Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio, detergente e 0,015 mol/l de azido de sódio.

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1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK006 Cinquenta testes para uso com Autostainer Link 48 Uso pretendido Para uso com diagnóstico in vitro. O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx é um ensaio imuno-histoquímico qualitativo que utiliza anticorpo monoclonal de camundongos anti-pd-l1, Clone 22C3 para uso na detecção da proteína PD-L1 em tecidos com câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas (NSCLC) embebidas em parafina e fixadas em formalina (FFPE) utilizando o sistema de visualização EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expressão da proteína PD-L1 é determinada pelo índice de proporção do tumor (TPS), que representa a porcentagem de células tumorais viáveis que apresentam coloração parcial ou completa da membrana em qualquer intensidade. A espécie terá a expressão de PD-L1 se TPS 1% e expressão elevada de PD-L1 se TPS 50%. O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx é indicado como auxílio na identificação de pacientes com NSCLC para tratamento com KEYTRUDA (pembrolizumabe). Consulte o rótulo do produto KEYTRUDA para conhecer os valores de corte da expressão que orientam a terapia em circunstâncias clínicas específicas. Resumo e explicação A ligação dos ligantes PD-1, do PD-L1 e do PD-L2 com o receptor PD-L1 encontrados em células T inibe a proliferação de células T e a produção de citocinas. A regulação ascendente dos ligantes PD-1 ocorre em alguns tumores, e a sinalização por meio dessa via pode contribuir para a inibição da vigilância de tumores imune a células T ativas. KEYTRUDA é um anticorpo monoclonal humana que se liga ao receptor de PD-1 e bloqueia a interação com PD-L1 e PD-L2, liberando a inibição mediada via PD-1 da resposta imunológica, incluindo a resposta imunológica antitumor. Nos modelos de tumores de camundongos singênicos, o bloqueio da atividade do PD-1 resultou em diminuição do crescimento do tumor (1). Princípio do procedimento O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx contém reagentes otimizados e o protocolo necessário para executar procedimentos de marcação de IHC de amostras de FFPE usando Autostainer Link 48. Após a incubação com o anticorpo monoclonal primário PD-L1 ou o reagente de controle negativo (NCR), as amostras são incubadas utilizando um anticorpo de vinculação específico às espécies hospedeiras do anticorpo primário e, em seguida, incubadas com reagente de visualização pronto para uso composto por moléculas de anticorpo secundário e moléculas de perioxidase de raiz-forte ligadas à espinha dorsal de um polímero dextrano. A conversão enzimática do cromogênio adicionado posteriormente resulta na precipitação de um produto de reação visível no local do antígeno. A cor da reação cromogênica é modificada por um reagente cromogênico de realce. A amostra pode, então, ser contrastada e recoberta com vidro. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio de luz. Materiais fornecidos Cada kit inclui 19,5 ml de anticorpo primário PD-L1 (aproximadamente 3 µg/ml de proteína concentrada) e contém os reagentes necessários para realizar 50 testes em até 15 rodadas individuais. Os materiais listados abaixo são suficientes para 50 testes (50 lâminas incubadas com anticorpo primário para PD-L1 e 50 lâminas incubadas com o reagente de controle negativo correspondente; 100 lâminas ao todo). O número de testes se baseia no uso de 2 x 150 µl por lâmina de cada reagente, exceto DAB+ e solução de recuperação do alvo. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 15 séries individuais de marcação. Quantidade Descrição 1 x 34,5 ml Reagente bloqueador da peroxidase PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio, detergente e 0,015 mol/l de azido de sódio. 1 x 19,5 ml Anticorpo primário: Anticorpo monoclonal de camundongos anti-pd-l1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Anticorpo monoclonal de camundongos (IgG 1) anti-pd-l1 em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. 1 x 15 ml Reagente de controle negativo NEGATIVE CONTROL REAGENT Anticorpo IgG de controle monoclonal de camundongos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. 1 x 34,5 ml VINCULADOR, Camundongo LINKER, ANTI-MOUSE Anticorpo secundário de camundongos contra imoglobinas de coelhos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. P03951BR_04/SK / p. 1/16

2 1 x 34,5 ml Reagente de visualização - HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextrano ligado a moléculas de peroxidase e moléculas de anticorpos secundários de cabras contra imunoglobulinas de coelho e camundongo em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e um agente antimicrobiano. 15 x 7,2 ml Tampão de substrato DAB+ DAB+ SUBSTRATE BUFFER Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio e um agente antimicrobiano. 1 x 5 ml Cromogênio DAB+ DAB+ CHROMOGEN 3,3 - tetracloridrato de diaminobenzidina em solvente orgânico. 1 x 34,5 ml Realçador DAB DAB ENHANCER Sulfato cúprico em água. 6 x 30 ml Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Solução tamponada, ph 6.1, contendo detergente e um agente antimicrobiano. 15 lâminas Lâminas de controle PD-L1 IHC 22C3 pharmdx CONTROL SLIDES Cada lâmina contém seções de duas linhagens celulares granulares, embebidas em parafina e fixadas em formalina: NCI-H226* com expressão de proteína PD-L1 moderada e MCF-7 com expressão de proteína PD-L1 negativa. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: Negativo para PD-L1 NCI-H226: Positivo para PD-L1 *Dr. AF Gazdar e Dr. JD Minna da NIH são reconhecidos por sua contribuição no desenvolvimento do NCI-H226 (Número ATCC: CRL-5826 )(2). Observação: todos os reagentes incluídos são formulados especificamente para uso com este kit. De modo que a execução do teste ocorra de acordo com as especificações, nenhuma substituição, a não ser a solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x) (Código K8005), poderá ser feita. PD-L1IHC 22C3 pharmdx foi especialmente criado para uso com o Autostainer Link 48. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações adicionais. Materiais necessários, mas não fornecidos Módulo de pré-tratamento PT Link (Código PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Código AS480) Tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) (Código K8007) Hematoxilina (Código K8008) Água destilada ou deionizada (água reagente) Temporizador Tecidos positivos e negativos para uso como controles de processo (consulte a seção Controle de qualidade) Lâminas microscópicas: Lâminas microscópicas Dako FLEX IHC (Código K8020) ou lâminas Fisherbrand Superfrost Plus carregadas Coberturas de vidro Reagentes médios e subordinados de montagem permanente necessários à montagem de coberturas de vidro Microscópio de luz (ampliação objetiva de 4x a 40x) Precauções 1. Para uso com diagnóstico in vitro. 2. Para usuários profissionais. 3. Este produto contém azido de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico em forma pura. Nas concentrações do produto, embora não classificadas como perigosas, o NaN 3 pode reagir com tubulações de chumbo e cobre para formar acúmulos altamente explosivos de azidos de metal. No descarte, lave com bastante água a fim de impedir o acúmulo de azido de metal na tubulação (3). 4. O anticorpo primário, o reagente de controle negativo, o vinculador e o reagente de visualização contêm material de origem animal. 5. As amostras, antes e após a fixação, e todos os materiais a elas expostos, devem ser tratados como capazes de transmitir infecções e descartados observando-se as devidas precauções (4). 6. Os tempos, temperaturas ou métodos de incubação que não sejam os especificados poderão gerar resultados errôneos. 7. Os reagentes foram perfeitamente diluídos. Outras diluições poderão resultar em perda de marcação do antígeno. P03951BR_04/SK / p. 2/16

3 8. O reagente de visualização, o cromogênio DAB+ líquido e a solução cromogênea com substrato DAB+ preparado podem sofrer efeitos adversos se expostos a níveis excessivos de luz. Não armazene componentes do sistema nem execute a marcação em luz forte, como a luz direta do sol. 9. Resíduos de parafina poderão levar a falsos negativos. 10. O uso de volumes de reagentes que não sejam os recomendados poderá resultar na perda de imunorreatividade visível do PD-L Os resultados de um pequeno estudo apresentaram uma faixa dinâmica semelhante na expressão de PD-L1 em pares primários e metastáticos de espécies de NSCLC. É possível que existam diferenças na expressão de PD-L1 em tumores primários versus locais metastáticos no mesmo paciente. 12. Grandes seções de tecido poderão requerer 3x150 µl de reagente. 13. Como regra geral, pessoas com menos de 18 anos de idade não podem trabalhar com este produto. Os usuários devem ser cuidadosamente orientados sobre os procedimentos de trabalho adequados, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consulte a folha de dados de segurança (SDS) para obter informações adicionais. 14. Utilize equipamento de proteção individual adequado a fim de evitar contato com os olhos e a pele. 15. Soluções não utilizadas devem ser descartadas de acordo com as regulamentações locais, estaduais e federais. 16. Folha de dados de segurança disponível para usuários profissionais mediante solicitação. Perigo Cromogênio DAB+: 1 a 5% de bifenilo-3,3', 4,4'-tetracloreto de tetrailtetra-amônio H350 Pode causar câncer. H341 Suspeito de provocar falhas genéticas. P201 Obtenha instruções especiais antes de usar. P202 Não manuseie antes de ler e compreender todas as precauções de segurança. P280 Use luvas de proteção. Use proteção para os olhos ou o rosto. Use roupas de proteção. P308 + P313 SE foi exposto ou tem alguma preocupação: procure auxílio médico. P405 Armazene em lugar seguro. P501 Faça o descarte de conteúdos e contêiners de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Aviso Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x): 1 a 5% de ácido cítrico H319 Causa graves irritações nos olhos. H411 Tóxico para a vida aquática com efeitos de longa duração. P280 Use proteção para os olhos ou o rosto. P273 Evite a liberação no meio ambiente. P264 Lave bem as mãos após o manuseio. P305 + P351 + P338 SE CAIR NOS OLHOS: Lave cuidadosamente com água durante alguns minutos. Tire suas lentes de contato se estiver usando alguma e não for difícil removê-las. Continue lavando. P337 + P313 Se a irritação nos olhos persistir: procure auxílio médico. P501 Faça o descarte de conteúdos e contêiners de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Armazenamento Armazene todos os componentes do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, incluindo as lâminas de controle em local escuro à temperatura de 2 a 8 C quando não usados no Autostainer Link 48. Não use o kit após a data de vencimento impressa na parte externa da caixa do kit. Se o armazenamento dos reagentes for realizado sob condições diferentes das especificadas na bula, o usuário deverá validá-las. Não há sinais óbvios para indicar a instabilidade deste produto; portanto, os controles negativos e positivos devem ser executados simultaneamente utilizando amostras dos pacientes. Preparação das amostras O manuseio de amostras deve visar à preservação do tecido para marcação de IHC. Os métodos padrão de processamento de tecidos devem ser usados em todas as amostras. Seções embebidas em parafina Os tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina são adequados para uso. Os fixativos alternativos não foram validados e podem gerar resultados errôneos. O tempo de fixação de 12 a 72 horas em tampão de formalina neutra (NBF) 10% é recomendado. No entanto, um estudo com amostras limitadas que apresentou tempos de fixação de 4 a 168 horas em NBF 10% não alterou a detecção de PD-L1 sistematicamente. Tempos de fixação 3 horas podem resultar em detecção variável de PD-L1. As amostras devem ser bloqueadas em uma espessura de 3 ou 4 mm, fixadas em formalina e desidratadas e purificadas em uma série de alcoóis e xileno, seguido de uma infiltração com parafina derretida. A temperatura da parafina não deve ultrapassar 60 C. Blocos de tecido FFPE com 5 anos ou mais podem resultar na perda de imunorreatividade de PD-L1. As amostras de tecido devem ser cortadas em seções de 4 a 5 µm. Depois de serem cortados, os tecidos devem ser montados em lâminas do microscópio Dako FLEX IHC (código K8020), ou lâminas do Fisherbrand Superfrost Plus, e colocados em um forno 58 ± 2 C por 1 hora. Para preservar a antigenicidade, as seções de tecidos, após montadas em lâminas, devem ser armazenadas em local escuro à temperatura de 2 a 8 C (preferencialmente) ou a uma temperatura ambiente de até 25 C e marcadas em até 6 meses após o corte em seções. As condições de armazenamento e manuseio de lâminas não devem exceder 25 C em nenhum ponto após a montagem de modo a garantir a integridade e a antigenicidade do tecido. O uso do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecidos descalcificados não foi validado nem é recomendável. P03951BR_04/SK / p. 3/16

4 Preparação do reagente Os seguintes reagentes devem ser preparados antes da marcação: Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x) Prepare uma quantidade suficiente de solução de recuperação do alvo 1x, baixo ph, diluindo a solução de recuperação do alvo, baixo ph, 50x 1:50 usando água destilada ou deionizada (água reagente); o ph da solução de recuperação do alvo 1x deve ser 6,1 ± 0,2. Uma solução de recuperação do alvo 1x com ph inferior a 5,9 pode gerar resultados incorretos. Um frasco de 30 ml contendo solução de recuperação do alvo, baixo ph (50x), diluída a 1:50, fornecerá 1,5 l de reagente 1x, suficiente para encher um tanque PT Link, que tratará até 24 lâminas por uso. Descarte a solução de recuperação do alvo 1x após três utilizações e não mais do que 5 dias após a diluição. Soluções adicionais de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x), se necessárias, estarão disponíveis como Código K8005. Tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) Prepare uma quantidade suficiente de tampão de lavagem 20x 1:20 usando água destilada ou deionizada (água reagente) para as etapas de lavagem. Armazene as soluções 1x não utilizadas à temperatura de 2 a 8 C por não mais de um mês. Descarte tampões com aspecto turvo. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 para obter informações adicionais. O tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) está disponível como Código K8007. Solução cromogênea com substrato DAB+ A solução deve ser bem misturada antes do uso. Qualquer sedimentação em desenvolvimento na solução não afeta a qualidade da marcação. Para preparar a solução cromogênea com substrato DAB+, adicione uma gota de cromogênio DAB+ líquido por ml de tampão de substrato DAB+ e misture. O cromogêneo com substrato preparado permanece estável por 5 dias se armazenado em local escuro à temperatura de 2 a 8 C. Observações importantes: Se estiver usando um frasco inteiro de tampão de substrato DAB+, adicione 9 gotas de cromogênio DAB+. Embora o rótulo informe 7,2 ml, este é o volume utilizável e não considera o "volume morto" do frasco. A cor do cromogênio DAB+ líquido no frasco pode variar de transparente a marrom-lavanda. Isso não afetará o desempenho do produto. Dilua de acordo com as diretrizes acima. A adição do excedente de cromogênio DAB+ líquido no tampão de substrato DAB+ resultará em deterioração do sinal positivo. Procedimento de marcação na Solução Autostainer Link 48 Observações práticas O usuário deve ler cuidadosamente estas instruções e se familiarizar com todos os componentes e instrumentos antes de usá-los (consulte as Precauções). Todos os reagentes devem ser normalizados à temperatura ambiente (20 a 25 C) antes da imunomarcação. Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Não deixe que as seções de tecidos se sequem durante o procedimento de marcação. Seções de tecido secas podem apresentar aumento de marcação não específica. Todas as etapas necessárias e os tempos de incubação para marcação são pré-programados no software Dako Link. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações adicionais sobre como programar protocolos e carregar lâminas e reagentes. Observação: os reagentes e as instruções fornecidas neste sistema foram projetados para proporcionar desempenho máximo quando usados com os reagentes e materiais recomendados. Outras diluições dos reagentes ou alterações nos tempos de incubação ou temperaturas poderão gerar resultados errôneos ou discrepantes. Protocolo de marcação Selecione o protocolo de marcação PD-L1 IHC 22C3 pharmdx no menu suspenso do Dako Link. Todas as etapas necessárias e os tempos de incubação para marcação são pré-programados no software Autostainer Link 48. Se a lista de protocolos PD-L1 IHC 22C3 pharmdx adequados não estiver no seu servidor, entre em contato com o Representante de serviços técnicos local para obter os protocolos. Etapa 1: Procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1) Para obter detalhes, consulte o Guia do Usuário do PT Link. Ajuste o preaquecimento e o resfriamento do PT Link (Código PT100/PT101) em 65 C. Ajuste o aquecimento em 97 C durante 20 minutos. Encha os tanques do PT Link com 1,5 l de solução de recuperação do alvo por tanque, baixo ph, solução de trabalho 1x para cobrir as seções de tecido. Preaqueça a solução de recuperação do alvo em 65 C. Submerja os racks do Autostainer contendo seções de FFPE montadas na solução de recuperação do alvo preaquecida, baixo ph, (solução de trabalho 1x) no tanque do PT Link. Incube durante 20 minutos a 97 C. Quando a incubação da recuperação do alvo for concluída e a temperatura resfriar para 65 C, remova cada um dos racks de lâminas do Autostainer com as lâminas do tanque do PT Link e coloque imediatamente o rack do Autostainer com as lâminas em um tanque (por ex., estação de lavagem do PT Link, Código PT109) contendo tampão de lavagem diluído à temperatura ambiente (Código K8007). Deixe as lâminas no tampão de lavagem diluído à temperatura ambiente durante 5 minutos. P03951BR_04/SK / p. 4/16

5 Etapa 2: Procedimento de marcação Após o procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1), os racks do Autostainer com lâminas são colocados no Autostainer Link 48. O instrumento executará o processo de marcação aplicando o reagente adequado, monitorando o tempo de incubação e lavando as lâminas entre os reagentes. Os tempos do reagente são pré-programados no software Dako Link. Etapa 3: Corante de contraste As lâminas devem ser contrastadas durante 5 minutos com Hematoxilina (Link) (Código K8008). O tempo de incubação da hematoxilina é pré-programado no protocolo. Etapa 4: Montagem É necessária uma mídia de montagem permanente não aquosa. Observação: as lâminas poderão perder um pouco da marcação, dependendo de diversos fatores, incluindo, mas não se limitado a, contrastação, materiais e métodos de montagem e condições de armazenamento das lâminas. Para reduzir o desbotamento, armazene as lâminas em ambiente escuro à temperatura ambiente (20 a 25 C). Controle de qualidade Os reagentes no PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foram submetidos a controles de qualidade por imuno-histoquímica usando os procedimentos de marcação e de recuperação do alvo descritos acima. Desvios nos procedimentos recomendados de fixação, processamento e embebimento de tecidos no laboratório do usuário poderão produzir variações significativas nos resultados. Controles de qualidade deverão ser incluídos em cada série de marcação. Esses controles de qualidade são especificados na Tabela 1 e incluem: uma amostra de tecido de paciente marcado com H&E, tecidos de controle positivos e negativos fornecidos em laboratório e uma lâmina de linhagem de célula de controle fornecida pela Dako (5). Nos EUA, consulte as diretrizes de controle de qualidade do Programa de Certificação para Imuno-histoquímica da College of American Pathologists (CAP); consulte também o Controle de Qualidade para Imunocitoquímica da CLSI, Diretriz Aprovada (7), para obter informações adicionais. Verificação de ensaio Antes de usar inicialmente um sistema de marcação em determinado procedimento de diagnóstico, o usuário deve verificar o desempenho do ensaio testando-o em uma série de tecidos fornecidos em laboratório com características de desempenho de IHC conhecidas representando tecidos positivos e negativos conhecidos. Consulte os procedimentos de controle de qualidade descritos na seção correspondente acima. Esses procedimentos de controle de qualidade devem ser repetidos em cada novo lote de anticorpo ou sempre que houver uma mudança nos parâmetros do ensaio. As opções de solução de problemas potenciais, suas causas e ações corretivas sugeridas estão descritas na Tabela 12. Interpretação do índice - NSCLC Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina devem ser avaliadas e incluídas na avaliação de pontuação do PD-L1. No mínimo 100 células tumorais viáveis devem estar presentes na lâmina com coloração de PD-L1 para que a espécie seja considerada adequada para a avaliação de PD-L1. Para calcular corretamente o índice de amostras marcadas no PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, é fundamental avaliar as células apropriadas, identificar a localização celular adequada e interpretar a intensidade da coloração corretamente. A avaliação de lâminas deve ser executada por um patologista usando um microscópio de luz. Para avaliação da coloração imuno-histoquímica e do índice, é apropriado usar uma lente objetiva com 10-40x de ampliação. Toda coloração perceptível da membrana de células tumorais deve ser incluída no índice. Indique a coloração parcial ou completa da membrana celular ( 1+) que seja diferente da coloração do citoplasma. A coloração citoplasmática deve ser considerada não específica e excluída na avaliação da intensidade da coloração. Células normais e células imunológicas associadas ao tumor, como linfócitos ou macrófagos infiltrados, não devem ser incluídas no índice para a determinação da positividade de PD-L1. As espécies de tumor marcadas com NCR devem ter coloração específica 0 e coloração de fundo 1+. O índice de proporção do tumor (TPS) representa a porcentagem de células tumorais viáveis que apresentam coloração parcial ou completa da membrana ( 1+). A espécie terá expressão de PD-L1 se TPS 1% das células tumorais viáveis apresentarem coloração da membrana em qualquer intensidade. A espécie terá expressão elevada de PD-L1 se TPS 50% das células tumorais viáveis apresentarem coloração da membrana em qualquer intensidade. Para cada série de marcação, as lâminas devem ser examinadas na ordem apresentada na Tabela 1 a fim de determinar a validade da série de marcação e possibilitar a avaliação da marcação do tecido de amostra. Consulte o Manual de interpretação do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx para obter mais orientações. Recomendações adicionais para interpretação da coloração do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx 1. Para verificar a coloração da membrana celular, use uma objetiva com 10 40x de ampliação. 2. Vários elementos não alvo, como células imunológicas associadas ao tumor (por exemplo, macrófagos) e estromas, também podem ter coloração positiva para PD-L1. No entanto, eles não devem ser incluídos no índice. Tabela 1. Ordem recomendada para a avaliação de lâminas Amostras Base lógica Requisitos 1. H&E (fornecido em laboratório) Uma marcação de hematoxilina e eosina (H&E) da amostra do tecido é avaliada primeiro para analisar a histologia do tecido e a qualidade da preservação. A marcação H&E e PD-L1 IHC 22C3 pharmdx devem ser executadas nas seções em série no mesmo bloco de parafina da amostra. As amostras de tecidos devem estar intactas, bem preservadas, e devem confirmar a indicação de tumor. 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6 2. Lâmina de linhagem celular de controle (fornecida pela DAKO) 3. Lâminas de tecido de controle positivo (fornecidas em laboratório) 4. Lâminas de tecido de controle negativo (fornecidas em laboratório) 5. Tecido de controle da amídala (opcional) (fornecidas em laboratório) 6 Lâmina de tecido do paciente marcada com reagente de controle negativo A lâmina de linhagem celular de controle marcada com o anticorpo PD-L1 primário do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx deve ser examinada para averiguar se todos os reagentes estão funcionando corretamente. A lâmina de linhagem celular de controle contém a pellet de linhagem de células positivas do PD-L1 e a pellet de linhagem de células negativas do PD-L1. As lâminas de tecido de controle positivo marcadas com anticorpo PD-L1 primário e reagente de controle negativo devem ser examinadas em seguida. Essas lâminas verificam se o método de fixação e o processo de recuperação do alvo são eficazes. Os controles de tecido positivo conhecidos devem ser usados apenas no monitoramento do desempenho correto dos tecidos processados e dos reagentes de teste, e NÃO como um a formulação auxílio na formulação de um diagnóstico específico das amostras dos pacientes. As lâminas de controle de tecido negativo (conhecidas como negativas para PD-L1) marcadas com anticorpo PD-L1 primário e reagente de controle negativo devem ser examinadas na sequência de modo a verificar a especificidade da indicação do antígeno alvo pelo anticorpo primário. Como alternativa, as partes negativas do tecido de controle positivo podem funcionar como o tecido de controle negativo, mas isso deve ser verificado pelo usuário. Use tecido de amídala humana fixado, processado e embebido de maneira semelhante às amostras do paciente como um material de controle adicional para verificar a sensibilidade, a especificidade e a coloração de fundo não específica do ensaio. Examine amostras dos pacientes marcadas com o reagente de controle negativo do PPD-L1 IHC 22C3 pharmdx. O reagente de controle negativo é usado em substituição ao anticorpo primário e ajuda na interpretação da marcação específica no local do antígeno. Uma lâmina de linhagem celular de controle deve ser marcada com o anticorpo primário de PD-L1 em cada rodada de coloração. Critérios de aceitação do NCI-H226 (linhagem de células de controle positivas do PD-L1): Marcação de membrana celular de 70% das células em uma intensidade de coloração média de 2+. Intensidade de < 1+ de marcação não específica. Critérios de aceitação do MCF-7 (linhagem de células de controle negativas do PD-L1): Nenhuma marcação específica. Intensidade de < 1+ de marcação não específica. Veja que a marcação de algumas células na pallet de células MCF-7 pode ser observada ocasionalmente. Os seguintes critérios de aceitação são aplicáveis: a presença de 10 de células no total com diferentes marcações de membrana plasmática ou a marcação citoplasmática com 1+ de intensidade nos limites da pellet de células MCF-7 são aceitáveis. Se uma das linhagens de células de controle não atender a esses critérios, todos os resultados com as amostras do paciente deverão ser considerados inválidos. Os controles devem ser amostras de biópsias/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do paciente, fixas, processadas e embebidas tão logo possível da mesma maneira que as amostras dos pacientes. Use amostras intactas na interpretação dos resultados de marcação, pois as células necróticas ou degeneradas frequentemente geram marcações de forma não específica. Os tecidos selecionados para uso como controles de tecido positivo devem gerar marcação positiva de fraca a moderada quando marcados com PD-L1 para auxiliar na detecção de mudanças sutis na sensibilidade do ensaio. Duas lâminas de controle de tecido positivo devem ser incluídas em cada série de marcação. Lâmina marcada com PD-L1: a presença de marcação de membrana plasmática marrom deve ser observada. A marcação não específica deve ser 1+. Lâmina marcada com reagente de controle negativo: nenhuma marcação da membrana. A marcação não específica deve ser 1+. Se os controles de tecido positivo não demonstrarem a devida marcação positiva, os resultados com as amostras de teste deverão ser considerados inválidos. Os controles devem ser amostras de biópsias/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do paciente, fixas, processadas e embebidas tão logo possível da mesma maneira que as amostras dos pacientes. Duas lâminas de controle de tecido negativo devem ser incluídas em cada série de marcação. Lâmina marcada com PD-L1: nenhuma marcação da membrana em células tumorais. A marcação não específica deve ser 1+. Lâmina marcada com reagente de controle negativo: nenhuma marcação da membrana. A marcação não específica deve ser 1+. Se for específico membrana celular marcação ocorre no lâminas de controle de tecido positivo, resultados com a amostra do paciente deve ser considerada inválida. Uma coloração positiva forte deve ser detectada em partes do epitélio cripta e uma coloração fraca a moderada dos macrófagos foliculares nos centros germinais. A coloração negativa deve ser observada no endotélio, nos fibroblastos e no epitélio superficial. A ausência da marcação da membrana celular verifica a identificação específica do antígeno alvo pelo anticorpo primário. A marcação não específica deve ser 1+. P03951BR_04/SK / p. 6/16

7 7 Lâmina de tecido do paciente marcada com anticorpo PD-L1 primário Examine toda a lâmina das amostras dos pacientes marcadas com o anticorpo PD-L1 primário do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx por último. Consulte Resumo e explicação, limitações e características de desempenho para obter informações específicas sobre a imunorreatividade do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. A intensidade da marcação positiva deve ser avaliada no contexto de qualquer marcação de fundo não específica observada na lâmina do reagente de controle negativo do paciente na mesma série. Como em qualquer teste imuno-histoquímico, um resultado negativo significa que o antígeno não foi detectado, e não necessariamente que o antígeno estava ausente nas células/tecido ensaiados. Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina do paciente com marcação de PD-L1 devem ser avaliadas e incluídas na avaliação de pontuação do PD-L1. No mínimo 100 células tumorais viáveis devem estar presentes para que a espécie seja considerada adequada para a avaliação de PD-L1. Limitações gerais 1. A imuno-histoquímica é um processo de diagnóstico em várias etapas que requer treinamento especializado na seleção dos reagentes adequados; seleção, fixação e processamento de tecidos; preparação da lâmina imuno-histoquímica; e interpretação dos resultados da marcação. 2. A marcação do tecido depende do manuseio e processamento do tecido antes da marcação. Fixação inadequada, congelamento, descongelamento, lavagem, secagem, aquecimento, corte em seções ou contaminação com outros tecidos ou fluídos podem produzir artefatos, aprisionamento de anticorpos ou resultados de falsos negativos. Resultados inconsistentes poderão ser motivados por variações nos métodos de fixação e embebimento ou irregularidades inerentes no tecido. 3. A contrastação excessiva ou incompleta poderá comprometer a interpretação correta dos resultados. 4. A interpretação clínica de qualquer marcação positiva ou sua ausência deve ser avaliada no contexto da apresentação clínica, da morfologia e de outros critérios histopatológicos. A interpretação clínica de qualquer marcação, ou sua ausência, deverá ser complementada por estudos morfológicos e controles adequados, bem como por outros testes de diagnóstico. A interpretação da preparação corada é de responsabilidade de um patologista qualificado que esteja familiarizado com os anticorpos, reagentes e métodos utilizados. A marcação deve ser realizada em laboratório certificado e licenciado sob a supervisão de um patologista responsável por analisar as lâminas marcadas e garantir a adequação de controles positivos e negativos. 5. Os tecidos de pessoas infectadas com o vírus da hepatite B e contendo antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) podem apresentar marcação não específica com peroxidase de raiz-forte (7). 6. Os reagentes podem demonstrar reações inesperadas em tipos de tecidos não testados previamente. A possibilidade de reações inesperadas mesmo nos tipos de tecidos testados não deve ser totalmente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão do antígeno em neoplasmas ou outros tecidos patológicos. Entre em contato com Suporte Técnico da Dako com reações inesperadas devidamente documentadas. 7. Poderão ser constatados resultados de falsos positivos devido a ligações não imunológicas de proteínas ou produtos de reação de substrato. Estes poderão também ser causados por atividade de pseudoperoxidase (eritrócitos) e atividade de peroxidase endógena (citocromo C) (7). 8. Os reagentes e as instruções fornecidas neste sistema foram projetados para proporcionar desempenho máximo. Outras diluições dos reagentes ou alterações nos tempos de incubação ou temperaturas poderão gerar resultados errôneos ou discrepantes. Limitações específicas ao produto 1. Os resultados de falsos negativos podem ser causados pela degradação do antígeno nos tecidos com o passar do tempo. As amostras devem ser marcadas em até 6 meses após a montagem dos tecidos nas lâminas quando armazenadas no escuro a 2-8 C (recomendado) ou em temperatura ambiente até 25 C. 2. Para obter resultados reproduzíveis e ideais, a proteína PD-L1 requer pré-tratamento de recuperação do alvo quando os tecidos são fixados de forma rotineira (formalina tamponada neutra) e embebidos em parafina. 3. Não substitua os reagentes de números de lote diferentes deste produto ou de kits de outros fabricantes. A única exceção é a solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph 50x, que, se necessária, está disponível como Código K As linhagens de células de controle marcadas devem ser usadas exclusivamente na validação da série de marcação, e não na pontuação da reação de marcação nas seções dos tecidos. 5. O uso do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecidos com fixativos não correspondentes a formalina não foi validado. 6. O uso do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em aspirados de agulha fina não foi validado. Avaliação do desempenho clínico Ensaio 24: Ensaio controlado do tratamento de primeira linha de pacientes com NSCLC A eficácia do KEYTRUDA foi investigada no Ensaio 24, um ensaio controlado, randomizado (1:1), aberto e multicêntrico (9). Os principais critérios de qualificação foram NSCLC metastático, índice de proporção do tumor (TPS) de expressão de PD-L1 igual a 50% ou mais de acordo com um ensaio imuno-histoquímico usando o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, e ausência de tratamento sistêmico prévio de NSCLC metastático. Pacientes com aberrações tumorais no genoma EGFR ou ALK, doença autoimune que precisou de terapia sistêmica em até 2 anos antes do tratamento, alguma condição médica que exija imunossupressão ou que tenham recebido mais de 30 Gy de radiação torácica nas últimas 26 semanas não se qualificaram. Os pacientes foram randomizados para receber 200 mg de KEYTRUDA a cada 3 semanas (n=154) ou quimioterapia com platina escolhida pelo investigador (n=151; incluindo pemetrexed + carboplatina, pemetrexed + cisplatina, gemcitabina + cisplatina, gemcitabina + carboplatina ou paclitaxel + carboplatina. Pacientes com células não escamosas podem receber pemetrexed (manutenção). Os pacientes foram tratados com KEYTRUDA até manifestar toxicidade inaceitável ou evolução da doença, ou até 35 administrações. A evolução da doença subsequente pode ser tratada novamente por até mais 1 ano. O tratamento pode continuar além da evolução da doença se o paciente estiver clinicamente estável e se o investigador considerar que ele está recebendo benefícios clínicos. A avaliação do estado do tumor foi realizada a cada 9 semanas. O KEYTRUDA foi oferecido para pacientes que estavam fazendo quimioterapia e apresentaram evolução da doença. Entre os 305 pacientes do Ensaio 24, as características basais foram: idade média de 65 anos (54% com 65 anos ou mais), 61% do sexo masculino, 81% brancos e 15% asiáticos, e 35% e 65% com status de desempenho ECOG 0 e 1, respectivamente. As características da doença foram células escamosas (18%) e não escamosas (82%); M1 (99%); e metástases cerebrais (9%). A principal medida de desfecho de eficácia foi a sobrevida sem evolução da doença (PFS), conforme avaliado pela análise central independente cega (BICR) usando o Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1 (RECIST 1.1). Medidas adicionais de desfecho de eficácia foram a sobrevida global (OS) e a taxa de resposta objetiva (ORR), conforme avaliado pela BICR usando o RECIST 1.1. A Tabela 2 resume as principais medidas de eficácia de toda a população com intenção de tratar (ITT). P03951BR_04/SK / p. 7/16

8 Tabela 2: Resultados de eficácia do Ensaio 24 Desfecho primário KEYTRUDA 200 mg a cada 3 semanas n=154 Quimioterapia n=151 PFS* Número (%) de pacientes com o 73 (47%) 116 (77%) evento Razão de Risco (95% CI) 0.50 (0.37, 0.68) --- p-valor < Mediana em meses (95% CI) 10.3 (6.7, NA) 6.0 (4.2, 6.2) OS Número (%) de pacientes com o 44 (29%) 64 (42%) evento Razão de Risco (95% CI) 0.60 (0.41, 0.89) --- p-valor Mediana em meses (95% CI) Não alcançado (NA, NA) Não alcançado (9.4, NA) Taxa de resposta objetiva* ORR % (95% CI) 45% (37, 53) 28% (21, 36) Resposta completa % 4% 1% Resposta parcial % 41% 27% * Avaliado por BICR usando RECIST 1.1 Proporção de perigo (KEYTRUDA em comparação com a quimioterapia) com base no modelo de perigo proporcional de Cox estratificado Com base no teste de classificação de log estratificado NA = não disponível Entre os 69 pacientes randomizados para o grupo de 200 mg de KEYTRUDA com uma resposta objetiva, a duração das respostas variou de 1,9+ a 14,5+ meses. Oitenta por cento desses pacientes tinham uma resposta com duração de 6 meses ou mais (com base na estimativa de Kaplan-Meier; Figura 1). Figura 1: Curva de Kaplan-Meier para sobrevida global no Ensaio Sobrevida Overall Survival geral (%) Braço Treatment de tratamento arm KEYTRUDA Quimioterapia Chemotherapy Tempo Time in em Months meses Number Número at em Risk risco KEYTRUDA: Quimioterapia: Chemotherapy: Ensaio 10: Ensaio controlado de pacientes com NSCLC tratados anteriormente com quimioterapia A eficácia do KEYTRUDA foi investigada no Ensaio 10, um ensaio controlado, randomizado (1:1), aberto e multicêntrico (10). Os principais critérios de qualificação foram NSCLC avançado que evoluiu depois da quimioterapia com platina e, se apropriado, terapia direcionada para mutações de ALK ou EGFR e índice de proporção de tumor (TPS) da expressão de PD-L1 igual ou maior que 1% de acordo com uma versão de ensaio clínico (CTA) do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Quarenta e quatro por cento e 56% dos pacientes foram inscritos com base no teste de uma amostra de tumor arquivada ou de uma nova amostra de tumor, respectivamente. Pacientes com doença autoimune, alguma condição médica que exija imunossupressão ou que tenham recebido mais de 30 Gy de radiação torácica nas últimas 26 semanas não se qualificaram. Os pacientes foram randomizados (1:1:1) para receber 2 mg/kg (n=344) ou 10 mg/kg (n=346) de KEYTRUDA a cada 3 semanas ou 75 mg/m 2 de docetaxel a cada 3 semanas (n=343). Os pacientes foram P03951BR_04/SK / p. 8/16

9 tratados com KEYTRUDA até atingir toxicidade inaceitável ou evolução da doença que fosse sintomática, rapidamente progressiva, exigisse intervenção urgente, ocorresse com queda no status de desempenho ou fosse confirmada em 4 a 6 semanas com a repetição do exame de imagem. Os pacientes sem evolução da doença foram tratados por até 24 meses ou 35 administrações, o que fosse mais duradouro. A evolução da doença subsequente pode ser tratada novamente por até mais 1 ano. A avaliação do estado do tumor foi realizada a cada 9 semanas. As principais medidas de desfecho de eficácia foram OS e PFS, conforme avaliado por BICR usando RECIST 1.1. Com base em CTA, foram randomizados pacientes com NSCLC no estudo. Para avaliar a utilidade clínica do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, amostras arquivadas de estudo clínico foram testadas retrospectivamente em um laboratório de referência nos EUA com o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Dos pacientes, o tecido tumoral de 529 pacientes foi testado retrospectivamente com o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. As espécies de 413 pacientes tinham expressão de PD-L1 ( 1% de células tumorais viáveis com coloração da membrana em qualquer intensidade) e amostras de 94 pacientes não tinham expressão de PD-L1 (< 1% de células tumorais viáveis com coloração da membrana em qualquer intensidade). Desses 413 pacientes com expressão de PD-L1, as espécies de 163 pacientes tinham expressão elevada de PD-L1 ( 50% de células tumorais viáveis com coloração da membrana em qualquer intensidade). O nível de correspondência atingido entre o CTA e o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx é mostrado na Tabela 3. Tabela 3: Correspondência entre CTA e PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Taxas de correspondência Corte de PD-L1 Correspondência percentual negativa (intervalo de confiança (CI) de 95%) CTA x PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Correspondência percentual positiva (intervalo de confiança (CI) de 95%) TPS 1% 94.5% [91.4%-96.6%] 80.0% [76.9%-82.8%] TPS 50% 98.3% [97.1%-99.0%] 73.2% [67.9%-77.9%] Entre os pacientes randomizados com expressão de PD-L1 segundo o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, os dados demográficos e outras características basais foram bem equilibrados entre os braços de tratamento. A idade média foi de 63 anos (44% tinham 65 anos ou mais). A maioria dos pacientes eram brancos (77%) e do sexo masculino (58%); linha de base do status do desempenho ECOG era 0 (29%) ou 1 (71%). Setenta e oito por cento (78%) dos pacientes eram fumantes/ex-fumantes. Vinte e dois por cento (22%) dos pacientes tinham histologia escamosa e 69% tinham histologia não escamosa. As características basais e demográficas também foram bem equilibradas nos braços de pembrolizumabe e docetaxel no estudo clínico global. Os resultados de eficácia estão resumidos nas Tabelas 4 e 5. KEYTRUDA demonstrou benefícios clínicos duráveis em pacientes com NSCLC e expressão de PD-L1 (TPS 1%), que foram aprimorados em pacientes com expressão elevada de PD-L1 (TPS 50%), conforme determinado pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. A abrangência dos benefícios foi comparável àquela do ensaio clínico global. As tabelas abaixo resumem as principais medidas de eficácia na população global com expressão de PD-L1 (TPS 1%) e no subconjunto com expressão elevada de PD-L1 (TPS 50%) para o estudo clínico global (TPS 1% por CTA) e na população com expressão de PD-L1 segundo o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. A curva de Kaplan-Meier para OS (TPS 1%), conforme determinado pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, é mostrada na Figura 2. Os resultados de eficácia foram semelhantes para os braços de 2 mg/kg e 10 mg/kg de KEYTRUDA. Tabela 4: Resposta ao KEYTRUDA em pacientes com NSCLC tratados anteriormente: Estudo clínico global e PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em pacientes positivos: PD-L1 TPS 1% Desfecho primário KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel 2 mg/kg a cada 3 semanas 10 mg/kg a cada 3 semanas 75 mg/m 2 a cada 3 semanas Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Número de pacientes OS Mortes (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Razão de risco* (95% IC) 0.71 (0.58, 0.88) 0.54 (0.37, 0.78) 0.61 (0.49, 0.75) 0.57 (0.39, 0.82) p-valor <0.001 <0.001 < Mediana em meses (95% CI) PFS 10.4 (9.4, 11.9) 11.8 (9.6, NA) 12.7 (10.0, 17.3) 12.0 (8.7, NA) 8.5 (7.5, 9.8) 7.5 (6.3, 9.9) Eventos (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Razão de risco* (95% IC) (0.73, 1.04) (0.50, 0.92) (0.66, 0.94) (0.59, 1.06) p-valor Mediana em meses (95% CI) 3.9 (3.1, 4.1) 4.9 (4.1, 6.2) 4.0 (2.6, 4.3) 4.0 (2.2, 4.6) 4.0 (3.1, 4.2) 3.8 (2.2, 4.2) Taxa de resposta geral ORR % (95% IC) 18% (14, 23) 24% (17, 32) 18% (15, 23) 20% (14, 28) 9% (7, 13) 5% (2, 11) * Proporção de perigo (KEYTRUDA em comparação com docetaxel) com base no modelo de perigo proporcional de Cox estratificado Com base no teste de classificação de log estratificado Avaliado por BICR usando RECIST 1.1 Todas as respostas foram parciais P03951BR_04/SK / p. 9/16

10 Tabela 5: Resposta ao KEYTRUDA em pacientes com NSCLC tratados anteriormente: Estudo clínico global e PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em pacientes positivos: PD-L1 TPS 50% Desfecho primário KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel 2 mg/kg a cada 3 semanas 10 mg/kg a cada 3 semanas 75 mg/m 2 a cada 3 semanas Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Ensaio clínico PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Número de pacientes OS Mortes (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Razão de risco* (95% IC) 0.54 (0.38, 0.77) 0.45 (0.24, 0.84) 0.50 (0.36, 0.70) 0.29 ( ) p-valor < <0.001 < Mediana em meses (95% CI) PFS 14.9 (10.4, NA) Não alcançado (9.3, NA) 17.3 (11.8, NA) Não alcançado (8.3, NA) 8.2 (6.4, 10.7) 7.2 (4.4, 8.3) Eventos (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Razão de risco* (95% IC) 0.58 (0.43, 0.77) 0.47 (0.28, 0.80) 0.59 (0.45, 0.78) 0.41 (0.24, 0.70) p-valor < <0.001 < Mediana em meses (95% CI) Taxa de resposta geral ORR % (95% IC) 5.2 (4.0, 6.5) 30% (23, 39) 5.9 (4.2, 9.0) 37% (25, 52) 5.2 (4.1, 8.1) 29% (22, 37) 4.8 (2.8, NA) 28% (18, 41) 4.1 (3.6, 4.3) 8% (4, 13) 3.9 (2.0, 4.3) 4% (1, 15) * Proporção de perigo (KEYTRUDA em comparação com docetaxel) com base no modelo de perigo proporcional de Cox estratificado Com base no teste de classificação de log estratificado Avaliado por BICR usando RECIST 1.1 Todas as respostas foram parciais Figura 2: Curva de Kaplan-Meier para sobrevida global por braço de tratamento (TPS 1% por PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, população com intenção de tratado) Sobrevida geral (%) Docetaxel 75 mg/m 2 Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n em risco Docetaxel 75 mg/m 2 Q3W 131 Tempo em meses MK mg/kg Q3W 140 MK mg/kg Q3W 142 Análises adicionais de solidez foram realizadas para considerar o possível impacto de dados ausentes em pacientes com expressão de PD-L1 (TPS 1%) por PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, mas que poderiam não ter expressão de PD-L1 (TPS <1%) por CTA. Os pacientes com esses resultados de teste fazem parte da população de uso previsto/intenção de diagnosticar (ITD) do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. No entanto, eles foram excluídos do ensaio clínico devido à ausência de expressão de PD-L1 segundo a triagem de CTA. Para compensar esses dados ausentes, uma análise de sensibilidade foi realizada para entender o intervalo plausível da estimativa de P03951BR_04/SK / p. 10/16

11 proporção de perigo (HR) com base no PD-L1 IHC 22C3 pharmdx nas subpopulações com TPS 1% e TPS 50% em uma estrutura de ITD para verificar a consistência com a HR observada com base na inscrição com CTA. Os resultados da análise de sensibilidade de HR mostraram que as estimativas de HR são sólidas para qualquer atenuação prevista do efeito do tratamento na estrutura de ITD. Avaliação não clínica de desempenho Sensibilidade/especificidade analítica A sensibilidade analítica do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foi testada em 127 casos únicos de amostras de carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC) FFPE divididos em estágios de I a IV com o uso de um lote de produção fabricado. A avaliação da expressão do PD-L1 demonstrou marcações em um intervalo de 0 e 100% de células tumorais positivas e uma intensidade de marcação de 0 a 3. Tecidos normais: a Tabela 6 resume a imunorreatividade do anticorpo monoclonal de camundongos anti-pd-l1, Clone 22C3 no painel recomendado dos tecidos normais. A coloração da membrana plasmática foi observada em células imunológicas e células de origem epitelial. A coloração citoplasmática foi observada em alguns tipos de célula, mas não foi registrada como coloração positiva. Todos os tecidos foram fixados em formalina e embebidos em parafina e marcados com PD-L1 IHC 22C3 pharmdx de acordo com as instruções desta bula. Nenhum resultado inesperado foi observado nos tipos de célula e tecido testados. A coloração observada foi consistente com a literatura relatada para expressão de PD-L1 IHC em tecidos normais (11, 12). Tabela 6: Resumo da reatividade de tecidos normais do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Tipo de tecido (Nº testado) Marcação de membrana plasmática positiva: Elementos do tecido Marcação citoplasmática positiva: Elementos do tecido Nenhuma marcação específica. Amídala (3) 3/3 Epitélio cripta 2/3 Centro germinal (macrófagos) 0/3 0/3 Baço (3) 2/3 Macrofágos 0/3 0/3 Células mesoteliais (2) 0/2 0/2 0/2 Cerebelo (3) 0/3 0/3 0/3 Cérebro (3) 0/3 0/3 0/3 Colo do útero (3) 1/3 Epitélio 0/3 0/3 Cólon (3) 2/3 Macrofágos 0/3 0/3 Esôfago (3) 0/3 0/3 0/3 Estômago (3) 2/3 Linfócitos 1/3 Glândulas gástricas 0/3 1/3 Glândulas gástricas Fígado (3) 1/3 Macrofágos 0/3 0/3 1/3 Hepatócitos Glândula pituitária (3) 1/3 Hipófise anterior 1/3 Hipófise anterior 0/3 1/3 Hipófise posterior 1/3 Hipófise posterior Glândula salivar (3) 0/3 0/3 0/3 Intestino delgado (3) 0/3 0/3 0/3 Mama (3) 0/3 0/3 0/3 Medula óssea (3) 3/3 Megacariócitos 3/3 Megacariócitos 0/3 Músculo, cardíaco (3) 0/3 0/3 0/3 Músculo, esquelético (3) 0/2 0/2 0/2 Nervo, periférico (3) 0/3 1/3 tecidos conectivos/vasos 0/3 Ovário (3) 0/3 0/3 0/3 Pâncreas (3) 0/3 0/3 0/3 Paratireoide (3) 1/3 Epitélio glandular 0/3 0/3 Pele (3) 0/3 0/3 0/3 Próstata (2) 2/2 Epitélio 0/2 0/2 Pulmão (3) 3/3 Macrófagos alveolares 0/3 0/3 Rim (3) 1/3 Epitélio tubular 0/3 0/3 Suprarrenal (3) 0/3 1/3 Células medulares 0/3 Testículo (3) 0/3 0/3 0/3 Timo (3) 3/3 Epitélio medular 0/3 0/3 Tireoide (3) 0/3 0/3 0/3 Útero (3) 0/3 0/3 0/3 Tecidos neoplásicos: a Tabela 7 resume a imunorreatividade do anticorpo monoclonal de camundongos anti-pd-l1, Clone 22C3 no painel dos tecidos neoplásicos. A coloração da membrana plasmática foi observada em células imunológicas e células de origem epitelial. A coloração citoplasmática foi observada em alguns tipos de célula, mas não foi registrada como coloração positiva. Todos os tecidos foram fixados em formalina e embebidos em parafina e marcados com PD-L1 IHC 22C3 pharmdx de acordo com as instruções desta bula. Nenhum resultado inesperado foi observado nas espécies de tumor testadas. A coloração observada foi consistente com a literatura relatada para expressão de PD-L1 IHC em tecidos neoplásicos (11-14). Tabela 7: Resumo da reatividade de tecidos neoplásticos do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Tipo de tumor Localização Positivo para PD-L1/total N = 159 Adenocarcinoma Apêndice 0/1 Cabeça e pescoço, palato duro 0/1 Colo do útero, tipo endocervical 0/1 Cólon 0/5 Cólon, metastático com o fígado 0/1 Cólon, mucinoso 0/1 Esôfago 0/1 Estômago 0/6 Estômago, mucinoso 0/1 GI, metastático com o pulmão 0/1 P03951BR_04/SK / p. 11/16