Análise da eficácia antimicrobiana de extratos vegetais de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L. e Coriandrum sativum L.

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1 Análise da eficácia antimicrobiana de extratos vegetais de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L. e Coriandrum sativum L. Rafaela Rogério Floriano de Sousa 1 ; Marcelo Rogério da Silva 2 ; Priscila Reina Siliano 3 ¹Graduado em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Fundação Santo André, CUFSA. 2 Doutor pelo Instituto Botânico De São Paulo 3 Profa Dra. e Docente do Centro Universitário Fundação Santo André Centro Universitário Fundação Santo André CUFSA, Santo André SP [Brasil] Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras FAFIL Endereço postal: Av Príncipe de Gales 821 Bairro Príncipe de Gales Santo Andre SP CEP ; tel ; priscila.siliano@fsa.br, psiliano@gmail.com RESUMO A resistência bacteriana é um grave problema, provocada principalmente pelo consumo excessivo de antibióticos, selecionando-se assim bactérias geneticamente mais resistentes. Devido a esta constante alteração, novas drogas devem ser elaboradas e alguns vegetais devem ser explorados para testar suas capacidades antimicrobianas. As espécies Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Salvia officinalis L. (sálvia) e Coriandrum sativum L. (coentro), foram submetidos a processos para obtenção de seus extratos puros, diluídos em concentrações de 0,05; 0,15; 0,20 e 0,30g/ml, e realizados testes com método de macrodiluição com 10 bactérias distintas: Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. O extrato de Rosmarinus officinalis L. a 0,30g/ml inibiu 7 espécies de bactérias, Salvia officinalis L. a 0,20g/ml inibiu 9 espécies de bactérias e o extrato de Coriandrum sativum L. 0,30g/ml foi eficaz contra todas as espécies de bactérias testadas e o mais eficiente comparado aos outros três extratos avaliados. Palavras-chave: Rosmarinus officinalis L.. Salvia officinalis L.. Coriandrum sativum L.. Extratos antimicrobianos. Resistência bacteriana. UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 207

2 ABSTRACT Bacterial resistance is a serious problem, caused mainly by the excessive consumption of antibiotics, thus selecting genetically resistant bacteria. Due to this constant alteration, new drugs must be developed and some plants must be explored to test their antimicrobial abilities. The species Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L. and Coriandrum sativum, were submitted to processes to obtain their pure extracts, diluted in concentrations of 0,05; 0.15; The results of the experiments were carried out using a microdilution method with 10 different bacteria: Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The extract of Rosmarinus officinalis L. at 0.30g / ml inhibited 7 species of bacteria, Salvia officinalis L. at 0.20g / ml inhibited 9 species of bacteria and the extract of Coriandrum sativum L. 0.30g / ml was effective against All bacterial species tested and the most efficient compared to the other three evaluated extracts. Keywords: Rosmarinus officinalis L... Salvia officinalis L.. Coriandrum sativum L... Antimicrobial extracts. Bacterial resistance. INTRODUÇÃO Muitos estudos mostram que vegetais podem possuir características antimicrobianas e podem ser utilizados em tratamentos infecciosos, mas que também é necessário um avanço nestas pesquisas e desenvolvimento de drogas e medicamentos pelas indústrias farmacêuticas (1,2,3,4). Os estudos com plantas medicinais avaliam a Concentração Inibitória Mínima (CIM), ou seja, qual a menor concentração de extrato ou substância estudada é capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano. E pode ser realizado a partir de técnicas como a de macrodiluição, que avalia se após o cultivo de bactérias em tubos de ensaio juntamente com a substância bactericida que está sendo testada, houve o desenvolvimento de bactérias ou estas foram completamente inibidas pela substância em questão, através da analise de turbidez da amostra (5). Diversos autores já estudaram a atividade antimicrobiana da Salvia officinalis L. (salvia), Rosmarinus officinallis L. (alecrim) Coriandrum sativum L.. (coentro) (6,7,8,9,10,11,12,13,14). UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 208

3 Tendo em vista o aumento de bactérias resistentes a determinados antibióticos, é necessário buscar novas substâncias para combater estas bactérias. Alguns vegetais como a sálvia, o alecrim e o coentro podem possuir propriedades antimicrobianas, justificando a realização do presente estudo. METODOLOGIA Folhas de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Salvia officinalis L. (sálvia) e Coriandrum sativum L (coentro), foram obtidas em estabelecimento comercial. Para preparar as amostras, as folhas foram secas em estufa a 40 C por 48 horas. Em seguida, as amostras secas foram pulverizadas em um moinho de facas (TECNAL ), e 100g de cada espécie foi utilizado para a obtenção do extrato etanólico bruto por ASE300 (DIONEX ). Como solvente, foi utilizado o etanol comercial a 95%. As extrações foram realizadas em um Extrator Acelerado por Solvente (ASE300-DIONEX ). As amostras secas e moídas (100g) foram inseridas em células de extração de 22 ml, composta de aço inoxidável. As extrações foram realizadas com o tempo estático de 15min, por um ciclo, e a temperatura foi mantida a 60 C. A pressão foi mantida em 1500psi. Cerca de 70 ml do solvente foi utilizado em cada processo de extração. Os extratos foram coletados em frascos de vidro. O solvente foi evaporado utilizando-se um evaporador rotativo (BUCHI ). O extrato etanólico bruto foi armazenado em frascos e colocado em banho-maria para eliminar totalmente o solvente. Os extratos foram pesados e os rendimentos foram comparados. Foram utilizadas dez espécies diferentes de bactérias, Klebsiella pneumoniae (CCCD K003), Enterobacter aerogenes (CCCD E001), Serratia marcescens (CCCD S005), Streptococcus pyogenes (CCCD S012), Proteus mirabilis (CCCD P001), Bacillus subtilis (CCCD B005), Escherichia coli (CCCD E004), Proteus vulgaris (CCCD P002), Staphylococcus aureus (CCCD S009) e Pseudomonas aeruginosa (CCCD P004), pertencentes á Bacterioteca do Laboratório de Biologia do Centro Universitário Fundação Santo André, nos testes microbiológicos. Os extratos de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Salvia officinalis L. (sálvia) e Coriandrum sativum L. (coentro) obtidos, foram diluídos em água destilada e esterilizados em autoclave, para a eliminação de possíveis contaminantes nos extratos. Para realizar os ensaios foi utilizada uma pipeta analítica de precisão para. Um UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 209

4 volume de 1000 µl de extrato em cada tubo de ensaio com 2 ml de caldo nutriente (Merck, Alemanha), e adicionados 100 µl de cada cultura bacteriana (crescidas a 37ºC por 24 horas). Os tubos foram incubados na estufa a 37ºC por 24 horas e analisados, segundo o método de macrodiluição avaliando a Concentração Inibitória Mínima (CIM). Amostras cujo meio apresentaram turbidez foram cultivadas em placas de ágar nutriente (Merck, Alemanha) e ágar MacConkey (Merck, Alemanha) para certificara ocorrência do crescimento, e para verificar possíveis contaminações foram realizados testes bioquímicos (catalase), coloração de Gram. RESULTADOS O extrato de Rosmarinus officinalis L. não apresentou efeito bactericida em concentração de 0,05g/ml. O efeito antimicrobiano na concentração de 0,15g/ml foi eficiente apenas na bactéria Klebsiella pneumoniae. Com concentração de 0,20g/ml, as bactérias Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus apresentaram sensibilidade. A concentração de 0,30g/ml se mostrou mais eficiente apresentando efeito bactericida em 7 das amostras testadas, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. As bactérias Serratia marcescens, Proteus mirabilis e Bacillus subtilis se mostraram resistentes a todas as concentrações do extrato de Rosmarinus officinalis L.. A concentração inibitória mínima (CIM) foi obtida para a Klebsiella pneumoniae em 0,15g/ml, para Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus em 0,20g/ml e para Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris e Pseudomonas aeruginosa em 0,30g/ml de extrato de Rosmarinus officinalis L.. Na concentração de 0,05g/ml o extrato de Salvia officinalis L. inibiu o crescimento apenas do Bacillus subtilis. Em concentração de 0,15g/ml ocorreu o crescimento de 8 das 10 bactérias testadas, apenas Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus apresentaram sensibilidade a este extrato. Os resultados obtidos nas concentrações de 0,20g/ml e 0,30g/ml foram semelhantes, com resistência de apenas da Pseudomonas aeruginosa, obtendo a concentração inibitória mínima (CIM) com 0,20g/ml de Salvia officinalis L. para Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Escherichia coli e Proteus vulgaris. Bacillus subtilis foi UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 210

5 inibido com a concentração mínima de 0,05g/ml e Staphylococcus aureus com a concentração mínima de 0,15g/ml de extrato de Salvia officinalis L.. O resultado observado na concentração de 0,05g/ml de extrato de Coriandrum sativum L. mostrou crescimento bacteriano em 8 das amostras, inibindo apenas Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus e portanto atingindo a concentração inibitória mínima para estas 2 bactérias. Em concentração de 0,15g/ml a espécie Coriandrum sativum L. proporcionou inibição de 6 bactérias testadas, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. E alcançando a concentração inibitória mínima com 0,15g/ml de extrato de Coriandrum sativum L. para Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens e Escherichia coli. DISCUSSÃO Os resultados observados com a concentração de Coriandrum sativum L. em 0,20g/ml mostrou apenas a resistência de 1 bactéria, Pseudomonas aeruginosa. Nesta concentração, o Coriandrum sativum L. foi capaz de inibir o crescimento de 9 das 10 amostras, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris e Staphylococcus aureus. Com o aumento da concentração do extrato de Coriandrum sativum L. para 0,30g/ml foi possível observar a sensibilidade de todas as amostras, não houve crescimento de nenhuma das bactérias testadas. Com todos os extratos em concentração de 0,05g/ml os resultados observados apresentaram crescimento das bactérias Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris e Pseudomonas aeruginosa. Com as concentrações dos extratos em 0,15g/ml é possível observar que somente as bactérias Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris e Pseudomonas aeruginosa apresentaram crescimento em todos os extratos. Estes resultados mostram que com o aumento da concentração dos extratos em 0,10g/ml já é possível obter o efeito bactericida em algumas espécies de bactérias, principalmente do extrato de Coriandrum sativum, que apresentou maior eficácia antibacteriana que Rosmarinus officinalis L. e Salvia officinalis L.. O extrato de Rosmarinus officinalis L. UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 211

6 mesmo com o aumento da concentração não apresentou eficácia bactericida considerável. Em concentrações de 0,20g/ml de todos os extratos apenas Pseudomonas aeruginosa apresentou resistência, e Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus foram sensíveis a todos eles. Com a concentração mais elevada dos extratos (0,30g/ml) não houve bactéria resistente. Como pode ser observado o extrato de Rosmarinus officinalis L. não apresentou eficácia bactericida em todas as bactérias testadas, mesmo em sua maior concentração (0,30g/ml) houve resistência bacteriana em 3 amostras. A espécie Salvia officinalis L. mesmo com a resistência de 1 bactéria quando em concentração 0,30g/ml demonstrou alta eficácia antimicrobiana. O extrato de Coriandrum sativum L. comprovou sua elevada potência bactericida, capaz de inibir todas as bactérias, e comparado aos outros extratos foi o melhor e mais eficiente, pois desde a menor concentração testada foi o que apresentou maior inibição bacteriana. Estudos com Rosmarinus officinalis L. apontam maior sensibilidade da bactéria Staphylococcus aureus, e resistência de bactérias como Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa a este extrato (15), porém foram utilizadas concentrações de 0,5g/ml e em conjunto com outras substâncias, neste caso com o clorofórmio, e utilizando a técnica de disco difusão baseados em um halo padrão de 18mm da oxacilina. Em comparação com HAIDA et al (15), os resultados obtidos apresentaram inibição bacteriana a partir de 0,15g/ml da bactéria Klebsiella pneumoniae (não utilizada por este autor), e a técnica utilizada foi de macrodiluição, com 0,20g/ml se obteve a inibição da bactéria Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes, sem qualquer adição de outras substâncias químicas. E com 0,30g/ml apresentou eficácia contra Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, diferentemente de HAIDA et al (15) que não atingiram tal resultado. Alguns estudos apontam a eficácia bactericida sobre bactérias cariogênicas, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei, Streptococcus mitis, com a técnica de disco difusão com extratos hidroalcoólicos (16). Estas bactérias não foram testadas neste trabalho, porém deve-se constatar a eficiência e o amplo espectro de ação deste vegetal. A espécie Salvia officinalis L. apresentou resistência apenas da bactéria Pseudomonas aeruginosa, estudos com este mesmo vegetal corroboram com este resultado, PEREIRA et al, onde foram UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 212

7 utilizados óleos essenciais de Salvia officinalis L. que inibiram o crescimento de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, e Enterobacter aerogenes, como nos resultados observados.(2) Porém há também estudos onde não ocorreu sensibilidade ao extrato pela bactéria Escherichia coli, mas sensibilidade da bactéria Pseudomonas aeruginosa Essas variações entre os estudos pode ser ocasionada por diversos fatores, como métodos empregados, clima, solo, cepa bacteriana, entre outros. (15). CONCLUSÃO Neste trabalho foi possível concluir que o extrato de Rosmarinus officinalis L. (alecrim) foi eficiente contra as bactérias Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. O extrato de Salvia officinalis L. (sálvia) possui ação antimicrobiana nas bactérias como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris e Staphylococcus aureus. Coriandrum sativum L. (coentro), foi eficaz em todas as bactérias, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. REFERÊNCIAS 1-SILVEIRA, Luiz Mário da Silva et al. Atividade antibacteriana de extrato de gervão frente cepas de Staphylococcus aureus oxacilina-sensíveis e oxacilinaresistentes isoladas de amostras biológicas. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de janeiro, v. 39, n. 4, p , PEREIRA, Rogério Santos et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v. 38, n. 2, p , CATÃO, R. M. R. et al. Atividade antimicrobiana in vitro do extrato do extrato etanólico de Punica granatum linn. (romã) sobre isolados ambulatoriais de Staphylococcus aureus. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, v. 38, n. 2, p , TUROLLA, Monica Silva dos Reis; NASCIMENTO, Elizabeth de Souza. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos utilizados no Brasil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 42, n. 2, p , abr./jun PELCZAR, Michael J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2. ed. São Paulo: UNISANTA Bioscience Vol. 6 nº 3 (2017) p Página 213

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