EXTRATOS DE ALECRIM ETANÓLICO E AQUOSO SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL DE Sclerotinia sclerotiorum 1

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1 EXTRATOS DE ALECRIM ETANÓLICO E AQUOSO SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL DE Sclerotinia sclerotiorum 1 FINGER, Geísa 2 ; BRAND, Simone Cristiane 5 ; MILANESI, Paola 7 ; SANTOS, Ricardo Feliciano dos 4 ; SILVA, Gerarda Beatriz Pinto 4 ; HECKLER, Leise Inês 3 ; BLUME, Elena 6 ; MÜLLER, Jucéli 4. 1 Trabalho de Pesquisa do Departamento de Defesa Fitossanitária - UFSM 2 Engenheira Agrônoma, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 3 Acadêmica do Curso de Agronomia, (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 4 Mestrando(a) do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 5 Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq), Piracicaba, SP, Brasil 6 Professora Associada do Departamento de Defesa Fitossanitária, UFSM, Santa Maria RS, Brasil 7 Doutora, (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil ge_finger@yahoo.com.br RESUMO Extratos vegetais podem auxiliar no controle de várias doenças de plantas, principalmente por sua atividade fungitóxica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos extratos aquoso e etanólico de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) nas concentrações 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0% sobre o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum. Discos de BDA (Batata-Dextrose-Ágar) contendo micélio do patógeno foram repicados para o centro de placas de Petri que continham meio de cultura e os extratos nas diferentes concentrações. O crescimento do patógeno foi mensurado por 18 dias. Todas as doses do extrato etanólico de alecrim reduziram o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum e as doses 2,5 e 3% foram as mais significativas, com uma redução de 100%. Quando incubado com o extrato aquoso o crescimento foi reduzido, mas apenas em 26,2% na dose de 3% do extrato. Palavras-chave: Rosmarinus officinalis L.; Sclerotinia sclerotiorum; Doses. 1. INTRODUÇÃO A busca por alimentos mais saudáveis é uma constante na sociedade atual, visto que o uso de agrotóxicos prejudica o meio ambiente, o homem e os animais de diversas maneiras. Por isso, estudos que busquem algumas alternativas para o controle de doenças são importantes. Nesse enfoque, uma nova política agrícola através da agricultura alternativa tem sido desenvolvida, voltada à minimização desses impactos no ambiente e ao homem por meio do controle alternativo de doenças de plantas, o qual inclui o controle biológico, a indução de resistência em plantas (BETTIOL, 1991) e o uso de produtos alternativos ao controle químico, como extratos e óleos vegetais, seja por sua ação fungitóxica direta ou indiretamente por meio da ativação de mecanismos de defesa nas culturas tratadas. Dentre os fungos mais agressivos e que podem atacar diversos hospedeiros está o patógeno Sclerotinia sclerotiorum que sobrevive no solo por meio de estruturas de resistência chamadas escleródios e pode atacar mais de 400 espécies hospedeiras, entre elas plantas de importância econômica como soja, feijão, algodão e girassol (BOLTON et al., 1

2 2006). Sua disseminação ocorre principalmente por sementes infectadas, sendo a doença causada conhecida como mofo branco, cujos sintomas se caracterizam pela podridão úmida coberta por micélio branco algodonoso na superfície do solo e/ou do tecido do hospedeiro, produzindo eventualmente estruturas de resistência, os escleródios (CARDOSO, 1990) que asseguram a presença do patógeno no solo por períodos de pelo menos seis a oito anos (BIANCHINI et al, 2005) até 11 anos (LEITE, 2005), dificultando o controle por meio de rotação de culturas. Na maioria das culturas, não há disponibilidade de cultivares que sejam resistentes ao patógeno (GARCIA, 2008). Os extratos de plantas medicinais como o alecrim têm mostrado capacidade fungitóxica, diminuindo ou inibindo o crescimento micelial de vários fungos patogênicos. Itako et al. (2009) verificaram redução de 49,06% do crescimento micelial de Cladosporium fulvum em relação à testemunha, com extrato de alecrim na concentração de 40%. Fiori, et al. (2000) relataram que o extrato de carqueja (Baccharis trimera) na alíquota de 100 µl inibiu em 95% o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii, Alternaria alternata e Phytophthora spp., bem como o extrato bruto de arruda (Ruta graveolens) nas alíquotas 20 e 40 µl inibiu totalmente o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito fungitóxico dos extratos de alecrim etanólico e aquoso sobre o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum. 2. METODOLOGIA 2.1 Obtenção e manutenção do patógeno O patógeno Sclerotinia sclerotiorum foi isolado de plantas de feijoeiro com sintomas da doença. A coleta foi feita com pinças para retirada de estruturas do patógeno, como escleródios. No laboratório, esses foram desinfetados com hipoclorito de sódio 1%, álcool 70% e água destilada e transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar), sendo incubadas na temperatura de 25 C e fotoperíodo de 12 h, ideais para o crescimento do patógeno. As colônias obtidas foram repicadas para meio de cultura BDA até obtenção de cultura pura. 2.2 Preparo dos extratos etanólicos e aquosos O material coletado (partes aéreas) de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), foi submetido à secagem em estufa, à temperatura de aproximadamente 40 ºC. Após, o material seco foi triturado em liquidificador doméstico até a obtenção de um pó e conservado ao abrigo de luz e umidade. Para o preparo do extrato etanólico, a extração dos compostos foi realizada adicionando-se etanol 70% ao pó seco, na relação 10:100 peso/volume, sendo 2

3 essa considerada como concentração de 10%. Após sete dias à temperatura ambiente, o extrato foi filtrado em papel filtro Whatman e o volume quantificado. Em seguida, procedeu a evaporação do solvente em evaporador rotativo (40 ºC) (CARDOSO FILHO, 2003), sendo o etanol evaporado e a fração aquosa recolhida. A essa fração aquosa foi adicionada água até atingir o volume de 100 ml obtido após a filtragem. Para a fabricação do extrato aquoso de alecrim, o pó obtido foi colocado em água destilada esterilizada para liberação dos extratos, na mesma proporção e tempo dos extratos etanólicos. Após os sete dias, o extrato foi filtrado em papel filtro Whatman e o volume quantificado. 2.3 Efeito dos extratos sobre o crescimento micelial O extrato etanólico e aquoso obtido foi submetido, separadamente, à filtração a vácuo, sendo adicionados ao meio de cultura BDA nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0%, após a autoclavagem do meio. O meio BDA contendo extrato foi vertido em placas de Petri e, após a completa solidificação, um disco de nove mm de diâmetro contendo micélio do fungo Sclerotinia sclerotiorum, foi repicado para as placas contendo meio BDA com as respectivas concentrações do extrato, vedadas com filme plástico, e incubadas a 21 ºC e fotoperíodo de 12 h. Para tratamento controle foi utilizado apenas o meio BDA. As avaliações foram realizadas medindo-se o diâmetro das colônias (média de duas medidas diametralmente opostas, previamente marcadas no fundo da placa), a cada 24 h, até o primeiro tratamento crescer em toda a placa, utilizando um paquímetro digital. Para o cálculo da porcentagem de inibição do crescimento micelial, foi utilizada a fórmula proposta por Menten et al. (1976). PIC = Crescimento radial da testemunha Crescimento radial do tratamento x 100 Crescimento radial da testemunha 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Quando expostas ao extrato etanólico de alecrim, todas as doses reduziram o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, sendo que as doses de 2,5 e 3,0% do extrato vegetal inibiram totalmente o crescimento do patógeno (Figura 1 e Tabela 1). No entanto, quando incubado com o extrato aquoso de alecrim o crescimento do fungo foi inibido em apenas 26,2% na dose de 3,0% do extrato (Figura 2 e Tabela 1). Esses resultados permitem inferir que, possivelmente, as substâncias fungitóxicas presentes no extrato de alecrim são mais solúveis em solvente orgânico do que em água, uma vez que, a inibição foi maior quando incubado com extrato etanólico quando comparado ao aquoso. 3

4 Figura 1 - Crescimento micelial (mm) de Sclerotinia sclerotiorum, em diferentes concentrações do extrato vegetal etanólico de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), em função de tempos crescentes de incubação. Santa Maria, Figura 2 - Crescimento micelial (mm) de Sclerotinia sclerotiorum, em diferentes concentrações do extrato vegetal aquoso de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), em função de tempos crescentes de incubação. Santa Maria, Alvarenga et al. (2007) avaliando os extratos aquosos e alcoólicos de alecrim, capimlimão, gengibre, hortelã, orégano e sálvia, nas concentrações de 10 e 20%, quanto à atividade antibacteriana sobre Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis (ATCC 9811) e Streptococcus mutans (ATCC 25175), verificaram que não houve ação antimicrobiana dos extratos aquosos, nas concentrações testadas, sobre nenhum desses micro-organismos. No mesmo estudo, os extratos etanólicos das plantas testadas, na concentração de 20%, inibiram parcialmente o crescimento de Shigella flexneri. 4

5 Tabela 1 - Equações e coeficientes de determinação (R 2 ) para o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum incubado com extrato vegetal etanólico e aquoso de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), em diferentes concentrações. Santa Maria, Extrato Solvente Dose Equação R 2 Etanol 0,0 y = 2,85 + 1,0641x 0,95 0,5 y = 7,94 + 0,2916x 0,97 1,0 y = 8,27 + 0,1808x 0,94 1,5 y = 9,47 + 0,1099x 0,97 2,0 y = 10,42-2,5 y = 9,02-3,0 y = 9,15 - Alecrim Água 0,0 y = 2,85 + 1,0641x 0,95 0,5 y = 8,40 + 0,1740x +0,01185x 2 0,99 1,0 y = 8,23 + 0,2864x + 0,00916x 2 0,99 1,5 y = 8,38 + 0,1471x +0,01131x 2 0,99 2,0 y = 8,44 + 0,2005x + 0,01008x 2 0,99 2,5 y = 7,95 + 0,0833x + 0,01030x 2 0,98 3,0 y = 8,31 + 0,0975x + 0,00886x 2 0,99 4. CONCLUSÃO Os extratos etanólico e aquoso de alecrim possuem atividade fungitóxica sendo que, o extrato etanólico demonstrou ser mais eficiente no controle do crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum. REFERÊNCIAS ALVARENGA, A. L. et al. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre bactérias patogênicas humanas. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 9, n. 4, p , BETTIOL, W. Controle biológico de doenças de plantas. Jaguariúna: Embrapa-CNPDA, p. 388, BIANCHINI, A.; MARINGONI, A. C.; CARNEIRO, S. M. T. P. G. Doenças do feijoeiro. In: KIMATI, H., et al. Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, v. 2, cap. 37, p ,

6 BOLTON, M. D.; THOMMA, B. P. H. J.; NELSON, B. D. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, v. 11, p. 1-16, CARDOSO FILHO, J. A. Efeito de Extratos de Albedo de Laranja (Citrus sinensis) dos Indutores de Resistência Ácido Salicílico, Acilbenzolar-S-Metil e Saccharomyces cerevisiae no Controle de Phyllosticta citricarpa (TELEOMORFO: Guignardia citricarpa) f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, CARDOSO, J. E. Doenças do feijoeiro causadas por patógenos de solo. Goiânia: EMBRAPA-CNPAF, p. 30, (Comunicado Técnico 30). FIORI, A. C. F. et al. Antifungal activity of leaf extracts and essential oilsof some medicinal plants against Dydimella bryoniae. Journal of Phytopathology, v. 148, n. 7/8, p , GARCIA, R. Produção de inóculo, efeito de extratos vegetais e de fungicidas e reação de genótipos de soja à Sclerotinia sclerotiorum f. Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, ITAKO, A. T. et al. Controle de Cladosporium fulvum em tomateiro por extratos de plantas medicinais. Arq Inst Biol, São Paulo, v. 76, n. 1, p , LEITE, R. M. V. B. C. Ocorrência de doenças causadas por Sclerotinia sclerotiorum em girassol e soja. Londrina: Embrapa Soja, 2005, 3p. (Comunicado Técnico 76). MENTEN, J. O. M. et al. Efeito de alguns fungicidas no crescimento micelial de Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. in vitro. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 1, n. 2, p ,