2011a, p. 2). O uso de plantas medicinais é comum na medicina popular. Embora muitas pesquisas busquem isolar os componentes ativos dessas plantas, o efeito de um fitoterápico normalmente se dá pela ação sinérgica entre os compostos (MACIEL et al., 2002a, apud PINHO et al., 2011b. p. 2).

6 A resistência aos antimicrobianos é um fator genético, está relacionado à existência de genes contidos no microrganismo que codificam diferentes mecanismos bioquímicos que acabam impedindo a ação das drogas (CUNHA, 1998; LACEY, 1973, 1984; LEVY, 1982; MCDONALD, 1966; NOVICK, 1980; SAUNDERS, 1984; SUASSUNA, 1983; TRABULSI, 1973; ZULIANI, 1972, apud WALTER, 2000a, p. 282). É de fundamental importância a pesquisa por novos agentes antimicrobianos para criação de alternativas para o combate de microrganismos resistentes aos medicamentos alopáticos. Desenvolvendo-se fitoterápicos reconhecidamente seguros e eficazes, e proporcionando terapias menos agressivas ao atendimento primário à saúde. Resultados Foi observado que as cepas de S. aureus e S. typhimurium foram sensíveis aos extratos hidroalcoólicos de S. adstringens (barbatimão). Elas foram avaliadas frente ao extrato bruto e nas diluições referentes a as concentrações 5, 15, 30, 35, 40,45, 50, 60, 75, 90, 100, 150 e 200μL/ml. A determinação da atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico do barbatimão foi observada na concentração 50μL/ml para as cepas de S. aureus e 100μL/ml para as cepas de S. typhimurium, onde se constatou halos de inibição do crescimento entre 10mm e 21mm Figura 1. A Tabela 1 apresenta a média dos halos de inibição de crescimento, observou-se que o maior halo foi de 21mm e o menor de 10mm. Nas demais concentrações não se formaram halos de crescimento bacteriano. O extrato glicólico não apresentou halos de inibição de crescimento em nenhuma das concentrações (5, 15, 30, 35, 40,45, 50, 60, 75, 90, 100, 150 e 200μL/ml). A resistência adquirida pelas bactérias sobre os antimicrobianos é superior à criação de novos medicamentos contra infecções, resistência essa obtida pelas diversas mutações, e utilização incorreta de antibióticos (COHEN, 1992b; VIKSVEEN, 2003, apud FERREIRA et al., 2010b, p.29). A avaliação do extrato glicólico e hidroalcoólico das cascas do S. adstringens é devido à propensão de desenvolver medicamentos a partir de plantas naturais (CUNHA, 2006, apud SOARES et al., 2008c, p. 143).

7 Tabela 1. Atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de S. adstringens (barbatimão) em diferentes concentrações frente às cepas Salmonella typhimurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Staphylococcus aureus ATCC Extrato Hidroalcoólicos de S. adstringens Diluições μl/ml S. typhimurium K. pneumoniae S. aureus 5 μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml mm 60 μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml 10 mm μl/ml μl/ml Bruto Média dos halos (milímetros) Figura 1. Método disco difusão para avaliação e pesquisa de atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólicos de S. adstringens (barbatimão).

8 Ação do extrato hidroalcoólicos diluição 50μL/ml sobre a cepa Staphylococcus aureus formação de halos de inibição. Porém utilizando metodologia diferente como a perfuração em ágar, que consiste na retirada do meio de cultura sólido com auxílio de cilindros de 6-8 mm de diâmetro para a formação de poços, nos quais é possível aplicação das substâncias a serem analisadas. Nos poços foram colocados 50μL do extrato bruto e nas diluições de 50 e 100μL. Verificou-se atividade antimicrobiana sobre a cepa de S. aureus com os extratos brutos glicólicos e hidroalcoólicos de S. adstringes Figura 3. Onde as médias dos halos foram de 21.25mm para o extrato glicólico e 20.75mm para o extrato hidroalcoólico. Figura 2. Método perfuração em ágar para avaliação e pesquisa de atividade antimicrobiana dos extratos glicólicos e hidroalcoólicos de S. adstringens (barbatimão). Ação do extrato glicólico bruto sobre a cepa S. aureus (A)Ação do extrato hidroalcoólico bruto sobre a cepa S. aureus (B)formação de halos de inibição. Através da técnica de ágar diluição realizada pela incorporação de concentrações seriadas e logarítmicas de um antimicrobiano em meio de cultura, também foi obtido atividade antimicrobiana Figura 4. Foram avaliadas as concentrações de 50 e 100μL do extrato glicólico e hidroalcoólico de S. adstringens, incorporados ao meio na proporção de 3 ml de extrato para 20 ml de meio. Não houve Crescimento bacteriano em nenhuma das placas inoculadas com S. aureus, S.typhimurium e K. pneumoniae.

9 Figura 3. Método ágar diluição para avaliação e pesquisa de atividade antimicrobiana dos extratos glicólicos e hidroalcoólicos de S. adstringens (barbatimão). A B C Ação do extrato glicólico e hidroalcoólico diluição 100μL sobre as cepas de Salmonella typhimurium (A), Klebsiella pneumoniae (B) e Staphylococcus aureus (C). De acordo com os resultados obtidos por SOARES et al. (2008d, p.143) o extrato hidroalcoólico bruto de barbatimão apresentou atividade sobre S. mitis e L. casei na concentração de 350μg/mL, sendo estes resultados os mais favoráveis deste estudo. Orlando (2005, apud FERREIRA et al., 2010c, p.29) avaliou a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de S. adstringens nas concentrações de 100mg/ml, 200mg/ml e 300mg/ml sobre S. aureus, Candida albicans, Candida krusei, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rhizophila, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Shigella flexneri. FERREIRA et al., (2010d, p.29) avaliou as diluições referentes as concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25% 3,12% 1,56% e 0,78% e obteve determinação de atividade antimicrobiana do barbatimão até a concentração de 1,56%, onde constatou-se halos de inibição de crescimento de 8 e 9mm. HASENACK et al. (2008a, p. 16) utilizando o extrato alcoólico preparado com a casca do barbatimão (S. adstringens) obteve determinação de atividade antimicrobiana em concentrações iguais ou inferiores a 12,5 mg/ml para a cepa-padrão S. aureus ATCC e todas as cepas de S. aureus isoladas de feridas crônicas de pacientes ambulatoriais. E através de prospecção

10 fitoquímica da casca de barbatimão evidenciou a presença de taninos condensados e hidrolisáveis, grande quantidade de saponinas, flavonóides, polissacarídeos complexos e alcalóides. Possivelmente a ação antibacteriana evidenciada neste estudo, seja devido à presença de taninos detectados nas cascas do vegetal. O mecanismo de ação antimicrobiana dos taninos pode ser explicado por três hipóteses: 1) inibição das enzimas bacterianas/fúngicas através da complexação dos taninos com proteínas; 2) modificação do metabolismo microbiano em função da ação dos taninos sobre a membrana e organelas celulares e 3) diminuição da disponibilidade de íons essenciais para o metabolismo microbiano devido à complexação dos taninos com ferro, vanádio, magnésio, alumínio e cálcio (SCALBERT, 1991; HASLAM, 1996; MONTEIRO et al., 2005, apud HASENACK et al. 2008b, p. 16). Considerações Finais Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que o extrato hidroalcoólico do Stryphnodendron adstringens (barbatimão) apresentou atividade antimicrobiana contra as cepas de Staphylococcus aureus e Salmonella typhimurium, nas respectivas concentrações 50 e 100μL/ml, o que pode ser uma alternativa para o tratamento de infecções causadas por estes microrganismos. Porém as cepas de S. typhimurium, K. pneumoniae e S. aureus apresentaram resistência sobre o extrato glicólico do S. adstringens (barbatimão) em todas as concentrações. Por isso a necessidade de experimentar novos agentes antimicrobianos, e assim conseguir melhores alternativas para o tratamento desses organismos que apresentam grandes níveis de resistência antimicrobiana. Fontes Consultadas BAUER, A.W. et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Washington, Am. J. Clin. Microbiol, CARVALHO, Ana C. B.; Evelin E. Balbino; Artur, Maciel; João P. S. Situação do registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Brasil, Revista Brasileira de Farmacognosia, 2008.

11 FERREIRA, Sávio Benvindo; Palmeira, Josman Dantas; Souza, Joely Holanda de; Almeida, João Maurício de; Figueiredo, Maria Cecília Pereira; Pequeno, Allamahac Silva; Arruda, Thúlio Antunes; Antunes, Rossana Miranda Pessoa; Catão, Raïssa Mayer Ramalho. Avaliação da Atividade Antimicrobiana in vitro do extrato hidroalcóolico de Stryphnodendron adstringens(mart.) Coville sobre isolados ambulatoriais de Staphylococcus aureus. Brasil, RBAC, vol. 42(1): 27-31, HASENACK, Beatriz Schlatter; Jaqueline Meurer Sichinelli; Anna Flávia Garcia; Karisa Santos Gomes; Solange Spiti; Carlos Lopes Costa; Sandra Prestes L. F. de Oliveira. Atividade Antibacteriana do Extrato Barbatimão sobre Cepas de Staphylococcus Aureus Isoladas de Secreções de Feridas Crônicas de Pacientes Ambulatoriais. Londrina, UNOPAR Cient. Ciênc. Biol. Saúde, v. 10, n. 1, PANSERA, M. R.; Santos, A. C. A.; Paes E. K.; Wasum, R.; Rossato, M.; Rota, L. D.; Pauletti, G. F.; Serafini, L. A. Análise de taninos totais em plantas aromáticas e medicinais cultivadas no Nordeste do Rio Grande do Sul. Brasil, Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, n. 1, PINHO, Lucinéia de; Patrícia Nery Silva Souza; Eliane Macedo Sobrinho; Anna Christina de Almeida; Ernane Ronie Martins. Atividade antimicrobiana de extratos hidroálcoólicos das folhas de alecrim- pimenta, aroeira, barbatimão, erva baleeira e do farelo da casca de pequi. Santa Maria RS, Ciência Rural, RODRIGUES, Danilo Ferreira; Fernanda, Figueiredo Mendes; Antônio, Dionísio Feitosa Noronha Filho; Jéssica, Alves da Silva; Luiz, Antônio Franco da Silva. O extrato da casca de barbatimão, Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, na cicatrização de feridas em animais. Enciclopédia biosfera. Goiânia, Centro Científico Conhecer, v.9, nº16, SCHAECHTER, M., Encgleberg, N. C., Eisenstein, B. I., Medoff, G. Microbiologia: Mecanismos das doenças infecciosas. 3 ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, SOARES, Sara Pimenta; Adriana, Helena Chicharo Vinholis; Luciana, Assirati Casemiro; Marcio Luís Andrade Silva; Wilson Roberto Cunha; Carlos Henrique Gomes Martins. Atividade antibacteriana do extrato hidroalcoólico bruto de Stryphnodendron adstringens sobre microorganismos da cárie dental. Brasil, Rev. Odonto ciênc. 23, VIOLANTE, Ivana Maria Póvoa. Avaliação do potencial antimicrobiano e citotóxico de espécies vegetais do Cerrado da Região Centro-Oeste. Mato Grosso do Sul, (Tese de Mestrado em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste, Universidade Federal de Mato- UFMS). WALTER Tavares. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo, do enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Brasil, Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 33, 2000.