EFEITO DO ENVELHECIMENTO DE CULTIVARES DE SOJA CONVENCIONAL OU LIVRE DE LIPOXIGENASES NA FRAÇÃO LIPÍDICA DOS GRÃOS

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1 EFEITO DO ENVELHECIMENTO DE CULTIVARES DE SOJA CONVENCIONAL OU LIVRE DE LIPOXIGENASES NA FRAÇÃO LIPÍDICA DOS GRÃOS S.P.G Castilho 1, S.H. Prudencio 2 1- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual de Londrina CEP: Londrina PR Brasil, Telefone: (043) Fax: (043) (brynna_10@hotmail.com) 2- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual de Londrina CEP: Londrina PR Brasil, Telefone: (043) Fax: (043) (sandrah@uel.br) RESUMO Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do envelhecimento acelerado das cultivares de soja BRS 257 (livre de lipoxigenases) e BRS 284 (convencional) sobre a fração lipídica. Os grãos foram armazenados por até oito meses a 30ºC e 76% UR, e uma amostra controle foi mantida a -18ºC. As frações lipídicas foram extraídas a frio com clorofórmio-metanol-água e analisadas quanto à acidez e ao índice de peróxidos. Os dados foram tratados por ANOVA e teste de Tukey (p 0,05). Com o armazenamento dos grãos observou-se elevação da acidez das frações lipídicas de ambas cultivares, enquanto que o índice peróxidos aumentou somente na fração lipídica da cultivar BRS 284. A cultivar BRS 257 (livre de lipoxigenases) mostrou-se mais estável à oxidação durante o envelhecimento. ABSTRACT The objective of the study was to evaluate the effect of accelerated aging of soybean cultivars BRS 257 (free from lipoxygenase) and BRS 284 (conventional) on the lipid fraction. The grains were stored for up to eight months at 30 C and 76% RH, and a control sample was kept at - 18 C. The lipid fractions were extracted with cold chloroform-methanol-water mixture, and they were analyzed as the acidity and the peroxide value.the data were analyzed by ANOVA and means were compared by Tukey test (p 0.05). Grains storage increased the acidity of the lipid fractions of both cultivars. Peroxides index increased only in the lipid fraction of BRS 284. The BRS 257 cultivar (free from lipoxygenase) was more stable to oxidation during aging. PALAVRAS-CHAVE: armazenamento; glycine max (L.) merrill; fração lipídica; oxidação. KEYWORDS: storage; glycine max (L.) merrill; lipid fraction; oxidation. 1. INTRODUÇÃO A soja (Glycine max (L.) Merrill) é a principal oleaginosa produzida mundialmente. O Brasil, Estados Unidos, Argentina e China são responsáveis por 90% da produção mundial do grão. Cerca de 90% do óleo produzido no Brasil é de soja (Lazzarotto e Hirakuri, 2009). Em regiões tropicais, como o Brasil, onde a temperatura média anual é de 27 C e a UR é de 80%, a manutenção da qualidade da soja durante o armazenamento prolongado pode ser prejudicada. Durante este período ocorrem alterações fisiológicas e bioquímicas nos grãos que levam a perda de qualidade que é denominada envelhecimento (Hou e Chang, 2004a, 2004b; Kamizake et al., 2014).

2 O mecanismo de envelhecimento dos é complexo e ainda não está bem elucidado. Os primeiros sinais de deterioração estão relacionados com a alteração ou perda da integridade das membranas celulares dos tecidos devido ao aumento da atividade das enzimas envolvidas na respiração. A fosfatase ácida participa de reações de hidrólise de ésteres e pode provocar a peroxidação dos fosfolipídeos de membranas causando a perda de sua integridade e da compartimentalização de constituintes celulares levando ao descontrole do metabolismo Estudos indicam a ocorrência de reações de hidrólise e oxidação dos triacilgliceróis, ácidos graxos insaturados e fosfolipídios, levando ao aumento de ácidos graxos livres, peróxidos e compostos voláteis nos grãos envelhecidos. (Narayan et al., 1988; Trawatha, 1995; Hou e Chang, 1998, 2004a, 2004b, Kamizake et al., 2014). Além de alterações nos lípdios, outros componentes também estão envolvidos no processo de envelhecimento. As lipoxigenases endógenas da soja são enzimas oxidativas que exercem ação catalítica sobre a reação de hidroperoxidação de ácidos graxos poli-insaturados da soja (ácido linolênico e linoleico) e resultam na produção de hidroperóxidos, produtos primários da oxidação (Ciabotti et al., 2006). No entanto, a ação dessas enzimas sobre os lipídios durante o envelhecimento da soja ainda não está bem esclarecida. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do envelhecimento acelerado das cultivares de soja BRS 257 (livre de lipoxigenases) e BRS 284 (convencional) sobre a fração lipídica e também contribuir com a elucidação do mecanismo de envelhecimento. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material Os grãos de soja [Glycine max (L.) Merrill] recém colhidos e secos das cultivares, BRS 257 (com ausência das enzimas lipoxigenases (L1, L2 e L3) e BRS 284 (convencional) com 8 e 10% de umidade respectivamente, ambas destinadas à alimentação humana, pertencentes à safra de 2013/2014, foram cedidos pela SL Alimentos (Mauá da Serra, Paraná, Brasil). 2.2 Métodos Condições de armazenamento da soja para o envelhecimento acelerado: O processo de envelhecimento acelerado procedeu-se segundo os estudos de Hou e Chang (2004c) e Kamizake et al., (2014). Armazenaram-se os grãos das duas cultivares em estufa (B.O.D Freeztec) a 30 ºC e 76% ± 2% de umidade relativa (UR) por até oito meses. A umidade relativa foi atingida por meio de uma solução saturada de cloreto de potássio (KCl). Uma amostra controle de cada cultivar recém colhida foi mantida -18 ºC. As amostras foram retiradas da estufa nos seguintes tempos 2, 3, 4, 5, 6 e 8 meses e transferidas para as mesmas condições das amostras controle, até a realização das análises. Extração da fração lipídica dos grãos: A fração lipídicas dos grãos foi obtida por extração a frio, segundo o método de Bligh e Dyer (1959), com adaptações, empregando-se clorofórmio-metanolágua (1:2:0,8, v/v) como solvente. Determinação do índice de acidez: Empregou-se o método titulométrico Cd 3d-63 da American Oil Chemists Society (AOCS, 2007). O índice de acidez foi calculado por meio da Equação 1. Os resultados foram expressos em mg KOH/g de amostra. (1)

3 Onde: A = volume, em ml, da solução padrão de KOH, utilizado na titulação da amostra; M = molaridade da solução de padrão de KOH; 56,1= massa molecular do KOH; m = massa da amostra, em gramas. Determinação do índice de peróxido: Determinou-se o índice de peróxido pelo método titulométrico Cd 8b-90 da American Oil Chemists Society (Aocs, 2003). O índice de peróxido foi calculado através da Equação 2. Os resultados foram expressos em meq/kg de amostra. Onde: A = volume, em ml, da solução de tiossulfato de sódio 0,01 M, utilizada na titulação da amostra; B = volume, em ml, da solução de tiossulfato de sódio 0,01 M, utilizada na titulação do branco; M = molaridade da solução de tiossulfato de sódio; m = massa da amostra, em gramas. Delineamento experimental e análise estatística: O experimento foi conduzido com duas repetições de acordo com o delineamento inteiramente casualizado e esquema de tratamentos em parcelas subdivididas, sendo o tratamento principal o tempo de envelhecimento e o secundário, as cultivares. As análises foram realizadas em duplicata em cada repetição do experimento (n=4). Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de comparação de médias de Tukey (p 0,05), utilizando o software Statistica 10.0 (Statsoft, Inc. 2011). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Índice de Acidez da Fração Lipídica O índice de acidez da fração lipídica dos grãos controles eram idênticos na duas cultivares. Notou-se que, houve um aumento do índice nas amostras do oitavo mês de envelhecimento, sendo mais acentuado na BRS 257 (sem lipoxigenases), conforme mostra a Figura 1. Comportamento semelhante foi observado por Ziegler et al. (2016), que relacionaram o aumento no índice de acidez às ações das lipases e fosfolipases presentes nos grãos. Oliveira (2011) observou que a atividade das lipases aumentou com a elevação da umidade dos grãos de soja e ao longo do período de armazenamento (umidades iniciais nos grãos em 12, 14 e 16%, temperatura média de 25 C, 70% UR, durante 12 meses). Durante o armazenamento em altas temperaturas e umidade elevada dos grãos, a fração lipídica pode ser lentamente hidrolisada, por ação de ezimas lipolíticas naturais (lipases) ou produzidas por bactérias e fungos, o que favorece a rancificação hidrolítica dos grãos (Araújo, 2008). Assim, a elevação no índice de acidez da fração lipídica durante o armazenamento dos grãos está relacionada ao aumento do conteúdo de ácidos graxos livres, resultantes da hidrólise das ligações ésteres de triacilgliceróis (2)

4 Figura 1 - Índice de Acidez da fração lipídica extraída dos grãos de soja BRS 257 e BRS 284 controles* e armazenados** em diferentes tempos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos em cada cultivar. Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre as cultivares em cada tempo. (Teste de Tukey, p 0,05). * Controle: -18ºC,**Armazenamento em diferentes tempos: 30ºC e 76% ±2% UR. 3.2 Índice de Peróxido da Fração Lipídica O índice de peróxido da fração lipídica dos grãos controles das duas cultivares foi idêntico. Com o armazenamento dos grãos, observou-se o seguinte comportamento com a cultivar BRS 284: houve aumento acentuado aos quatro meses, em relação ao controle, então uma redução, cujo valor foi idêntico ao controle aos cinco meses; novo aumento aos seis meses, onde os valores foram superiores ao controle e ao quinto mês, mas inferiores ao quarto mês. E finalmente, no oitvavo mês, os valores retornaram aos iniciais (controle) (Figura 2). Alencar et al. (2010) também observaram aumento no indice de peróxidos de grãos de soja armazenados por 6 meses. O índice de peróxido é um indicador do estágio inicial de alterações oxidativas dos lipídios. Os peróxidos são instáveis e formam componentes transitórios durante a oxidação, produtos intermediários que levam aos produtos da rancidez (oxidação) que causam off-flavors. Como resultado deste processo, o índice de peróxido passa por um valor máximo em algum ponto durante a oxidação excessiva, quando a taxa de formação de hidroperóxidos se aproxima à taxa de decomposição dos mesmos. Após esta etapa, o valor declina gradualmente. Assim a medida periódica do índice de peróxido durante a oxidação lipídica permite o reconhecimento desses vários estágios de formação e decomposição de peróxidos (Allen; Hamilton, 1983). Esse comportamento provavelmente ocorreu no presente estudo para a cultivar BRS 284 comprovando a oxidação lipídica durante o armazenamento dos grãos. E ainda, o aumento do índice de peróxidos está relacionado com o aumento da acidez dos grãos, observados no presente estudo. Foi verificado que na cultivar BRS 257, livre das enzimas lipoxigenases (Lox 1, 2 e 3), o índice de peróxido manteve-se estável durante o envelhecimento dos grãos, demonstrando que as cultivares livres das enzimas lipoxigenases são mais estáveis à oxidação lipídica durante o armazenamento e consequentemente, ao envelhecimento dos grãos.

5 Figura 2 - Índice de Peróxido da fração lipídica extraída dos grãos de soja BRS 257 e BRS 284 controles* e armazenados** em diferentes tempos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos em cada cultivar. Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre as cultivares em cada tempo. (Teste de Tukey, p 0,05) * Controle: -18ºC,** Armazenamento em diferentes tempos: 30ºC e 76% ±2% UR. 4. CONCLUSÕES Durante o armazenamento da soja ocorre aumento de ácidos graxos livres e de peróxidos, indicando que a hidrólise e oxidação lipídica são reações importantes envolvidas no mecanismo de envelhecimento. Oléo bruto de soja velha apresenta menor qualidade. A cultivar BRS 257 (livre de lipoxigenases) é mais estável que a BRS 284 a reações oxidativas durante o armazenamento. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alencar, E. R.; Faroni, L. R. D; Peternelli, L. A.; Silva, M. T. C & Costa,A. R. (2010). Influence of soybean storage conditions on crude oil quality. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, 14, Allen; J. C.: Hamilton, R.J. (1983). Rancidity in food: London Applied Science. AOAC (Americam Oil Chemists Society) Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists Society. (1993). (3d.) Washington. Araújo, J. M. A. (2008). Química de Alimentos: teoria e prática (4 ed.) Viçosa: Ed. UFV. Bligh, E.G.; Dyer, W.J.; Can. J. (1959). Biochem. Physiol, 37, 911. Ciabotti, S.; Barcellos, M. de F. P.; Mandarino, J. M. G.; Tarones, A. G. (2006) Avaliações químicas e bioquímicas dos grãos, extratos e tofus de soja comum e de soja livre de Lipoxigenase. Ciência e Agrotecnologia, v. 30. n.5. Hou, H. J., Chang, S.K.C. (1998). Yield and quality of soft tofu as affected by soybean physical damage and storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, Hou, H. J., Chang, S.K.C. (2004a). Structural characteristics of purified glicinin from soybeans stored under various conditions. J. Agric. Food Chem., 52, Hou, H. J., Chang, S.K.C. (2004b). Structural characteristics of purified beta conglicinin from soybeans stored under four conditions. J. Agric. Food Chem., 52,

6 HOU, H.J.; CHANG, S.K.C. (2004c).Structural characteristics of purified β-conglycinin from soybeans stored under various conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, p Kamizake, N. K.K.; Yamashita, F.; Prudencio, S. H. (2014). Physical alterations of soybean during accelerated and natural aging. Food Research International, 55, Lazzarotto, J.J.; Hirakuri, M.H. (2009). Evolução e perspectivas de desempenho econômico associadas com a produção de soja nos contextos mundial e brasileiro. Documento Técnico Embrapa Soja. Liu, K. (1997). Soybeans: chemistry, technology and a utilization. Nova York: Chapman and Hall, Narayan, R.; Chauhanc, G. S.; Verma, N. S. (1988). Changes in the quality of soybean during storage. Part 1 Effect of storage on some physicochemical properties of soybean. Food Chemistry, 27, Oliveira, M de. (2011). Efeitos da umidade, do tempo e dos sistemas de armazenamento sobre parâmetros de qualidade e propriedades tecnológicas dos grãs e do óleo de soja. (Tese de doutorado). Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Statsoft, Inc. (2011). Statistica (data analysis software system), version Trawatha, S.E., Tekrony, D.M.; Hildebrand, D.F. (1995). Relationship of soybean seed quality to fatty acid and C6-Aldehyde levels during storage. Crop Sci., 35, Ziegler, V.; Marini, L. J.; Ferreira, C. D.; Bertinetti, I. A.; Silva, W. S. V.; Goebel, J. T. S.; Oliveira, M.; Elias, M. C. (2016). Effects of temperature and moisture during semi-hermetic storage on the quality evaluation parameters of soybean grain and oil. Semina: Ciências Agrárias, 37, (1)