FARIAS, O.T. 1* ; NASCIMENTO, L.C. 1 ; OLIVEIRA, F.S. 2 ; SANTOS, M.D.R. 1 ; BRUNO, R.L.A. 1

Transcrição

1 Óleo essencial de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf) sobre a sanidade e fisiologia de sementes de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp) 629 FARIAS, O.T. 1* ; NASCIMENTO, L.C. 1 ; OLIVEIRA, F.S. 2 ; SANTOS, M.D.R. 1 ; BRUNO, R.L.A. 1 1Departamento de Fitotecnia e Ciências Ambientais, Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB, Brasil; 2 Departamento de Ciências Vegetais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró-RN, Brasil; *Autor para correspondência: otiliarfarias@gmail.com RESUMO: O emprego do tratamento em sementes é uma forma eficiente e, cada vez mais necessária, no controle de patógenos. Dentre os tratamentos de sementes, o uso de óleo essencial de plantas medicinais têm se mostrado uma alternativa viável, sem deixar resíduos químicos ou efeitos deletérios ao meio ambiente. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de óleos essenciais de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf) na qualidade sanitária e fisiológica de cultivares de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.). O método utilizado para a análise e identificação de fungos em sementes foi a incubação em substrato de papel filtro Blotter Test. Utilizaram-se no teste de sanidade 200 sementes por tratamento, sendo distribuídas em 10 repetições de 20 sementes para cada cultivar. Os tratamentos foram constituídos por óleo de andiroba e copaíba nas concentrações de 0% - Testemunha; 0,5%; 1,0% e 2,0% e, tratamento com fungicida Captana na dosagem de 240g do produto para 100 kg de sementes. As sementes foram imersas nos tratamentos por período de 5 min e, incubadas em placas de Petri, sendo mantidas por um período de dez dias à temperatura de 26±2 C. Para a qualidade fisiológica foram utilizadas 100 sementes, sendo quatro repetições de 25 sementes por tratamento, distribuídas em papel Germitest à temperatura de 30 C, avaliando-se o efeito dos óleos sobre a germinação, primeira contagem de germinação, comprimento e matéria seca de plântulas, durante oito dias. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Nas sementes não tratadas das cultivares BRS Gurgueia e Marataoã foi observada maior incidência de Aspergillus flavus e Fusarium sp. O uso dos óleos de andiroba e copaíba reduziu a incidência dos fungos Botrytis sp. e Periconia sp. na BRS Gurgueia e, Cladosporium sp. e Fusarium sp. na Marataoã. A aplicação dos óleos de andiroba e copaíba não interferiu na qualidade fisiológica das sementes das cultivares de feijão macassar. Palavras-chave: controle alternativo; atividade antifúngica; compostos naturais; qualidade fisiológica ABSTRACT: Essential oil of andiroba (Carapa guianensis Aubl.) and copaiba (Copaifera langsdorffi Desf) on health and physiology of seeds macassar bean (Vigna unguiculata L. Walp). The use of seed treatment is an efficient method and increasingly necessary to control pathogens. Among seed treatments, use of the essential oil of medicinal plants have been shown a viable alternative, without leaving chemical residues or effects deleterious to environmental. The objective of this work was to evaluate the effect of essential oils of andiroba (Carapa guianensis Aubl.) and copaiba (Copaifera langsdorffi Desf) in sanitary and physiological quality of macassar bean cultivars (Vigna unguiculata L. Walp.). The method used for the analysis and identification of fungi on seeds was the incubation on filter paper substrate Blotter Test. It was used in the health test 200 seeds per treatment, being distributed in ten repetitions of 20 seeds for each cultivar. Treatments consisted of andiroba and copaiba oils in concentration of 0% - Witness; 0.5%; 1.0% and 2.0%, and Captana fungicide treatment at a dosage of 240g per 100 kg of seeds. Seeds were immersed in treatments for 5 min period, and incubated in Petri dishes, being maintained for ten days at 26 ± 2 C. In order to evaluate the physiological quality 100 seeds were used, being four replicates of 25 seeds per treatment distributed in Germitest Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0112 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

2 630 paper at a temperature of 30 C, assessing the effect of the oils on the germination, first count of germination, length and dry matter of seedlings, for eight days. The experimental design used was completely randomized. At the untreated seeds of BRS Gurgueia and Marataoã there was a higher incidence of Aspergillus flavus and Fusarium sp. The use of andiroba and copaiba oils reduced the incidence of the fungus Botrytis sp. and Periconia sp. in the BRS Gurgueia and, Cladosporium sp. and Fusarium sp. in Marataoã. The application of andiroba and copaiba oils does not affected the physiological quality of seeds of macassar bean cultivars. Keywords: alternative control; antifungal activity; natural compounds; physiological quality INTRODUÇÃO O feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.) também conhecido como feijão-caupi ou feijão-de-corda, é uma leguminosa de grande importância para o Norte e Nordeste do Brasil, constituindo um componente alimentar básico para a população, dada a sua fonte rica de proteínas, minerais e carboidratos e, seu preço acessível. Além disso, é uma alternativa importante de geração de emprego e renda nas áreas produtoras (Freire Filho et al., 2005; Freire Filho et al., 2011). A utilização de sementes de baixa qualidade sanitária e fisiológica pelos agricultores é um dos principais fatores responsáveis pela redução da produtividade do feijão macassar (Gomes et al., 2008). De acordo com Machado (2012), quando presente na semente, os patógenos podem resultar em abortos, deformações, descoloração da casca, o que leva sempre a redução do potencial germinativo e vigor das sementes e, quando alocadas no campo, resultarão em estandes de plantas desuniformes com baixa ou nenhuma produção. Assim, a utilização de sementes de boa qualidade sanitária é o primeiro passo no momento de implantação de uma lavoura produtiva. Apesar da eficiência do tratamento químico no manejo de patógenos em sementes, seu uso vem perdendo expressão, devido ao custo elevado, os danos causados à saúde do homem e ao meio ambiente e, a contribuição significativa para o surgimento de patógenos resistentes (Hillen et al., 2012). Em meio a isto, uma alternativa viável é o uso de compostos naturais, em especial o uso de óleos essenciais de plantas medicinais, uma vez que, tais produtos apresentam metabólitos secundários com propriedades fungicidas e/ou fungitóxicas de baixa ou nenhuma toxicidade ao homem e, assim, com potencial para substituir o controle químico no tratamento de sementes (Fernandes et al., 2015; Fonseca et al., 2015; Saroj et al., 2015). Várias pesquisas têm demonstrado o potencial de óleos essenciais, oriundos de plantas medicinais, no controle de fungos em sementes de trigo (Triticum aestivum L.) (Rodrigues et al., 2006), soja (Glycine max L.) (Gonçalves et al., 2009; Silva et al., 2012) milho (Zea mays L.) e feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) (Hillen et al., 2012), sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) (Flávio et al., 2014). Todavia, para o feijão macassar, existem poucas informações sobre o uso de óleos essenciais no tratamento fitossanitário de sementes (Silva et al., 2014). Ressalta-se que, apesar do grande potencial do uso de óleos essenciais no tratamento sanitário de sementes, tais produtos podem afetar as características fisiológicas das sementes, causando a perda na germinação e do vigor e, assim, devem ser obrigatoriamente avaliados em estudos com tratamentos de sementes. Diante do exposto, o trabalho objetivou avaliar o efeito de óleos essenciais de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf) na qualidade sanitária e fisiológica de cultivares de feijão macassar. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido nos Laboratórios de Produção e Tecnologia de Sementes e Fitopatologia do Departamento de Fitotecnia e Ambientais no Centro de Ciências Agrárias (CCA), Campus II, Universidade Federal de Paraíba (UFPB), Areia, Paraíba. Foram utilizadas sementes de cultivares de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.) BRS Gurguéia e Marataoã, cultivadas na Área Experimental do Centro de Tecnologia Agroalimentar (CCTA) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) no município de Pombal, Paraíba, com coordenadas geográficas de 6º48 16 S e 37º49 15 W. Os tratamentos foram constituídos por óleo de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf), plantas medicinais da família Meliaceae e Fabaceae, respectivamente, nas concentrações de 0% - Testemunha; 0,5%; 1,0% e 2,0% e, tratamento com fungicida Captana na dosagem de 240g do produto para 100 kg de sementes. Os óleos essenciais, adquiridos no Mercado Municipal de Campina Grande-PB, foram diluídos em água destilada esterilizada (ADE) contendo tween 80. As sementes foram imersas nos tratamentos por período de 5 minutos para posterior análise de sanidade e fisiologia das sementes. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

3 631 O método utilizado para a análise e identificação de fungos em sementes foi à incubação em substrato de papel filtro Blotter Test (Brasil, 2009). Foram utilizadas 200 sementes de cada cultivar por tratamento, as quais foram divididas em 10 repetições de 20 sementes cada. Posteriormente, as sementes foram distribuídas individualmente em condições assépticas, em placas de Petri (15 cm) sobre uma dupla camada de papel filtro esterilizados e umedecidos com ADE. As placas contendo as sementes foram mantidas por um período de dez dias à temperatura de 26 C ±2 C. Transcorrido este período, procedeu-se com a identificação dos fungos visualmente, com o auxílio de microscópio óptico e estereoscópico, sendo as estruturas comparadas com as descrições constantes na literatura (Barnett & Hunter, 1972; Menezes & Oliveira, 1993). Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de incidência de fungos. Para avaliar a influência dos óleos vegetais sobre a qualidade fisiológica das sementes de feijão macassar foram utilizadas 100 sementes por tratamento, distribuídas em quatro repetições de 25 sementes, e semeadas em substrato de papel Germitest umedecido com ADE à 2,5 vezes o peso do papel seco e distribuídos em câmera de germinação do tipo Biochemical Oxigen Demand (B.O.D.) regulada à 30 C e fotoperíodo de oito horas. Após o semeio, os rolos foram acondicionados em sacos plásticos transparentes para evitar a perda de água por evaporação. Foram avaliadas as variáveis: germinação - contagens realizadas no 5 e 8 dia, contabilizandose na contagem final a porcentagem de plântulas normais (plântulas com raiz primária longa, delgada e revestida por pêlos absorventes ao longo de toda a superfície); primeira contagem de germinação - conduzida conjuntamente com o teste de germinação, onde se computou as sementes germinadas no quinto dia após a semeadura; comprimento de plântulas realizado após o teste de germinação, com o auxílio de uma régua graduada, onde os resultados foram expressos em centímetros; e massa seca de plântulas - as plântulas foram colocadas em sacos de papel Kraft, e levadas para estufa com circulação forçada de ar à temperatura de 65ºC até a obtenção de peso constante. Decorrido esse período, foram pesadas em balança analítica com precisão de 0,001g, sendo os resultados expressos em g.plântula -1. Foram seguidas as prescrições das Regras para Análise de Sementes RAS (Brasil, 2009). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade, utilizando programa estatístico ASSISTAT (Silva, 2011). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os fungos identificados nas sementes não tratadas de feijão macassar cultivar BRS Gurgueia foram: Aspergillus flavus (28,7%), Aspergillus niger (20%), Fusarium sp. (14,6%), Penicillium spp. (12,6%), Cladosporium sp. (7,3%), Chaetomium sp. (4,6%), Botrytis sp. (3,7%), Periconia sp. (2,8%) e Rhizopus (1,8%). A alta incidência de Aspergillus sp. provavelmente se deve ao período, (aproximadamente 20 dias) e às condições de armazenamento TABELA 1. Incidência (%) de fungos em sementes de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.), cultivar BRS Gurgueia, tratadas com óleo de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf) Fungos Óleo de andiroba Óleo de copaíba Testemunha Fungicida Concentrações (%) 0,5 1,0 2,0 0,5 1,0 2,0 A. flavus 20,1a 19,1ab 22,0a 18,5ab 17,6ab 25,7a 28,7a 5,0b A. niger 17,4a 15,9a 22,4a 25,9a 16,2a 21,1a 20,0a 2,2b Fusarium sp. 6,3ab 6,3ab 5,8ab 8,6ab 5,9ab 7,1ab 14,6a 1,8b Penicillium spp. 16,7a 18,3a 20,3a 11,1ab 16,7a 23,1a 12,6ab 1,8b Cladosporium sp. 5,4a 6,2a 5,0a 6,2a 4,4a 5,7a 7,3a 0,9a Chaetomium sp. 2,2a 3,7a 2,2a 3,7a 2,8a 5,7a 4,6a 0,0a Botrytis sp. 0,9ab 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 3,7a 0,0b Periconia sp. 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 2,8a 0,0b Rhizopus 0,0a 0,9a 3,2a 2,2a 4,4a 0,0a 1,8a 0,0a Médias com a mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

4 632 (temperatura ambiente) da semente que predispõe ao ataque destes fungos (Mondego et al., 2014). Em geral, por serem fungos de armazenamento, os mesmos causam deterioração das sementes, resultando na redução da germinação e vigor, apodrecimento, modificação da cor e enrugamento das sementes, além de produzirem micotoxinas que são tóxicas para homem, animais e plantas (Riverberi et al., 2010). Na Tabela 1, observa-se que, com exceção do gênero Botrytis sp. e Periconia sp., não foi verificado efeito significativo do óleo de andiroba e copaíba sobre o desenvolvimento dos demais fitopatógenos avaliados, em comparação com à testemunha. A utilização do fungicida Captana proporcionou menor incidência de A. flavus, A. niger, Penicillium spp., e Fusarium sp. Contudo, para este último constatou-se uma redução na porcentagem de incidência de 56,8, 56,8 e 60% nas sementes tratadas com óleo de andiroba e, de 41, 59,6 e 51,4% nas tratadas com óleo de copaíba, ambas nas concentrações 0,5; 1,0 e 2,0%, respectivamente, quando comparados com à testemunha, a qual não diferiu estatisticamente do tratamento fungicida (Tabela 1). Em sementes, o Fusarium spp., é também tido como responsável pela redução da germinação, descoloração, formação de manchas, apodrecimentos, mofos e alterações bioquímicas (Gomes et al., 2008). É responsável por causar doenças como a podridão do colo e raízes, altamente prejudicial ao feijão macassar, uma vez que reduz drasticamente a produção (Silva et al., 2014). Verificou-se aumento da incidência de A. niger e Rhizopus sp. com o uso da maior concentração do óleo de andiroba (2%), e do Chaetomium sp. com óleo de copaíba (2%). Quanto ao gênero Penicillium sp., com exceção da menor concentração do óleo de copaíba (0,5%), houve aumento da incidência destes fungos em todas as demais concentrações dos óleos testados, em comparação à testemunha (Tabela 1). Resultados divergentes foram relatados por Mondego et al. (2014), onde os pesquisadores verificaram que o óleo de copaíba, na concentração de 1%, foi eficiente no controle de Aspergillus sp. em sementes de Pseudobombax marginatum. Da mesma maneira, Deus et al. (2011) evidenciaram um efeito inibitório do óleo essencial de copaíba, na concentração de 0,08 mg ml -1, sobre o crescimento de Aspergillus spp. Para Periconia sp., independentemente do óleo essencial e concentração utilizados, observouse um efeito fungitóxico sobre o fungo, não diferindo do tratamento fungicida, sugerindo assim, que os óleos essenciais podem substituir eficientemente o fungicida no controle deste fungo (Tabela 1). Quanto ao Botrytis sp., verificou-se que, com exceção da menor concentração do óleo de andiroba (0,5%), as concentrações utilizadas dos óleos essenciais inibiram o desenvolvimento do fungo, as quais não diferiram do tratamento fungicida, o que permite recomendar o tratamento das sementes com estes óleos no controle do referido fungo (Tabela 1). Nas sementes não tratadas da cultivar Marataoã foram identificados os seguintes fungos: Fusarium sp. (22,2%), Cladosporium sp. (20,1%), Aspergillus flavus (16,3%), Penicillium sp. (8,9%), Aspergillus niger (8,9%) e Curvularia sp. (3,2%). Pelos resultados, verificou-se um efeito significativo da aplicação dos óleos essenciais sobre a incidência dos gêneros Cladosporium sp. e Fusarium sp. nas sementes de feijão macassar (Tabela 2). Observou-se uma redução de 35 e 41% da incidência de A. flavus quando utilizadas a menor (0,5%) e maior (2%) concentração do óleo de TABELA 2. Incidência (%) de fungos em sementes feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.), cultivar Marataoã, tratadas com óleo de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf) Fungos Óleo de andiroba Óleo de copaíba Testemunha Fungicida Concentrações (%) 0,5 1,0 2,0 0,5 1,0 2,0 A. flavus 10,5ab 16,2a 9,6ab 17,7a 21,7a 21,5a 16,3a 1,8b A. niger 5,5a 5,8a 4,5a 8,4a 7,8a 9,6a 8,9a 0,0a Fusarium sp. 7,8b 3,0b 6,7b 5,0b 3,5b 3,5b 22,2a 2,8b Penicillium spp. 10,3a 4,8a 7,3a 8,3a 9,0a 5,5a 8,9a 2,8a Cladosporium sp. 11,6ab 7,3bc 9,4bc 5,7bc 5,0bc 4,4bc 20,1a 0,0b Chaetomium sp. 1,8a 0,0a 0,9a 0,9a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a Curvularia sp. 1,8a 2,2a 1,3a 0,0a 0,0a 1,8a 3,2a 0,0a Médias com a mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

5 633 andiroba, em comparação à testemunha, as quais não diferiram entre si e do tratamento fungicida aplicado. Independentemente da concentração do óleo de copaíba, foi verificado um aumento na incidência deste fungo nas sementes tratadas da cultivar Marataoã (Tabela 2). Para o gênero Cladosporium sp., a utilização da maior concentração (2%) do óleo de copaíba proporcionou a menor incidência, com valores de 4,4%, o que representou uma redução aproximada de 78%, em comparação à testemunha. Vale ressaltar que não houve diferença significativa entre as concentrações testadas e o tratamento com fungicida (Tabela 2). Quanto ao gênero Fusarium sp., independentemente do óleo essencial e das concentrações testadas, observou-se redução da incidência do fungo, sendo registrada maior redução (86,5%) quando utilizou-se a concentração de 1% do óleo de andiroba, além disso, as concentrações testadas não diferiram do tratamento fungicida, podendo assim, tanto o óleo de andiroba como o copaíba serem alternativas eficientes ao controle deste patógeno em sementes de feijão macassar cv. Marataoã (Tabela 2). Trabalhos com óleos de copaíba e andiroba têm sido realizados e resultados promissores foram obtidos. Ishida et al. (2008) avaliando o efeito de óleos essenciais de diferentes espécies de copaíba, extraídos de diversas partes da planta, verificaram o potencial destes em inibir o crescimento micelial de Fusarium solani f. sp. piperis, agente causal da podridão do pé e das raízes em plantas de pimenta-do-reino. Em pesquisa realizada por Sousa et al. (2012), testando óleos essenciais de plantas medicinais como uma alternativa de controle de Colletotrichum gloeosporioides em pimenta, constataram que os óleos de andiroba e copaíba, na concentração de 1,0%, proporcionaram redução do crescimento do fungo em aproximadamente 20 e 50%, respectivamente. Os óleos essenciais não influenciaram significativamente a qualidade fisiológica (primeira contagem de germinação, germinação, índice de velocidade de germinação) das sementes de BRS Gurgueia e Marataoã. Resultados semelhantes foram relatados em trabalho com as mesmas concentrações de óleo de copaíba em sementes de Pseudobombax marginatum por Mondego et al. (2014), no qual os autores observaram que o óleo essencial não interferiu negativamente na qualidade fisiológica das sementes. Quanto ao comprimento da parte aérea e da raiz das plântulas das cultivares de feijão macassar, não foi observado efeito significativo da aplicação dos óleos essenciais. Para a massa seca da parte aérea (MSPA), verificou-se uma diferença significativa para o óleo de andiroba na menor concentração (0,5%), em comparação ao tratamento fungicida para as cultivares de feijão macassar. Em ambas as cultivares, quando se comparou com a testemunha não se observou diferença entre os tratamentos empregados. Apesar disso, verificou-se aumento da MSPA com aplicação do óleo essencial em ambas as cultivares (Figura 1). Não foi constatada resposta significativa na MSPA para o óleo de copaíba em nenhuma das concentrações utilizadas, assim como para o fungicida em ambas as cultivares de feijão macassar. MSPA (g.plântula -1 ) a ab a ab ab ab ab b b Óleo de andiroba (%) FIGURA 1. Massa seca da parte aérea (MSPA) de cultivares de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.) submetidas a diferentes concentrações de óleo essencial de andiroba (Carapa guianensis Aubl.). Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste Tukey à 5% de probabilidade. Em relação a massa seca da raiz (MSRA), houve efeito significativo para BRS Gurgueia com a aplicação dos óleos essenciais. A aplicação da menor concentração (0,5%) dos óleos resultaram em menor MSRA (0,019 g.plântula -1 ), os quais diferiram dos demais tratamentos empregados (Figura 2). Em trabalho conduzido por Brito et al. (2012), por sua vez, foi verificado que a parte aérea e massa seca (aérea e radicular) das plântulas de milho foram afetadas com a aplicação dos óleos de citronela, eucalipto e composto citronelal, nas concentrações de 15%. CONCLUSÃO Nas sementes não tratadas das cultivares BRS Gurgueia e Marataoã foi observada maior incidência de Aspergillus flavus e Fusarium sp. O uso dos óleos de andiroba e copaíba reduziram a incidência dos fungos Botrytis sp. e a Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

6 634 MSRA (g.plântula -1 ) b b c c ab ab b b a a Concentração dos óleos essenciais (%) FIGURA 2. Massa seca da raiz (MSRA) da cultivar BRS Gurgueia de feijão macassar (Vigna unguiculata L. Walp.) submetida a diferentes concentrações de óleo de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e copaíba (Copaifera langsdorffi Desf). Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste Tukey à 5% de probabilidade. Periconia sp. na BRS Gurgueia e, Cladosporium sp. e Fusarium sp. na Marataoã. A aplicação dos óleos de andiroba e copaíba não interferiu na qualidade fisiológica das sementes das cultivares de feijão macassar. REFERÊNCIAS BARNETT, H.L.; HUNTER, B.B. Illustred genera of imperfect fungi. 3. ed. Minneapolis: Burgess Publishing Company, p. BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Regras para análise de sementes. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Brasília: MAPA/ACS, p. BRITO, D.R. et al. Efeito dos óleos de citronela, eucalipto e composto citronelal sobre micoflora e desenvolvimento de plantas de milho. Journal of Biotechnology and Biodiversity, v.4, n.3, p , DEUS, R.J.A. et al. Avaliação do efeito antifúngico do óleo resina e do óleo essencial de copaíba (Copaifera multijuga Hayne). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.13, n.1, p.1-7, FERNANDES, L.C.B. et al. Fungitoxicidade dos extratos vegetais e do óleo essencial de Lippia gracilis Schauer sobre o fungo Monosporascus cannonballus Pollack e Uecker. Summa Phytopathologica, v.41, n.2, p , FLÁVIO, N.S.D.S. et al. Qualidade sanitária e fisiológica de sementes de sorgo tratadas com extratos aquosos e óleos essenciais. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v.35, n.1, p.7-20, FONSECA, M.C.M. et al. Potencial de óleos essenciais de plantas medicinais no controle de fitopatógenos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 17, n. 1, p.45-50, FREIRE FILHO, F.R. et al. Melhoramento genético. In: FREIRE FILHO, F.R.; LIMA, J.A. A.; RIBEIRO, V.Q. (Ed.). Feijão-caupi: avanços tecnológicos. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica; Teresina: Embrapa Meio-Norte, p FREIRE FILHO, F.R. et al. Feijão-caupi no Brasil: produção, melhoramento genético, avanços e desafios. Teresina: Embrapa Meio-Norte, p. GOMES, D.P. et al. Qualidade fisiológica e incidência de fungos em sementes de feijão caupi produzidas do estado do Ceará. Revista Caatinga, Mossoró, v.21, n.2, p , GONÇALVES, G.G.; MATTOS, L.P.V.; MORAIS, L.A.S. Óleos essenciais e extratos vegetais no controle de fitopatógenos de grãos de soja. Horticultura Brasileira, v.27, n.2, p , HILLEN, T. et al. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais no controle de alguns fitopatógenos fúngicos in vitro e no tratamento de sementes. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.14, n.3, p , HOYOS, J.M.A. et al. Antifungal activity and ultrastructural alterations in Pseudocercospora griseola treated with essential oils. Ciência e Agrotecnologia, v.36, n.3, p , ISHIDA, A.K.N. et al. Atividade antifúngica de óleos essenciais de espécies de Copaifera sobre Fusarium solani f. sp. piperis Albuquerque. In: Congresso Brasileiro de Defensivos Agrícolas Naturais, 6., 2008, Belém. Anais... Belém: Embrapa Amazônia Oriental, p.47. MACHADO, J.C. Patologia de Sementes: Significado e Atribuições. In: CARVALHO, N.M.; NAKAGAWA, J. Sementes: Ciências, Tecnologia e Produção. Jaboticabal: Funep, p MENEZES, M.; OLIVEIRA S.M.A. Fungos fitopatogênicos. Recife: UFRPE, Imprensa Universitária; p. MONDEGO, J.M. et al. Controle alternativo da microflora de sementes de Pseudobombax marginatum com óleo essencial de copaíba (Copaifera sp.). Bioscience Journal, v.30, n.2, p , RODRIGUES, E.A. et al. Potencial da planta medicinal Ocimum gratissimum no controle de Bipolaris sorokiniana em sementes de trigo. Acta Scientiae Agronomy, v.28, n.2, p , RIVERBERI, M. et al. Natural functions of mycotoxins and control of their biosynthesis in fungi. Applied Microbiology and Biotechnology, v.87, p , SAROJ, A. et al. Anti-phytopathogenic activity of Syzygium cumini essential oil, hydrocarbon fractions and its novel constituents. Industrial Crops And Products, v.74, p , SILVA, F.A.S. Programa computacional ASSISTAT Assistência Estatística. Versão 7.5 beta. Campina Grande: UFCG, SILVA, A.C. et al. Effectiveness of essential oils in the treatment of Colletotrichum truncatum-infected soybean seeds. Tropical Plant Pathology, v.37, n.5, p ,2012. SILVA, G.C.; SANTOS, C.C.; GOMES, D.P. Incidência Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

7 635 de fungos e germinação de sementes de feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp) tratadas com óleo de nim (Azadirachta indica A. Juss). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.16, n.4, p , SOUSA, R.M.S; SERRA, I.M.R.S; MELO, T.A. Efeito de óleos essenciais como alternativa no controle de Colletotrichum gloeosporioides, em pimenta. Summa Phytopathologica, v.38, n.1, p.42-47, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

8 636 Análises cromatográficas por HPLC-PDA e UPLC ESI-TqD-MS/MS de amostras comerciais de Camellia sinensis (L.) Kuntze ( chá verde ) SILVA, J.Z. 1 ; TANGERINA, M.M.P. 2 ; ROCHA, C.Q. 2 ; AMARAL, F.P. 3 ; BENTO, C.C. 1 ; TAHIRA, L.S. 1,2 ; VILEGAS, W.2 ; SANNOMIYA, M. 1* 1 Universidade de São Paulo, School of Arts, Science and Humanities, São Paulo-SP, Brasil; 2 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Campus of São Paulo Coast, São Vicente, Brasil; 3 Universidade Federal de Rondônia, Campus de Rolim de Moura, Rolim de Moura, Brasil. Autor para correspondência: miriamsan@usp.br RESUMO: As análises por HPLC-PDA, PCA e a injeção de padrões contribuíram consideravelmente para avaliação dos metabólitos secundários presentes em 4 amostras comerciais de Camellia sinensis. Todas as amostras analisadas, exceto a amostra de número 2 quando extraída em uma mistura de etanol e água, contém derivados de catequinas, ácidos fenólicos, metilxantinas e flavonoides, os quais são recorrentes na espécie em estudo. É possível que esta amostra de número 2 não se refira à espécie C. sinensis ou foi coletada em um período no qual os principais metabólitos não estavam sendo produzidos. A quantificação por UPLC-ESI- TqD -MS/MS do teor de cafeína nas amostras de C. sinensis mostraram que os valores obtidos neste trabalho variaram de 2,75 a 7,02 g/100g de extrato bruto. Além disso, todas as amostras analisadas apresentaram um maior teor de cafeína do que aqueles citados na literatura, exceto para a amostra de número 1. A análise por PCA dos íons totais das amostras mostrou que a infusão da amostra de número 3 apresentou-se bastante distinta das demais amostras. Estes dados permitem inferir que a cafeína pode ser um marcador taxonômico nas amostras de C. sinensis, porém a presença da mesma não deve ser conclusiva no controle de qualidade de uma planta medicinal, já que a composição total pode variar significativamente e, portanto, o seu consumo pode não exibir a mesma eficácia esperada. Palavras-chave: Camellia sinensis, HPLC-PDA, TLC, UPLC ESI- TqD -MS/MS ABSTRACT: HPLC-PDA and UPLC-ESI-TqD-MS/MS chromatographic analyses of commercial samples of Camellia sinensis (L.) Kuntze ( green tea ). The analysis by HPLC-PDA, PCA and the injection of standard compounds contributed considerably for the evaluation of the secondary metabolites of four commercial samples of Camellia sinensis. All analyzed samples, except sample number 2, when extracted with ethanol-water mixture, presented catechin derivatives, fenolic acids, methylxanthines and flavonoids, which are commonly found in the species under study. It is possible that sample number 2 does not correspond to C. sinensis or may have been collected in a specific time when the main metabolites were not being produced. Quantification by UPLC-ESI- TqD -MS/ MS of the caffeine content the samples of C. sinensis showed that the values obtained in this work vary between 2.72 to 7.02 g/100 g of crude extract. Moreover, all samples analyzed showed a higher content of caffeine than those previously reported in the literature, except sample number 1. Analysis by PCA of the total ions of the samples showed that sample number 3 infusion is quite different from the other samples. These data allow us to infer that caffeine can be a taxonomic marker in the samples of C. sinensis. However, its presence cannot be conclusive in the quality control of a medicinal plant, since the total composition of caffeine may vary significantly and, therefore, and its consumption may not provide the expected efficacy. Keywords: Camellia sinensis, HPLC-PDA, TLC, UPLC-ESI- TqD -MS/MS INTRODUÇÃO A utilização de plantas com fins medicinais é até hoje uma prática comumente adotada em países em desenvolvimento. No Brasil, a utilização de plantas medicinais como alternativa terapêutica é resultante da forte influência cultural dos indígenas, das tradições africanas e da cultura europeia trazida Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/2017 pelos colonizadores (Almeida, 2000). Ainda hoje em nosso país o poder medicinal do consumo e plantio de plantas medicinais se dá através do repasse dos conhecimentos populares de geração em geração. Diante desse quadro, a Organização Mundial da Saúde (OMS) possui uma política que visa estimular todos os países a incluírem em seus sistemas / X/0115 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

9 637 públicos de saúde práticas complementares e alternativas, como a fitoterapia, integradas às técnicas da medicina convencional. Seguindo essa recomendação, o Ministério da Saúde (MS) elaborou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, aprovada pelo Decreto nº (22 de junho de 2006), com a intenção de implantar a utilização das terapias complementares no Sistema Único de Saúde (SUS) e promover pesquisas com as plantas medicinais. Desta forma, permitirá a garantia do uso correto e seguro destas e de fitoterápicos (Brasil, 2006). O MS elaborou a Relação Nacional de Plantas de Interesse ao SUS (Renisus) em 2009, que apresenta uma lista de 71 plantas medicinais indicadas para uso terapêutico da população (Brasil, 2009). No entanto, vale ressaltar que algumas das plantas citadas nesta lista apresentam o efeito pelo qual a população rotineiramente utiliza, porém adicionalmente exibem efeitos colaterais indesejáveis, como é o caso da Maytenus ilicifolia, a qual possui efeito abortivo em ratas (Junior et al., 2005). Sem dúvida um dos agravantes com relação às plantas medicinais ou a fitoterapia em nosso país é com relação à sua comercialização, podendo ser encontradas tanto em farmácias, lojas de produtos naturais, bem como em feiras. A grande maioria destes produtos é desprovida de qualquer controle de qualidade. Em nosso país existem inúmeras espécies de plantas medicinais empregadas para os mais diferentes tipos de tratamentos. Através um levantamento bibliográfico, observou-se o intenso consumo de Camellia sinensis (L.) Kuntze (chá verde) pela população brasileira nos últimos anos. Alguns autores mencionam o uso do chá das folhas de C. sinensis para fins digestivos, bem como para a promoção da perda de peso e gordura corporal. Esta ação pode estar associada ao alto teor de flavonóides no extrato (Wolfram et al., 2006). Epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC) e epigalocatequina galato (EGCG) são os principais compostos presentes nos chás derivados de C. sinensis (Khan & Mukhtar, 2007). Todavia, as catequinas são mais abundantes nas folhas frescas e no chá verde. Este trabalho visou realizar análises cromatográficas por HPLC-PDA de extratos polares de diferentes amostras desta espécie de planta medicinal comercializadas no município de São Paulo, para uma averiguação da existência de uma padronização dos mesmos. Para tanto, foi também realizada a quantificação de cafeína nas amostras analisadas utilizando UPLC-ESI-TQ-MS/MS, a fim de constatar se as amostras comerciais apresentam níveis equivalentes do marcador taxonômico, e análise dos íons totais presentes nos extratos, avaliados por análise de componentes principais (PCA). MATERIAL E MÉTODOS Todas as análises cromatográficas por CCD foram realizadas utilizando-se placas de camada delgada de silica gel em suporte de alumínio (Merck, Aldrich ), sendo usados como reveladores: Anisaldeído/H 2 SO 4 e NP/PEG. Foram adquiridas 04 amostras de chá verde (C. sinensis) em diferentes pontos comerciais da cidade de São Paulo para as análises por HPLC- PDA de cada um destes produtos. Por questões éticas, os seus nomes comerciais não serão divulgados. Análises por HPLC-PDA A fim de traçar o perfil cromatográfico, 20 mg de cada extrato foram solubilizados em 2,0 ml, filtrados em cartucho SPE C18, filtrados em membrana de 0,22 μm e diluídos com MeOH/H 2 O 9:1 até obtenção de solução de concentração de 5 mg/ml. Tal procedimento foi necessário porque no extrato bruto há substâncias que adsorvem irreversivelmente em fase reversa C18 e, portanto, danificam a coluna de HPLC. As análises dos perfis cromatográficos dos extratos de C. sinensis foram realizadas por HPLC-PDA, Coluna Phenomenex Luna RP-18 (250 x 4,6mm i.d.; 4µm), fluxo 1,0 ml.min- 1, Solventes: A=H 2 O, B=MeOH, ambos com TFA 0,05%. Sistema de eluição gradiente linear 5-100% de B em 60 min (Figura 1). Foi usado um cromatógrafo líquido de alta eficiência (analítico, modelo PU-2089 (Jasco ), com detector de arranjo de foto diodos (HPLC-PDA) com faixa de varredura de nm e intervalo mínimo de 1 nm, modelo MD-2010 (Jasco ). Obtenção dos extratos das amostras de C. sinensis Para cada uma das quatro amostras analisadas foram atribuídos códigos de CV-1 a CV-4. Para a preparação da cromatografia, de cada amostra comercial foram pesados 2,0 g. O material vegetal da amostra CV-3 foi submetido a três processos de extração diferentes, infusão por cerca de 30 min em água quente, maceração em etanol puro e em uma mistura de etanol e água 70%. As amostras CV-1, CV-2 e CV-4 foram submetidas ao processo de maceração em etanol puro. Em seguida, os materiais vegetais foram filtrados e os extratos foram transferidos para vidros individuais previamente rotulados e tarados. Em seguida, os extratos de C. sinensis foram levados à secura em chapa de aquecimento, mantida à Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

10 638 temperatura constante de 40 C. Quantificação por UPLC-ESI-MS/MS A quantificação foi realizada em sistema de UPLC Waters Acquity (Waters Corp., Milford, MA, USA), consistindo de bomba quaternária, amostrador automático e espectrômetro de massas XevoTqD equipado com fonte de ionização por eletro-spray (tipo Zspray) e analisador triploquadrupolo. Os parâmetros da fonte foram ajustados como segue: fluxo do gás de dessolvatação a 400 L/h, temperatura de dessolvatação a 200 C, fluxo de gás do cone a 50 L/h e temperatura da fonte a 150 C. A voltagem do capilar foi ajustada em 3,03 V e a voltagem do cone em 40 V. A detecção da cafeína foi realizada através de multiple reaction monitoring (MRM), pela transição 195>138. Os dados foram adquiridos monitorando os íons pai e filho simultaneamente. Foi utilizada coluna Waters Acquity XBridge TM BEH C18 2,5 µm, 2,1x100 mm XP com fase móvel consistindo de A e B (metanol), em sistema gradiente: 0 2 min, 5 100% A, fluxo de 0,4 ml/min. A coluna foi equilibrada por 2 minutos antes de cada injeção. A temperatura da coluna e o volume de injeção foram ajustados para 30 C e 10 μl, respectivamente. Todas as análises foram realizadas utilizando o software MassLynx. Preparação de amostras e curva de calibração Foi realizado o clean-up dos extratos das amostras comerciais de Camelia sinensis em cartucho de SPE Strata C18 Phenomenex. Os cartuchos foram ativados com MeOH (10,0mL), condicionados com mistura de MeOH/H 2 O 8:2 e os extratos filtrados através dos cartuchos solubilizados na mesma mistura de solventes. Por fim, os extratos foram secos, dissolvidos a uma concentração conhecida, filtrados e diluídos a uma concentração de 20 ppm. A quantificação foi realizada pelo método do padrão externo, sendo construída uma curva de calibração com as concentrações de cafeína de 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 8,0 ppm, em triplicata, e regressão linear. O valor encontrado para as amostras foi extrapolado na curva de calibração para a obtenção da concentração de cafeína. Os limites superior e inferior de quantificação foram determinados. Efeito de matriz e recuperação O efeito de matriz foi determinado pela comparação entre a área do pico do analito nas amostras (A) e nas amostras adicionadas de uma concentração conhecida de padrão (B). Assim, os extratos com e sem adição de padrão foram injetados nas mesmas condições cromatográficas e de ionização, em triplicata. Foi então calculada a razão (B/A x 100) %, a qual deve estar entre 85% e 100%, este intervalo sendo considerável aceitável de acordo com a ANVISA. A recuperação da cafeína foi determinada pela comparação da área dos picos das amostras antes e depois de realizar o procedimento de extração em fase sólida, com este valor devendo estar entre 98% e 102% (Ermer & Miller, 2005). Análise dos principais Componentes (PCA) para as amostras de C. sinensis A fim de analisar os dados dos metabólitos, visando sua redução, eliminação de sobreposições e a escolha mais representativa em C. sinensis, através de combinações lineares das variáveis originais as amostras foram analisadas em um sistema de UPLC Waters Acquity (Waters Corp., Milford, MA, USA), consistindo de bomba quaternária, amostrador automático e espectrômetro de massas XevoTqD equipado com fonte de ionização por eletrospray e analisador triploquadrupolo e os dados gerados foram processados pelo Software Markerlynx XS gerando uma matriz contendo a massa dos compostos (identificação), seu tempo de retenção e intensidade (quantificação). Os dados foram analisados estatisticamente por meio de PCA (Principal Component Analysis), o Trend Plot e o S-Plot. (Waters Corporation USA). RESULTADOS E DISCUSSÃO As amostras selecionadas para este estudo foram adquiridas em 04 estabelecimentos do município de São Paulo. O material vegetal da amostra CV-3 foi submetido a três processos de extração diferentes: infusão, maceração em etanol puro e em uma mistura de etanol e água 70%. De acordo com a Tabela 1, observa-se um maior rendimento para utilização do método de infusão em água, seguido da maceração na mistura de água/etanol 70% e, finalmente, em etanol puro. Perfil Cromatográfico por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (TLC) A partir das análises por TLC das 04 amostras comerciais de C. sinensis observou-se que a constituição química era bastante similar, exceto no que diz respeito à presença de clorofila quando se emprega etanol como solvente extrator. Como o perfil químico avaliado por TLC mostrou um perfil químico similar nos diferentes tipos de extração e que a inclusão de água poderia acarretar a proliferação de fungos, optou-se pela execução de extrações por maceração em etanol puro. De acordo com a literatura a composição Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

11 639 TABELA 1. Rendimento de cada extrato obtido das amostras de Camellia sinensis. Amostras Identificação Rendimento da extração (g) 3 CV-3 infusão 0,88 g (4,4%) 3 CV-3 hidroetanólica 0,86 g (4,3%) 3 CV-3 etanol 0,45 g (2,25%) 1 CV-1 etanol 0,66 g (3,3 %) 2 CV-2 etanol 0,48 g (2,4%) 4 CV-4 etanol 0,64 g (3,2%) química de C. sinensis inclui principalmente as classes de compostos fenólicos ou flavonóides, tais como flavonóis e ácidos fenólicos, além de metilxantinas como cafeína e teobromina (Liang et al., 1990; Lee et al., 2014). Os principais flavanóis presentes no chá verde são os monômeros de catequinas. As catequinas do chá verde incluem, por exemplo, catequina (C), galocatequina (GC), epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC), epicatequina galato (ECG) e epigalocatequina galato (EGCG). A EGCG corresponde a mais abundante catequina do chá verde (50-60%). De acordo com Yanagimoto (2003) o teor de catequinas no vegetal depende de alguns fatores externos, tais como forma do processamento das folhas antes da secagem, localização geográfica do plantio e condições de cultivo. Assim, neste estudo foram realizadas análises por TLC dos 04 extratos das amostras de C. sinensis juntamente com padrões de compostos pertencentes à classe dos ácidos fenólicos, flavonoides e catequinas contidos em nosso em laboratório. Dentre os flavonoides utilizaram-se os flavonóis quercetina e rutina, para os ácidos fenólicos foram empregados o ácido gálico e seu derivado galato de metila e das catequinas, optouse pela (+)-catequina. Foram testadas diferentes fases móveis até obter a melhor separação em sílica gel, Clorofórmio/Metanol/H 2 O 65:35:10 (v/v/v). As placas cromatográficas apresentaram substâncias reveláveis em anisaldeído sulfúrico e NP/PEG na forma de spots com coloração amarela com Rf 0,2 e 0,8, sugerindo a presença de flavonóides (Wagner et al., 1984). Nas análises por TLC das amostras de C. sinensis juntamente como padrões de ácido gálico, galato de metila, (+)-catequina, quercetina e rutina após revelação em iodo, ultravioleta, anisaldeído e NP/PEG, sugere-se por valores de Rf e coloração dos constituintes, a presença minoritária de quercetina, ácido gálico e rutina, nestas amostras analisadas. Para uma avaliação mais precisa e criteriosa dos extratos de C. sinensis, optou-se pela análise por HPLC-PDA. A fim de poder estabelecer comparações com relação às concentrações dos constituintes químicos presentes nos extratos, o modo de preparo dos extratos foi idêntico. Durante o processo de obtenção dos mesmos, estes foram submetidos ao mesmo procedimento de cleanup, nas mesmas condições cromatográficas e no mesmo comprimento de onda. Assim, na extração da amostra CV-3 em mistura de etanol 70% (CV-3 hidroetanólico) há um aumento na concentração dos metabólitos de tempo de retenção de 5,34 e 6,74 min. Na extração em água (CV-3 infusão), tem-se a extração do pico de T R 5,41 min, o qual não é observado nos demais solventes de extração. Nas amostras CV-3, CV-2 e CV-4 extraídas em etanol puro observam-se que os constituintes majoritários destas se referem aqueles de T R de 5,34 e 5,04 min. A amostra CV-2 extraída em etanol puro (CV-2 etanol) é aquela que mais difere das demais amostras de C. sinensis, tendo a predominância de um constituinte de T R 5,06 min. Este perfil cromatográfico sugere que esta amostra não se trate de um extrato referente à C. sinensis como as demais ou que difere por questões sazonais. É sabido que existe uma variação na concentração dos metabólitos secundários de uma planta a cerca do dia, do ano ou condições climáticas (Estiarte et al., 1999). As análises dos cromatogramas das amostras de C. sinensis permitem a comparação dos metabólitos secundários através dos diferentes T R, os quais podem ser melhores visualizados através da Tabela 2. É possível observar através dos espectros de ultravioleta extraídos de cada cromatograma, a presença de derivados de ácidos fenólicos através das bandas intensas nas faixas espectrais de e nm (Michelin, 2008). Adicionalmente são detectadas as catequinas monoméricas e oligoméricas (taninos condensados ou proantocianidinas), as quais podem ser identificadas através da banda fraca em torno de 280 nm, um ombro próximo de 220 nm e máximo entre nm (Rohr et al., 2000; Wang & Helliwell, 2000). Além destes metabólitos secundários, detectamse também 03 flavonóis através dos espectros na região do UV, os quais apresentaram duas bandas de absorção, uma na faixa de nm (banda II) e outra na faixa de nm (banda I) (Mabry, 1970). Na detecção da presença da metilxantina, cafeína é permitida através da presença de um limite máximo de absorção no UV entre os comprimentos de onda de 271 e 275 nm (Holiday, 1930). A literatura relata a existência de quercetina e ácido gálico em extratos de C. sinensis e as análises realizadas por TLC nos extratos das 04 amostras comerciais estudadas neste trabalho Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

12 640 RT: NL: 9.22E5 Total Scan PDA Miriam_Am ostra7 RT: NL: 9.11E5 Total Scan PDA Miriam_Am ostra uau uau RT: Time (min) CV-3 infusão NL: 1.23E6 Total Scan PDA Miriam_Am ostra Time (min) CV-3 hidroetanólico RT: NL: E5 Total Scan PDA Miriam_Am ostra uau uau Time (min) CV-3 etanol Time (min) RT: NL: 8.17E5 Total Scan PDA Miriam_Am ostra2 RT: CV-1 etanol NL: 1.14E6 Total Scan PDA Miriam_Am ostra uau uau Time (min) CV-2 etanol FIGURA 1. Análises cromatográficas dos extratos de C. sinensis por HPLC-PDA Time (min) CV-4 etanol também indicarem a presença dos mesmos (Chaturvedula & Prakash, 2011). No entanto, as injeções por HPLC-PDA e comparações dos espectros de UV de cada um dos picos presentes nos extratos, tem-se que estes não estão presentes nestas nas amostras. Estas análises mostram que apesar da cromatografia em camada delgada ser amplamente empregada para análise de extratos vegetais, esta técnica não pode ser conclusiva para a detecção de metabólitos secundários, mesmo com a utilização de padrões. Neste sentido, a análise por HPLC-PDA tornou-se fundamental para a avaliação das 04 amostras comerciais de C. sinensis indicando a presença de pelo menos 11 metabólitos dos quais os de T R em 3,13 e 4,33 min devem ser derivados de catequinas, os de T R 5,41, 5,69, 6,02 e 6,82 min são Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

13 641 TABELA 2. Comparação dos tempos de retenção T R das amostras de C. sinensis estudadas. Amostra Tempo de retenção de cada constituinte presente no extrato de C. sinensis (min) CV-3 infusão 4,32 5,01 5,35-5,62-5,96-6,74-7,11 7,92-8,77 CV-3 hidroetanólico 4,32 5,01 5,34-5,62-5,95-6,74-7,11 7,92-8,77 CV-3 etanol 4,38 5,05-5,41-5,69 6, ,82 7,19 8, CV-1 etanol 4,36 5,04 5,34-5, ,35 6,73-7,17-8,16 - CV-2 etanol 4,39 5,06-5,43-5, , CV-4 etanol 4,33 5,02 5,36-5, ,37 6,75-7,20 8, de ácidos fenólicos e de T R 7,16 min, T R 7,90 min e T R 8,17 min são pertencentes à classe de flavonoides. Quantificação da cafeína nas amostras comerciais A curva de calibração para a cafeína foi obtida (y =113832x ), R² = 0, Os limites inferior e superior de quantificação foram determinados como sendo 0,065 ppm e 64 ppm, respectivamente. Assim, os valores de cafeína encontrados nas amostras foram calculados (Tabela 3). A análise do efeito de matriz foi realizada e o valor obtido foi de 97,8% estando de acordo com os valores recomendados. O ensaio de recuperação indicou recuperação de 98,5%, também estando de acordo com os valores aceitáveis para esta análise. De acordo com Pivan e colaboradores (2014), as amostras de chá verde (Camellia sinensis) de supermercados italianos continham um teor de cafeína de 2,79-3,43 g/100 g (peso seco). Uma análise comparativa do teor de cafeína de 1,96 a 3,54 g/100g para extratos de folhas e de 1,39 a 1,5 g/100g em amostras comerciais (Oliveira, 2012). Na Tabela 3 pode-se observar que os valores obtidos neste trabalho variaram de 2,75 a 7,02 g/100g. Estes dados mostram um maior teor de cafeína do que aqueles encontrados na literatura, exceto para à amostra CV-1. A amostra CV-3 foi extraída por infusão, maceração em uma mistura hidroetanólica e outra em etanol puro para se estabelecer o melhor método extrativo. Observou-se um melhor rendimento quando se empregou etanol como solvente extrator para este tipo de metabólito secundário. Comparando-se o mesmo sistema de extração para as amostras CV-1 a CV-4, observouse um maior teor da cafeína na última amostra. A figura 2 mostra os resultados de massas compilados e temos tanto a exclusão dos erros usando o Trend-Plot quanto à identificação e quantificação de todos os compostos presentes, através do S-Plot nas amostras de C. sinesis, coletadas em diferentes locais de comercialização da cidade de São Paulo. Ressalta-se que as substâncias que compõe cada amostra não foram identificadas nessa análise. Foram avaliadas a presença ou ausência de agrupamentos, concluindo que a CV3 infusão está claramente distribuída em uma região diferente do mapa de metabólitos quando comparada com as demais amostras. A hipótese de ocorrência desse fato pode ser devido ao tipo de metabólitos secundários extraídos em água neste processo de extração e/ou a quantidade de metabólitos presentes. Estas análises nos permitem inferir que todas as amostras contêm a cafeína em sua constituição química. Porém, é importante quando se trata de uma planta medicinal estabelecer um criterioso controle de qualidade, já que a composição total pode variar significativamente e, portanto, o seu consumo pode não permitir a mesma eficácia esperada. REFERÊNCIAS ALMEIDA, M.Z. Plantas medicinais. 3.ed. Salvador: Editora da Universidade Federal da Bahia (Edufba) p. TABELA 3. Quantidades de cafeína encontradas nas amostras comerciais de Camelia sinensis. Amostra Média da área dos picos Quantidade em g/100g Quantidade em % CV-1 (etanólico) ,6667 1,10 2,75% CV-2 (etanólico) ,3333 1,94 4,85% CV-3 (etanólico) ,6667 2,61 6,52% CV-4 (etanólico) ,6667 2,81 7,02% CV-3 (infusão) ,3333 2,02 5,02% CV-3 (hidroetanólico) ,0000 2,04 5,10% Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

14 642 FIGURA 2. Scores plot dos íons totais das amostras de comerciais de C. sinensis analisadas por UPLC-ESI- TqD-MS/MS. BRASIL. ANVISA - Agencia Nacional de Vigilância Sanitária. Informe Técnico nº 45: Esclarecimentos sobre a regulamentação de chás. Portal ANVISA. 28 de dezembro BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Consulta pública nº 35, 12 de junho de Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brasília: 23 de julho de BRASIL. Ministério da Saúde. A Fitoterapia no SUS e o Programa de pesquisas de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de Assistência Farmacêutica e Insumos Estratégicos. Brasília. p BRASIL. Governo do Estado de São Paulo. Decreto n , de 19 de outubro de Aprova Normas Técnicas Especiais Relativas a Alimentos e Bebidas. Diário Oficial da República Federativa do Brasil. São Paulo: 1º de novembro CHATURVEDULA, V.S.P. & PRAKASH, I. The aroma, taste, color and bioactive constituents of tea. Journal of Medicinal Plants Research, v.5, n.11, p , ERMER, J. H. & MILLER, M.C.B. (Eds), Method validation in pharmaceutical analysis: A guide to best practice. Weinheim: Wiley-VCH, p. ESTIARTE, M. et al. Free-air CO2 enrichment of wheat: leaf flavonoid concentration throughout the growth cycle. Physiologia Plantarum, v.105, n.3, p , HOLIDAY, E.R. The characteristic absorption of ultra-violet radiation by certain purines. Biochemical Journal, v.24, n.3, p , JUNIOR, V.F.V.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas Medicinais: cura segura? Química Nova, v.28, n.3, p , KHAN, N. & MUKHTAR, H. Tea polyphenols for health promotion. Life Sciences, v.81, n.7, p , LEE, L-S.; KIM, S-H.; KIM, Y-B; KIM, Y-C. Quantitative analysis of major constituents in green tea with different plucking periods and their antioxidant activity. Molecules, v.19, , LIANG, Y.R.; LIU, Z.S.; XU, Y.R.; HU, Y.L. A study on chemical composition of two special green teas (Camellia sinensis). Journal of the Science of Food and Agriculture, v.53, n.4, p , MABRY, T.J.; MARKHAM, K.R.; THOMAS, M.B. The systematic identification of flavonoids. Berlin: Springer-Verlag, p. MAZZANTI, G. et al. Hepatotoxicity from green tea: a review of the literature and two unpublished cases. European Journal of Clinical Pharmacology, v.65, n.1, p , MICHELIN, D.C. Estudo químico-farmacológico de Operculina macrocarpa L. Urb. (CONVOLVULACEAE) p. Tese (Doutorado Área de concentração em Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos) Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Araraquara. PIOVAN, A.; FILIPPINI, R.; DALLA VECCHIA, F.; CANIATO, R. Comparative study of leaf morphology, phenolics and methylxanthines in Camellia sinensis teas from the Italian Market. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v.2, n.5, , OMICHELIN, D.C. Estudo químico-farmacológico de Operculina macrocarpa L. Urb. (CONVOLVULACEAE) p. Tese (Doutorado Área de concentração em Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos) Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Araraquara. PIOVAN, A.; FILIPPINI, R.; DALLA VECCHIA, F.; CANIATO, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

15 643 R. Comparative study of leaf morphology, phenolics and methylxanthines in Camellia sinensis teas from the Italian Market. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v.2, n.5, , OLIVEIRA, R.M.M. Quantification of catechins and caffeine from green tea (Camellia sinensis) infusions, extract, and ready-to-drink beverages. Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 32, n. 1, , ROHR, G.E.; MEIER, B.; STICHER, O. Evaluation of different detection modes for the analysis of procyanidins in leaves and flowers of Crataegus spp. Part I. Diode array and electrochemical detection. Phytochemical Analysis, v.11, n.2, p , TAVARES, C. & SAKATA, R.K. Cafeína para o tratamento de dor. Revista Brasileira de Anestesiologia, v.62, n.3, p , WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M. Plant Drug Analysis: a thin layer chromatography atlas. 2.ed. Berlin: Springer, p. WANG, H. & HELLIWELL, K. Epimerisation of catechins in green tea infusions. Food Chemistry, v.70, n.3, p , WOLFRAM, S.; WANG, Y.; THIELECKE, F. Antiobesity effects of green tea: form bedside to bench. Molecular Nutrition & Food Research, v.50, n.2, p , YANAGIMOTO, K. et. al. Antioxidative activities of volatile extracts from green tea, oolong tea, and black tea. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.51, n.25, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

16 644 Antimicrobial activity of Melaleuca alternifolia oil (tea tree oil) associated with calcium hydroxide GIONGO, M. 1 *; PRESTES, T.S. 1 ; VICTORINO, F.R. 1 1 Centro Universitário de Maringá - UNICESUMAR, Maringá, Paraná, Brasil; Autor para correspondência: maiara_giongo@hotmail.com ABSTRACT: The aim of the present work was to evaluate the antimicrobial activity in vitro of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) in association with calcium hydroxide against pre-cultured microorganisms such as Pseudomonas ruginosa, Enterococcus faecalis and Candida albicans, for use as a root canal dressing in Endodontics. Antibiograms were performed by Agar diffusion method in order to evaluate the susceptibility of the microorganisms mentioned. A standard antibiotic was used according to the sensibility of each group of microorganisms: Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis, chloramphenicol was used, and for Candida albicans, fluconazole solution 2%. At another point, a paste was manipulated with the association between Melaleuca alternifolia oil (TTO) and calcium hydroxide PA. In the new Petri plates containing culture environment and the innocuous, two wells were made of 6 mm in diameter, one was filled with calcium hydroxide paste and Melaleuca oil and the other with a paste composed of calcium carbonate and propylene glycol hydroxide (standard medication used in endodontic treatment). The diameter of the inhibition halo was measured in millimeters, using a transparent millimeter ruler. To analyze the results, they were submitted to analysis of variance ANOVA with a significance level of 5%. The pure TTO was more effective against Candida albicans, followed by Enterococcus faecalis and the hydroxide calcium paste + propylene glycol and hydroxide calcium+ Melaleuca oil were more effective against C. albicans and E. faecalis. The Melaleuca oil showed antifungal and antibacterial activity and can be used as a root canal dressing in endodontic treatment. Keywords: Calcium hydroxide, Intracanal medication, Melaleuca oil. RESUMO: Atividade antimicrobiana do óleo de Melaleuca alternifolia (óleo da árvore do chá) associada ao hidróxido de cálcio. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana, in vitro, do óleo de Melaleuca alternifolia (tea tree) em associação com o hidróxido de cálcio contra os microorganismos pré-cultivados: Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis e Candida albicans, para uso como curativo de demora em endodontia. Foi realizado um antibiograma, através do teste de difusão em Ágar, a fim de avaliar a susceptibilidade dos microorganismos citados. Foi utilizado um antimicrobiano padrão de acordo com a sensibilidade de cada grupo de microorganismos: para Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis foi utilizado cloranfenicol e para Candida albicans, solução de fluconazol 2%. Em outro momento, foi manipulada uma pasta com a associação entre o óleo de Melaleuca alternifólia (TTO) e o hidróxido de cálcio P.A. Em novas placas de Petri, contendo os meios de cultura e os inócuos, foram confeccionados dois poços de 6 mm de diâmetro, nos quais um foi preenchido com a pasta de Hidróxido de Cálcio e óleo de Melaleuca e o outro, com uma pasta formada de hidróxido de cálcio e propilenoglicol (medicação padrão utilizada no tratamento endodôntico). O diâmetro do halo de inibição foi mensurado em milímetros, empregando-se uma régua milimetrada transparente. Para análise dos resultados, os mesmos foram submetidos ao teste de Análise de Variância ANOVA com índice de significância de 5%. O TTO puro foi mais efetivo contra Candida albicans, seguida pelo Enterococcus faecalis, e a pasta de hidróxido de Cálcio + propilenoglicol e de hidróxido de cálcio + óleo de Melaleuca, foi mais eficaz contra a C. albicans e a E. faecalis. O óleo de Melaleuca demonstrou atividade antifúngica e antibacteriana, podendo ser utilizado como curativo de demora no tratamento endodôntico. Palavras-Chave: Hidróxido de Cálcio, Medicação Intracanal, Óleo de Melaleuca. Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0118 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

17 645 INTRODUCTION The infection of the root canal system occurs due to microorganisms capacity to colonize the dentinal tubules and the ramifications of the main canal, of which Gram positive and Gram negative bacteria, facultative aerobic or strict aerobic, as well as fungi and virus are the main agents (Barbosa et al., 1997). The microorganisms most commonly found in these cases were yeasts such as Candida albicans and facultatively anaerobic bacterium Gram-positive Enterococcus faecalis, particularly with regard to secondary infections and the development of root injuries (Carson et al., 2006; Cavalcanti et al., 2011; Cox et al., 2000). It is essential then, the use of a root canal dressing with antimicrobial property, as adjunctive therapy, in order to avoid remaining microorganisms, favoring tissue repair as a consequence. Calcium hydroxide is widely used as dressing for its excellent antimicrobial and biological properties. This is a base, whose properties are derived from their dissociation in calcium and hydroxyl ions that act on tissues stimulating repair by inducing mineralization and on microorganisms, removing them by enzymatic inactivation of the cells due to the alkalization of the environment, among others mechanisms (Gomes et al., 2003). However, this medication seems unable to decontaminate dentinal tubules infected with E. Faecalis (Hammer et al., 2008) and Candida albicans species (Lopes, 2004). Thus, alternatives must be searched to optimize the calcium hydroxide action in the disinfection of radicular canals (Mondello et al., 2003; Oliva et al., 2003). Natural medicinal products have been used in response to the increasing incidence of side effects associated with conventional drugs and the emergence of infectious processes resistance to antibiotics, disinfectants and synthetic germicides (Papadopoulos et al., 2006). Melaleuca alternifolia oil or tea tree oil (TTO) is a volatile essential oil obtained from Melaleuca alternifolia, a medicinal plant from Australia, commonly known as tea tree, blooming especially in marsh areas. TTO - tea tree oil - is of great medical importance because it has proven antibacterial and antifungal activity against several human pathogens and is used in topical formulations. It is extracted from the plant by hydrodistillation or distillation by dragging the steam (Roças et al., 2008). Currently, Melaleuca oil is used as antimicrobial agent or preventive and it is indicated to be used in injuries, burns, insect bites, acne, vaginal creams, skin creams, and even for teeth treatment (Siqueira et al., 2000). Because of the good antimicrobial activity and wide use in several medical specialties, the Melaleuca oil became also used in the dental field. Antifungal activity was demonstrated by some studies (Oliva et al., 2003; Siqueira et al., 1997). Valera et al. (2001) demonstrated the effectiveness of Melaleuca oil against E. faecalis and Papadopoulos et al. (2006) showed similar activity against P. aeruginosa. The aim of this study was to analyze the antimicrobial activity of Melaleuca alternifolia oil (tea tree) against Pseudomonas aeruginosa microorganisms, Enterococcus faecalis and Candida albicans and evaluate the antimicrobial activity of Melaleuca alternifolia oil (tea tree) associated with hydroxide calcium for use as a root canal dressing in endodontic treatment. MATERIAL AND METHODS The microorganisms susceptibility test was performed by Agar diffusion test using the following microorganisms: Pseudomonas aeruginosa (ATCC: 9027), Enterococcus faecalis (ATCC: 19433) and Candida albicans (ATCC: 10231). The Melaleuca oil and fluconazole were acquired in Medfórmula, a manipulation pharmacy in the city of Maringá-PR. According to the Certificate of Analysis of Melaleuca oil, it was extracted from leaves and twigs of Melaleuca aloternifol plant, with a density of g / ml, refraction, purity GC 40.3%, of Chinese origin. To this, Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis were grown in Brain Heart Infusion solution (BHI) and Candida albicans in a Sabouraud solution and incubated at 37 C for 48 h. Then, using 90X20 Petri plates the Muller Hinton Agar culture environment was prepared to inoculate Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis and Candida albicans, plates were prepared with Sabouraud agar, with volume enough to achieve a thickness of 5 mm. After environment solidification 0.1 ml of the microbial suspensions (0.5 of McFarland) were seeded in each plate with the help of the Swab in three directions: horizontal, vertical and diagonal to prevent the growth of isolated colonies. At first, in each Petri plate were deposited two sterile filter paper discs (4mm diameter): one impregnated with 0.2 ml of Melaleuca oil and the other impregnated with 0.2 ml of another standard antimicrobial according to sensitivity of each group of organisms: Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis and was used chloramphenicol and for Candida albicans, fluconazole solution 25%. The discs were placed equidistant to prevent coalescence of the inhibition halos. Subsequently, in new Petri plates were prepared in two wells on each agar plate using a sterile puncher for leather of 4 mm in diameter, in order to standardize the diameter of the hole. At the same time, a paste with calcium hydroxide 0.36 g of hydroxide calcium PA and 8 drops of propylene glycol were prepared, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

18 646 standard medication used in endodontic treatment. Another paste was prepared with the same amount of calcium hydroxide PA and 8 drops of Melaleuca oil, forming a sufficient amount to fill each well. With an insertion spatula, the wells were filled with respective pastes. The plates were incubated at 37 C for 48 h. Elapsed time, the petri plates were analyzed, and measured in millimeters of the inhibition halos of microbial growth formed on the agar. The result was determined by the arithmetic average of the inhibition halos. To analyze the results, they were submitted to the variance analysis ANOVA test followed by Tukey test at 5% significance level. The experiment was conducted, totaling 20 Petri plates for each microorganism. RESULTS AND DISCUSSION Data relating to the average diameter of the inhibition halos of fungal and bacterial growth front of the Melaleuca oil, are compiled and presented in Tables 1, 2 and 3. Figures 1, 2 and 3 show the inhibition halos in the different microorganisms. With the average of the diameters of inhibition halos for Candida albicans exposed in Table 1, our results showed a great inhibition halo for pure Melaleuca oil. With the combination of Melaleuca oil + Calcium Hydroxide PA there was a decrease in the diameter of the inhibition halo. However, remaining a significant halo, compared to standard medications (Calcium Hydroxide PA + propylene glicol) shown in Figure 1. As noted by Cox et al. (2000) and cited by Oliveira et al. (2011), Melaleuca oil show effective activity for Candida albicans due to the ability to break the membrane permeability barrier of the microorganisms which makes them to stop breathing. This feature was also observed by Hammer et al. (2004) that also found changes in the membrane properties of Candida albicans, initiated by the inhibition process, one explanation for the development of inhibition halo of the methodology in question. Compliance was also observed by Parcker (2007) where the Melaleuca oil showed fungistatic activity against C. albicans. In Table 2, referring to Enterococcus faecalis, it is possible to observe that the Melaleuca oil showed inhibition against the bacteria in question, confirming the results obtained by Cavalcanti et al. (2011) and May et al. (2000). It is important to note that the Melaleuca oil, the Calcium Hydroxide paste and the PA + Propylene Glycol and Calcium Hydroxide paste PA + Melaleuca oil showed the same pattern of inhibition on E. faecalis, however, the standard treatment, chloramphenicol, is significantly more effective. Hammer et al. (2008) concluded that Enterococcus faecalis from endodontic injuries had low resistance to Melaleuca oil. Another study evaluated the effect of Melaleuca oil in clinical samples from some bacteria, including E. faecalis, and found that, in less than 60 min, Melaleuca oil was able to inactivate all bacterias (May et al., 2000). In relation to P. aeruginosa, the association between the Melaleuca oil and calcium hydroxide showed a lower value of the inhibition halo, however, there was no significant difference between TTO and Propylene Glycol + Calcium Hydroxide. The chloramphenicol, on the other hand, was the most effective, as shown in Table 3 and Figure 3. Papadopoulos et TABLE 1. Mean diameters of the inhibition halos of Fluconazole, TTO, Propylene + Ca (OH) 2, and TTO + Ca (OH) 2 when applied in Candida albicans. TTO + Fluconazole TTO Propylene+ Ca(OH) 2 Ca(OH) 2 N Mean 7,40 b 10,05 a 6,70 b 9,35 a Standard Deviation 1,30 1,42 1,54 1,49 Error 0,41 0,45 0,48 0,47 * Statistically significant difference, p <0.05 TABLE 2. Mean diameters of the inhibition halos of chloramphenicol, TTO, Propylene + Ca (OH) 2, and TTO + Ca (OH) 2 when applied in Enterococcus faecalis. Chloramphenicol TTO Propylene+ Ca(OH) 2 TTO + Ca(OH) 2 N Mean 10,95 * 5,85 5,05 4,40 Standard Deviation 1,46 1,90 0,76 0,45 Error 0,46 0,60 0,24 0,14 * Statistically significant difference, p <0.05. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

19 647 FIGURE 1. Inhibition halo for Candida albicans against fluconazole (A) Melaleuca oil (B) and compared to Ca(OH)2 + Melaleuca oil (C) and Ca(OH)2 + propylene (D). FIGURE 2. Halo of inhibition for Enterococcus faecalis against chloramphenicol (A); Melaleuca Oil (B) and Ca (OH) 2 + propylene glycol (C) compared to Ca(OH) 2 + Melaleuca Oil (D). FIGURE 2. Halo of inhibition for Enterococcus faecalis against chloramphenicol (A); Melaleuca Oil (B) and Ca (OH) 2 + propylene glycol (C) compared to Ca(OH) 2 + Melaleuca Oil (D). al. (2006) found a low resistance in Pseudomonas aeruginosa treatment with Melaleuca oil. Moreover, in the study of May et al. (2000), resistance of P. aeruginosa was also tested against Melaleuca oil, where the bacteria had been inactivated in less than 60 min. Similarly, in a study cited by Parcker (2007), the effect of Melaleuca oil front P. aeruginosa resulted in a subtle inhibition halo, indicating a tolerance of Pseudomonas. Looking at Table 4, one can say that the pure Melaleuca oil was significantly more effective against Candida albicans, followed by Enterococcus faecalis and the paste formed by the association of calcium hydroxide and propylene glycol plus by TABLE 3. Mean diameters of the inhibition halos of chloramphenicol, TTO, Propylene + Ca (OH) 2, and TTO + Ca (OH) 2 when applied in Pseudomonas aeruginosa. Chloramphenicol TTO Propylene+ Ca(OH) 2 TTO + Ca(OH) 2 N Mean 14,20* 8,75 7,55 7,50 Standard Deviation 0,53 2,00 1,57 1,45 Error 0,17 0,63 0,49 0,45 * Statistically significant difference, p <0.05. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

20 648 FIGURE 3. Halo inhibition against Pseudomonas aeruginosa against chloramphenicol (A), Melaleuca Oil (B) and compared to Ca(OH)2 + propylene glycol (C) and Ca(OH)2 + Melaleuca oil (C). TABLE 4. Mean diameters of the inhibition halos of the TTO, Propylene + Ca (OH) 2, and TTO + Ca (OH) 2 when applied to Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis TTO Propylene+ Ca(OH) 2 TTO + Ca(OH )2 C.a. E.f. P.a. C.a. E.f. P.a. C.a. E.f. P.a. N Mean 10,05* 8,75 5,85 6,70 7,55 5,05* 9,35* 7,50* 4,40* Standard Deviation 1,42 2,00 1,90 1,54 1,57 0,76 1,49 1,45 0,45 Error 0,45 0,63 0,60 0,48 0,49 0,24 0,47 0,45 0,14 * Statistically significant difference, p <0.05. calcium hydroxide association + oil Melaleuca that were most effective against C. albicans and E. faecalis. CONCLUSION The oral microbiotic is related to the failure of endodontic treatment and the development of most pulp pathologies. Reducing these microorganisms suggests, therefore, control and prevention of these problems. In the present study, Melaleuca oil was shown to have antifungal and antibacterial activity, revealing itself as a good herbal option for use as a root canal dressing in endodontic treatment. REFERENCES BARBOSA, C.A.M. et al. Evaluation of the antibacterial activities of calcium hydroxide, chlorhexidine, and camphorated paramonochlorophenol as intracanal medicament. A clinical and laboratory study. Journal of Endodontics, v.23, n.5, p , CARSON, C.F. et al. Melaleuca alternifolia (tea tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clinical Microbiology Reviews, v.19, n.1, p , CAVALCANTI, Y.W. et al. Efeito inibitório dos óleos essenciais sobre microorganismos do canal radicular. Revista de Odontologia da UNESP, v.40, n.5, p , COX, S.D. et al. The mode of antimicrobial action of the essential oil Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Journal of Applied Microbiology, v. 88, p , GOMES, B.P.F.A. et al. Effectiveness of 2% chlorhexidine gel and calcium hydroxide against Enterococcus faecalis in bovine root dentine in vitro. Internacional Endodontic Journal, v.36, n.4, p , HAMMER, K.A. et al. Antifungal effects of melaleuca alternifolia (tea tree) oil and its components on Candida albicans, Candida glabrata and Saccharomyces cerevisiae. Journal Antimicrobial Chemotherapy, v.53, p , HAMMER, K.A. et al. Frequencies of resistance to melaleuca alternifolia (tea tree) oil and rifampicin in Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Snterococcus faecalis. International Journal of Antimicrobial agents, v. 32, p , LOPES, H.P.; SIQUEIRA, J.F.J. Endodontia: biologia e técnica. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan: ME- DSI, p. MAY, J. et al. Times-kill studies of tea tree olis on clinical isolates. Journal Antimicrobial Chemotherapy, v. 35, p , MONDELLO, F. et al. In vitro and in vivo activity of tea tree oil against azole-susceptible and-resistant human pathogenic yeasts. Journal Antimicrobial Chemothe- Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

21 649 rapy, v.5, p , OLIVA, B et al. Antimycotic activity of Melaleuca alternifolia essential oil and its major components. Letters in Applied Microbiology, v. 37, p , OLIVEIRA, A.C.M. et al. Emprego do óleo de Melaleuca alternófila Cheel (Myrtaceae) na odontologia: perspectivas quanto à utilização como antimicrobiano alternativo às doenças infecciosas de origem bucal. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.13, n.4, p , PAPADOPOULOS, C.J. et al. Susceptibility of Pseudomonas to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and components. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 58, p , PARCKER, J.F.; LUZ, M.M.S. Método para avaliação e pesquisa da atividade antimicrobiana de produtos de origem natural. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, n.1, p , RÔÇAS, I.N. et al. Microorganisms in root canal treated teeth from a german population. Journal of Endodontics, v. 34, p , SIQUEIRA, J.F.J. et al. Efeitos antibacterianos de um novo medicamento - o óleo ozonizado - comparados às pastas de hidróxido de cálcio. Revista Brasileira de Odontologia, v. 57, n.4, SIQUEIRA, J.F.J. et al. Intracanal medicaments: evaluation of the antibacterial effects of chlorhexidine, metronidazole, and calcium hydroxide associated with three vehicles. Journal of Endodontics, v.23, n.3, p , VALERA, M.C. et al. Effect of sodium hypoclorite and five intracanal medications on Candida albicans in root canals. Journal of Endodontics. v. 27, n.6, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

22 650 Antioxidant and antimicrobial potential of phenolic compounds extracted from leaves and flowers of Allamanda cathartica L. COELHO, H.A. 1 ; SILVEIRA, L.H.C. 1 ; ARAÚJO, J.H.B. de 1 *; KWIATKOWSKI, A. 2 1 Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR Campus Campo Mourão, PR-Brasil; 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso do Sul, MS-Brasil; *Autor para correspondencia: josehiltonbernardinodearaujo@gmail.com ABSTRACT: Species of Allamanda have been widely studied due to their pharmacological potential. This work aimed at determining the antioxidant and antimicrobial activity of leaves and flowers of Allamanda cathartica L. as well as identifying the phenolic compounds found in its extract. The antimicrobial capacity in vitro of the plant extract was evaluated on the following bacteria: Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Klebsiella sp., and fungi Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum. The bacterial susceptibility tests were carried out with disc diffusion in Müeller Hinton medium. The fungi evaluation was made with diffusion in PDA (Potato Dextrose Agar) and incubated for seven days at 25ºC. The leaves extract solution, at 0.02mg.mm -2 inhibited the growth of S. aureus and showed a zone of inhibition of 0.79cm, while the flowers extract solution showed a zone of 0.90cm. The zone of inhibition for E. coli was 0.79cm with the flowers extract and 0.92cm with the leaves extract. As for Klebsiella sp., the zone diameter was 1.04cm with the leaves extract and 0.80cm with the flowers extract. The negative control showed no antimicrobial activity. The zone of inhibition with amoxicillin was about 3.40cm for E. coli, 2.65cm for S. aureus and 2.40 cm for Klebsiella sp., at 0.02mg.mm -2. The lyophilized extract of leaves showed antifungal potential and it inhibited the fungi Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum completely. The extracts showed 90% of antioxidant activity and several phenolic compounds were identified, such as chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid and ferulic acid. Keywords: Allamanda cathartica L., antioxidant potential, antimicrobial potential. RESUMO: Potencial antioxidante e antimicrobiano de compostos fenólicos de extratos de folhas e flores de Allamanda cathartica L.. Espécies de Allamanda têm sido estudadas devido a sua atividade farmacológica. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade antioxidante, antimicrobiana e antifúngica, além de identificar os compostos fenólicos presente nos extratos de folhas e flores de Allamanda cathartica L. A capacidade antimicrobiana in vitro do extrato da planta foi testada em variedades de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Klebsiella sp e os fungos Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum. Os testes de susceptibilidade bacteriana foram realizados com difusão em disco com meio de cultivo Müeller Hinton. A avaliação fúngica foi realizada com difusão em meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar) e as placas incubadas por sete dias a 25 o C. A solução do extrato das folhas na concentração 0,02 mg.mm -2 inibiu o crescimento da S. aureus, com halo de inibição de 0,79 cm e 0,90 cm para o extrato das flores. O halo de inibição para o E. coli foi de 0,79 cm para as flores e 0,92 cm para as folhas, e para a Klebsiella sp., o diâmetro do halo foi de 1,04 cm para o extrato das folhas e 0,80 cm para as flores. O controle negativo não mostrou ação antimicrobiana. O halo de inibição usando amoxicilina foi em média de 3,40 cm para E. coli, de 2,65 cm para S. aureus, e de 2,40 cm para Klebsiella sp., na concentração de 0,02mg.mm -2. O extrato liofilizado das folhas apresentou atividade antifúngica inibindo completamente os fungos Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum. Os extratos apresentaram atividade antioxidante na faixa de 90%, e diversos compostos fenólicos foram identificados na sua composição, como ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido p-cumárico e o ácido ferrúlico. Palavras-chave: Allamanda cathartica L., potencial antioxidante, potencial antimicrobiano. Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0121 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

23 651 INTRODUCTION Knowing the phytotherapeutical applications and the physiology of vegetal species allows us to optimize the use of these active principles. According to Salvagnini et al. (2008), the use of medicinal plants has been supported by the World Health Organization, since it is a traditional practice that endures in several peoples around the world and benefits whoever applies these healing techniques. Several studies about native fruits (pulp, seed and peel), flowers and leaves are based on the determination of antioxidant and antimicrobial potential of phenolic compounds (Argolo et al., 2004., Kotzekidou et al., 2008; Kilani et al., 2008; Tung et al., 2009; Koochak et al;. 2010). Phenolic compounds are not considered nutrients on a daily diet and their benefits for human health are linked to the antioxidant effects they may provoke (Lee & Lee, 2010). Genus Allamanda belongs to Family Apocynaceae and comprises approximately 10 species (Schmidt, 2005). The object of this study, Allamanda cathartica L., is native from Brazil and other tropical areas, where they are known as Carolina, Dedal-de- -Dama, Alamanda Amarela or Trompete Dourado (Golden Trumpet). This plant is a latescent, semi- -ligneous vine and it grows mainly during Spring/ Summer. Despite being tropical, the plant tolerates cold climates. This bush may grow up to 2 or 3 m in height or length (Lorenzi & Souza, 2001). Allamanda cathartica L. has showed anti- -inflammatory effects, as well as cicatrizing (Nayak et al., 2006), anti-nociceptive and anti-neoplastic activity (Berri & Scarior, 2004). The responsible substance for the latter activity is named allamandina (Lorenzi & Matos, 2002). Otero et al. (2000) checked that the extract from leaves, stems and branches of Allamanda cathartica L. is able to neutralize the hemorrhagic effect provoked by the venom of Bothrops atrox (Lancehead) in doses of 4mg/rat. According to Sharma et al. (2009), plants show high quantities of phenolic compounds, which are strong natural antioxidants. Such compounds protect the organism against oxidative stress, neutralizing free radicals. They also play an important role in the plant growth and development, besides protecting it against injures and internal and external infections. According to Naczk & Shahidi (2004), phenolic compounds result from secondary metabolism in plants and they are processed under stressful conditions, such as infections, damages, injures and ultraviolet radiation. The main phenolic compounds are flavonoids and phenolic acids, which derive from cinnamic and benzoic acids (Kahkonen et al., 1999). The search for new antimicrobial agents of superior plants has been of great interest in the past few decades. This research area faces many problems due to several methodologies applied in the preparation of vegetal extracts and antimicrobial essays (Othman et al., 2011). The application of natural medicine has led the scientific community to investigate the healing potential of natural compounds. On the other hand, medicinal plants have been used incorrectly, due to the unawareness of their toxicity and of their adequate usage, therefore not producing the desired effect (Pereira et al., 2004). The sensitivity tests in vitro have not been applied frequently on fungi; however, they are extremely important in order to check the resistance of these microorganisms. Some fungi may be inoffensive, but some species bring risks to human health and losses to agricultural industries, since they release toxins that spoil some foods, such as wheat, rice, soy, peas, beans, corn, and others. There are still few studies on antioxidant and antimicrobial activity of Allamanda cathartica L. Thus, the current work aimed at determining the potential as antioxidant, antifungal and antibacterial of leaves and flowers of Allamanda cathartica L. as well as identifying the phenolic compounds found in its extract. MATERIAL AND METHODS The leaves and flowers of Allamanda cathartica L. were collected at Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), Campus Campo Mourão. The species was identified by the Herbarium at UTFPR, Campus Campo Mourão (HCF), where exsiccate was made and registered under voucher number 139. After the collection, the leaves and flowers were dried in hothouse with circulation of air regulated to a temperature of 45ºC for 1 h. After this period, the flowers and leaves were macerated and weighed to determine the extraction yield. To extract the active principles from them, ethanol 99.5% was used as a solvent. The ratio used for dilution was 1:3. The ethanolic extract was centrifuged to remove impurities. The supernatant was then removed and frozen for further analysis by HLPC chromatography (High Performance Liquid Chromatography). Before being injected in the device, the extract was unfrozen and a 1.0 ml-aliquot was taken from it and filtrated by a porous membrane, in order to determine its phenolic compounds. For antioxidant activity determination, three different concentrations of lyophilized extract from leaves and flowers of Allamanda cathartica L. were used (0.005 g/ml; 0.01 g/ml and 0.04 g/ml). Afterwards, they were diluted in methyl alcohol, homogenized and centrifuged. The lyophilized extract was diluted in ethanol 70% in order to obtain five different concentrations for the antimicrobial activity tests: 0.1; 0.5; 1.0; 1.5 and 2.0% (p/v). Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

24 652 Ethanol 70% (v/v) was used as control in the tests. For antifungal tests, the extracts were diluted in distilled water to obtain three different concentrations: 1.0; 1.5 and 2.0% (p/v) in addition to the control. For the High Performance Liquid Chromatography analysis, we used a Dionex Ultimate 3000 HPLC System (Dionex, Idstein, Germany), equipped with an Ultimate 3000 pump, an Ultimate 3000 Sample sharing column, an Ultimate 3000 photodiode detector and Chromeleon software to qualify and quantify the phenolic compounds. An Acclaim 120, C18 5 mm reversed-phase column (4.6 mm x 250 mm) was used to separate the phenolic compounds. The column was kept at 40ºC during the whole analysis and the detection was carried out using three wave-lengths (280, 300 and 320nm). The sample injection volume was 10.0 µl. The mobile phase (A) consisted of water acidified with phosphoric acid 1.0% and methanol phase (B). The elution of phenolic compounds was carried out by means of gradient between both mobile phases, where after 45 min the column was kept at 100% of mobile phase B for five minutes. After this period, phase (B) was gradually reduced to the initial injection conditions for column conditioning (95% A and 5% B), at an outflow of 1.0 ml/min. The standard values of galic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, rutin, catechin, miricetin, quercetin and kaempferol were used for identifying and quantifying phenolic compounds. The determination of the extracts antioxidant activity was carried out using a method of free radical DPPH capture. In order to prepare the DPPH solution (1,1-diphenil-2-picrilhidrazil), 2.4 mg of DPPH was dissolved into 100 ml of absolute methyl alcohol, which was homogenized and transferred to an amber flask, duly labeled. The determination of DPPH curve was made from the DPPH initial solution (60 µm), followed by dilutions with final concentrations of 1, 5, 10, 20, 30, 40 and 50 µm. Afterwards, a 3.5 ml-aliquot was transferred from each solution to small glass cubes and read by a spectrophotometer at 515nm. Methyl alcohol was used as white to calibrate the device. The reading results were R² = and y = Total antioxidant activity (AA) was evaluated using DPPH radical (1,1-diphenil-2-picrilhidrazil) in accordance with the method described by Mensor et al. (2001) with modifications, in which the reacting medium volume (extract diluted in absolute methyl alcohol + DPPH solution + absolute methyl alcohol) was 3.5 ml. For each extract concentration, flasks of 10mL were used containing 2.4 ml of absolute methyl alcohol, 1.0mL of DPPH solution (2.4 mg/100 ml) and a 0.1 ml-aliquot of the extract in its respective concentration. The tests were taken in duplicates. A blank test was carried out in parallel for each sample, in order to correct a possible contribution of the extract color. The test consisted of 0.1 ml of the extract and 3.4 ml of absolute methyl alcohol. The control was prepared mixing 1.0 ml of DPPH solution (2.4 ml/100 ml) with 2.5 ml of absolute methyl alcohol. After a period of 30 min of incubation in the dark, at room temperature, the absorbance values of the samples were registered in comparison to the white at 515nm. DPPH free radical inhibition (in %) was calculated using the following equation: AA% = [(Aa - Ab) x 100] / Ac Where: Aa = Sample absorbance Ab = White absorbance Ac = Control absorbance The bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Klebsiella sp., obtained at the Laboratory of Clinical Analyses São Gabriel, in the city of Campo Mourão (Paraná state, Brazil), were used for the antibacterial activity tests. The bacteria were conserved in Mueller Hinton medium and stored at 4ºC, during the weeks that preceded the study. Only one variety of each species was used in the tests. The bacteria were transplanted to essay tubes containing a nutritive broth and incubated in a bacteriologic hothouse for 24 h at 37ºC to reactivate. The fungi Aspergillus niger and Pennicilium chrysogenum, obtained at the Laboratory of Microbiology from UTFPR, Campus Campo Mourão, were used for the antifungal activity tests. These varieties were conserved in PDA (Potato Dextrose Agar) and stored in a refrigerator at 4ºC. Before taking the tests of antimicrobial activity of the plant s extract, it was necessary to prepare the propagation medium in vitro for the microorganisms used in the susceptibility tests. The cultivation medium was Mueller-Hinton agar, which was prepared under the guidelines given in the handbook Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos (Description of Cultivation Media Used in Microbiological Essays), written by the Brazilian National Health Surveillance Agency (Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 2004). The extracts antimicrobial activity was proven by the technique of paper disc diffusion, described by Kirby-Bauer s methodology, as cited by Okura and Rende (2008). In this methodology, the microorganism suspensions (duly diluted) were inserted into dishes containing the medium in solid phase. The dilution factors were adjusted to turbidity, in accordance with McFarland s 0.5 scale (10 8 UFC/mL). Afterwards, the bacteria were diluted 1:1000 for use in the antimicrobial activity essay, in accordance with the recommendations from the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997). Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

25 653 The paper discs, which had an area equivalent to 20mm², received 20 µl of extract solution, resulting in the concentrations 0.001mg.mm -2, 0.005mg.mm -2, 0.01mg.mm -2, 0.015mg.mm -2 and 0.02mg.mm -2, which were later applied to dishes and incubated at 37ºC, for 24 h. After the incubation period, visual readings were made to observe the zones of inhibition of bacterial growth. These zones were measured (in millimeters) with the aid of a pachymeter. Three independent essays were carried out for each of the three antimicrobial activity tests, i.e., three dishes for each extract concentration for each of the three tests taken. Amoxicillin solutions, obtained from Multilab Laboratories, were prepared at the same concentration as the leaves and flowers extracts and later dissolved into sterile distilled water, for positive control. In order to evaluate the antifungal activity of the lyophilized extract of Allamanda cathartica L. leaves, Auer and Bettiol (1986) (adapted) and Stangarlin et al. methods (1999) were used. The lyophilized extract was previously diluted into distilled water and later transferred to PDA medium (Potato-Dextrose-Agar) at the following concentrations: 1.0; 1.5 and 2.0 % (p/v). After one hour that the PDA medium was transferred to a Petri s dish, Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger spores were inoculated and later incubated at room temperature for seven days. The control treatments had only PDA. The tests were taken in triplicates and in two different steps to confirm the leaves extract potential. RESULTS AND DISCUSSION After drying, triturating and extracting the gross active principle from Allamanda cathartica L. leaves and flowers, the average extraction yields were determined. The obtained results were 18.21% for leaves lyophilized gross extract and 25.13% for flowers lyophilized extract, respectively. The phenolic compounds in Allamanda cathartica L. identified according to the standards available were chlorogenic acid, caffeic acid, p- -coumaric acid and ferulic acid. The concentrations of these compounds can be checked in Figure 1 for flowers, and in Figure 2 for leaves. The extract from Allamanda cathartica L. leaves showed a greater number of phenolic compounds than the flowers extract. According to the analyzed standards, it is verified that there is a higher concentration of chlorogenic acid. However, other phenolic compounds are present in the samples and in several non-identified substances, due to the fact that the column used was not provided with all the compounds standards. Figure 2 shows the apexes for leaves extract, which are high, especially at 27 min of retention. The antioxidant activity of Allamanda cathartica L. leaves and flowers extract can be checked in Table 1. From these results, it is possible to asseverate that leaves of A. cathartica show a high antioxidant potential (average value: 89.17%). As for flowers, the antioxidant activity values reached the apex of 87.19% of DPPH reduction, which are similar to the values found by Goes (2010), who found these values at a concentration of 10% of extract. However, given the results, it is possible to observe that the leaves extract shows a higher oxidant activity. TABLE 1. Antioxidant activity of extracts from leaves and flowers of Allamanda. cathartica L. Extract concentration AA (%) AA (%) (mg/ml) leaves flowers Mean value * AA Antioxidant activity The results here obtained highlighted the potential of microbial inhibition of the bacteria tested, according to the technique of disc diffusion towards the concentration of Allamanda cathartica L. extract. Observing the results, it is possible to verify that the higher the extract concentration, the wider the zones of inhibition. This observation indicates that the extract is efficient against the bacteria. The leaves extract had an average value of 1.04 cm at a concentration of 0.02 mg.mm -2 and the flowers extract had an average value of 0.80 cm at the same concentration for tests with Klebsiella sp. Upon such values, it is possible to notice that the leaves extract showed a better inhibition result. The leaves extract, once again, had bigger zones of inhibition on E. coli than the flowers extract, being that the average was 0.79 cm for the flowers and 0.92 cm for the leaves, at a concentration of 0.02 mg.mm -2. On the tests for S. aureus, it was observed that the average diameters of the zones were 0.90 cm for the flowers and 0.99 cm for the leaves, at a concentration of 0.02 mg.mm -2. The inhibitory effect was more evident for Klebsiella sp., i.e., the extract was more effective against this bacterium. After analyzing the inhibitory effects of the extract, essays were made in order to compare to the effects of amoxicillin, a commercially produced medicine responsible for the combat against S. aureus, E. coli and Klebsiella sp. The tests showed that E. coli was more sensitive to the medicine and had zones of inhibition of 3.4 cm, while S. aureus showed zones of inhibition with average diameter of 2.65 cm. As for Klebsiella sp., the average diameter of the zones of inhibition was 2.4 cm. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

26 654 The solution concentration was 0.02 mg.mm -2. After seven days of incubation, the Petri s dishes were removed for result analyses. The gross extract of Allamanda cathartica L. leaves, at the three different concentration, was efficient and inhibited completely the growth of Aspergillus niger and Pennicilium chrysogenum. When compared, the results show that amoxicillin has a higher inhibition potential, as its composition is specifically elaborated to treat these microorganisms. Furthermore, it is important to highlight that the commercial antibiotic is purified and specific for infections, while the leaves and flowers extracts are gross in comparison to it. Allamanda cathartica L. has showed itself a new phytotherapeutical source to combat these bacteria, since the extract application showed significant inhibitory effects when compared to the medicine. The current work has proven the antimicrobial activity in vitro of Allamanda cathartica L. extract against the microorganisms S. aureus, E. coli and Klebsiella sp. However, the use of this plant may have some toxicity, therefore, the concentration must be controlled, in order to avoid undesirable side effects. It has also proven that the plant extract is efficient against fungi A. niger and P. chrysogenum. Thus, our results have pointed out an effective antioxidant potential both for leaves and for flowers. This characteristic helps neutralize free radicals, which are harmful to human health. Furthermore, it was verified, by means of HLPC chromatography that these extracts have a great variety of phenolic compounds. Among them, the main ones are: chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid and ferulic acid, which are very important for metabolism and work as protective agents against undesirable oxidative reactions in the organism, and also against environmental effects and free radicals. Thus, with this work, we showed that A. cathartica L. presents a complex potential and that FIGURE 1. Chromatogram of the extract of the flowers of Allamanda cathartica L. in HPLC. FIGURE 2. Chromatogram of the extract of the leaves of Allamanda cathartica L. in HPLC. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

27 655 it can be very useful in the elaboration of new compounds for pharmaceutical and cosmetic industries. Both extracts (leaves and flowers) could be implemented to formulate new products, such as shampoos, hair conditioners, moisturizers, sun blockers, or nano-emulsified systems with appropriate physical and physicochemical characteristics for this type of system, as a vehicle for use in antioxidant skin care products (Müller, 2013). REFERENCES ARGOLO, A.C.C.; SANT ANA, A.E.G.; PLETSCH, M.; COELHO, L.C.B.B. Antioxidant activity of leaf extracts from Bauhinia monandra. Bioresource Technology, vol. 95, , AUER, C.G.; BETTIOL, W. Efeito da serapilheira de Eucalyptus grandis no crescimento micelial de Pisolithus tinctorius em meio de cultura. IPEF, n. 32, p.49-55, BERRI, A.; SCARIOT, M. Estudo da atividade antineoplásica do extrato da planta Allamanda cathartica L. e do ácido ursólico em camundongos p. Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso - Curso de Farmácia) - Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí. GOES, J.A. Preparações semissólidas contendo extrato de flores de Allamanda cathartica L. com potencial antioxidante e anti-inflamatório p. Dissertação (Mestrado Área de concentração em Ciências Farmaceuticas) Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí KAHKONEN, M.P.; HOPIA, A.I.; VUORELA, H.J.; HEINONEN, M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 47, n.10, p , KILANI, S.; SGHAIER, M.B.; LIMEM, I.; BOUHLEL, I.; BOUBAKER, J.; BHOURI, W.; SKANDRANI, I.; NEFFATTI, A.; AMMAR, R.B.; DIJOUX- FRANCA, M.G.; GHEDIRA, K.; CHEKIR-GHEDIRA, L. In vitro evaluation of antibacterial, antioxidant, cytotoxic and apoptotic activities of the tubers infusion and extracts of Cyperus rotundus. Bioresource Technology, v. 99, n.18, p , KOOCHAK, H.; SEYEDNEJAD, S.M.; MOTAMEDI, H. Preliminary study on the antibacterial activity of some medicinal plants of Khuzestan (Iran). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 3, n.3, p , KOTZEKIDOU, P.; GIANNAKIDIS, P.; BOULAMATSIS, A. Antimicrobial activity of some plant extracts and essential oils against foodborne pathogens in vitro and on the fate of inoculated pathogens in chocolate. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie - LWT, v. 41, n.1, p , LEE, O-H; LEE, B-Y Antioxidant and antimicrobial activities of individual and combined phenolics in Olea europaea leaf extract. Bioresource Technology, vol. 101, v.10, p , LORENZI, H., MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil Nativas e Exóticas. 2.ed. Nova Odessa, SP. Instituto Plantarum, p. LORENZI, H.; SOUZA, H.M. Plantas ornamentais no Brasil: arbustivas, herbáceas e trepadeiras. 3.ed. Nova Odessa: Plantarum, p. MENSOR, L.L.; MENEZES, F.S.; LEITÃO, G.G.; REIS, A.S.; SANTOS, T.C.; COUBE, C.S.; LEITÃO, S.G. Screnning of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytotherapy Research, v.15, n.2, p , MÜLLER, A.F.F. Desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados contendo extrato de flores de Allamanda cathartica L. para aplicação cosmética p. Dissertação (Mestrado Área de concentração em produtos naturais e substâncias bioativas Ciências Farmacêuticas) Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí. NACZK, M.; SHAHIDI, F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A, v. 1054, n.1-2, p , NAYAK, S.; NALABOTHU, P.; SANDIFORD, S.; BHOGADI, V.; ADOGWA. A. Evaluation of wound healing activity of Allamanda cathartica. L. and Laurus nobilis. L. extracts on rats. BMC Complement Altern. Med., v.6, n.12, 2004 NCCLS. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals. Tentative Standards. Waine: NCCLS, Document M31-T, 64p, OKURA, H.M; RENDE, J.C. Microbiologia: roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd, OTERO, R.; NUNEZ, V.; BARONA, J.; FONNEGRA, R.; JIMENEZ, S. L.; OSORIO, R. G.; SALDARRIAGA, M.; DIAZ, A. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Columbia. Part III: neutralization of the hemorrhagic effect of Bothrops atrox venom. Journal of Ethnopharmacology, v.73 n.1-2, p OTHMAN, M.; LOH, H.S.; WIART, C.; KHOO, T.J.; LIM, K.H.; TING, K.N. Optimal methods for evaluating antimicrobial activities from plant extracts. Journal of Microbiological Methods v. 84, n.2, p , PEREIRA, R. S.; SUMITA, C. S.; FURLAN, M. R.; JORGE, A. O. C.; UENO, M. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Rev. Saúde Pública, v. 38, n.2, p , SALVAGNINI, L.E.; OLIVEIRA, J.R.S.; SANTOS, L.E.; MOREIRA, R.R.D.; PIETRO, R.C.L.R. Avaliação da atividade antibacteriana de folhas de Myrtus communis L. (Myrtaceae). Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 18, n.2, p , SCHIMDT, D.F.N. Estudo químico e farmacológico das espécies Allamanda blanchetti e Allamanda schottii para a obtenção de frações e moléculas bioativas de potencial terapêutico p. Dissertação (Doutorado - Química) Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. SHARMA, R.K.; CHATTERJI, S.; RAI, D.K., MEHTA, S.; RAI, P.K.; SINGH, R.K.; WATAL, G.; SHARMA, B. Antioxidant activities and phenolic contents of the aqueous extracts of some Indian medicinal plants. Journal of Medicinal Plants Research, v.3, n.11, p , SILVA, K. A. B. S. Caracterização dos efeitos do plumierídeo, um iridóide isolado de Allamanda cathartica L. (Apocynaceae), em modelos de inflamação e dor p. Dissertação (Mestrado) Centro de Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

28 656 Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. STANGARLIN, J. R.; SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; SILVA CRUZ, M. E.; NOZAKI, M. H. Plantas medicinais e controle alternativo de fitopatógenos. Biotecnologia: Ciência & Desenvolvimento, v.11, p , TUNG, Y.-T.; WU, J.-H.; HUANG, C.-Y.; KUO, Y.-H.; CHANG, S.-T. Antioxidant activities and phytochemical characteristics of extracts from Acacia confusa bark. Bioresource Technology, v. 100, n.1, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

29 657 Atividade alelopática do extrato foliar de Davilla elliptica GONÇALVES, V.D. 1 ; COELHO, M.F.B.* 1 ; CAMILI, E.C. 1 ; AZEVEDO, R.A.B. 2 1Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical (PPGAT), Cuiabá, MT, Brasil. 2 Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro Brasileira-UNILAB, Redenção, CE, Brasil. *Autor para correspondência: coelhomfstrela@gmail.com RESUMO: As espécies nativas do Cerrado apresentam potencial alelopático ainda pouco investigado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial alelopático de extratos de folhas Davilla elliptica sobre a germinação e desenvolvimento de plântulas de Lactuca sativa L. O extrato foi obtido com a trituração de 50 g de folhas em 500 ml de água destilada no liquidificador. A partir deste extrato obteve-se, por diluição em água, as concentrações de 0, 25, 50, 75 e 100%. O bioensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com cinco concentrações e quatro repetições de 50 sementes de L. sativa. As características avaliadas foram porcentagem de germinação e de plântulas anormais, índice de velocidade de germinação, comprimento da parte aérea e da raiz e massa seca das plântulas. As diferentes concentrações do extrato de Davilla elliptica não afetaram a porcentagem de germinação de alface que variou de 99 a 100%, a porcentagem de plântulas anormais, a massa seca da parte aérea e a massa seca da raiz. O IVG e comprimento da raiz diminuíram com o aumento das concentrações do extrato, mas o comprimento da parte aérea foi favorecido por maiores concentrações do extrato. O potencial alelopático foi verificado nas características de desenvolvimento das plântulas de alface. Palavras-chave: Davilla elliptica, Aleloquimicos, Extratos aquosos, Germinação, Planta medicinal ABSTRACT: Allelopathic activity of Davilla elliptica leaf extract. The Cerrado native species present allelopathic potential little investigated. The aim of this study was to evaluate the allelopathic potential of Davilla elliptica leaf extracts on germination and growth of Lactuca sativa L. The extract was obtained with 50 g leaves in 500 ml of distilled water in a blender. From this extract was obtained by diluting in water in concentrations of 0, 25, 50, 75 and 100%. The bioassay was conducted in completely randomized design with five levels and four replicates of 50 seeds of L. sativa. The different extract concentrations Davilla elliptica did not affect the percentage of lettuce germination ranging %, the percentage of abnormal seedlings, dry weight of shoot and root dry mass. The IVG and root length decreased with increasing concentrations of the extract, but the length of the shoot was favored by higher concentrations of the extract. allelopathic potential was seen in developmental characteristics of lettuce seedlings. Keywords: Davilla elliptica, Allelochemical, Aqueous extracts, Germination, Medicinal Plant INTRODUÇÃO Davilla elliptica St.-Hil., pertencente à família Dilleniaceae, conhecida como cipó-caboclo e pau-de-bugre é um arbusto que ocorre naturalmente no bioma Cerrado (Sano et al., 2008). D. elliptica é usada na medicina popular brasileira como adstringente, tônico, sedativo, diurético no tratamento de hemorroidas, hérnia e em aplicações tópicas como antisséptico na limpeza de ferimentos (Rodrigues & Carvalho, 2001). Segundo Soares et al. (2005) essa espécie apresenta uma grande diversidade de substâncias do metabolismo secundário como flavonoides, saponinas, esteróides, taninos, cumarinas e triterpenóides. Investigações farmacológicas realizadas com os extratos metanólico e etanólico das folhas da D. elliptica mostraram atividade imunoestimulatória em ratos, através da modulação da ativação de macrófagos (Carlos et al., 2005), enquanto o extrato hidroalcoólico das partes aéreas apresentou atividade anti-inflamatória (Azevedo et al., 2007). A presença de compostos secundários em D. elliptica pode ser responsável por atividade alelopática. A alelopatia pode ser definida como a Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/ 0124 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

30 658 interferência positiva ou negativa de compostos do metabolismo secundário produzidos por uma planta (aleloquímicos) e lançados no meio. A interferência sobre o desenvolvimento de outra planta pode ser indireta, por meio da transformação destas substâncias no solo pela atividade de microrganismos (Inderjit et al., 2011). Estudos realizados com espécies nativas do Cerrado mostraram que apresentam potencial alelopático ainda pouco explorado (Oliveira et al., 2004). A identificação das propriedades alelopáticas em espécies nativas abre perspectivas de que tais efeitos possam se encontrar entre os fatores determinantes da dinâmica da vegetação e da composição florística das fitofisionomias do Cerrado (Giotto et al., 2007). Além disso, a resistência das plantas invasoras aos herbicidas sintéticos tem levado a busca de novas alternativas, menos agressivas ao meio, como é o caso dos aleloquímicos naturais (Matsumoto et al., 2010). Diversos autores (Ribeiro et al., 2009; Centenaro et al., 2009; Matsumoto et al., 2010; Oliveira et al., 2014) demonstraram a possibilidade de controlar espécies invasoras através de aleloquímicos. Os compostos naturais têm várias vantagens sobre os compostos sintéticos, como maior solubilidade em água, ausência de moléculas halogenadas e menor meia vida (Ribeiro et al., 2009). Portanto, os aleloquímicos revelam-se como herbicidas naturais, os quais estariam livres dos efeitos prejudiciais causados pelos herbicidas sintéticos. Para avaliação do potencial alelopático é necessário o uso de biotestes com plantas indicadoras para escolha de qual a melhor concentração deve ser usada (Ferreira & Aquila, 2000). A alface (Lactuca sativa L.) é uma espécie usada nos bioensaios porque tem a germinação rápida, em aproximadamente 24 h, crescimento linear insensível às diferenças de ph em ampla faixa de variação e insensibilidade aos potenciais osmóticos das soluções (Rice, 1984). Assim, o objetivo neste trabalho foi avaliar o potencial alelopático de folhas Davilla elliptica sobre a germinação e desenvolvimento de plântulas de Lactuca sativa L. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Sementes da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia (FAMEVZ) da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) campus Cuiabá. As folhas de Davilla elliptica foram coletadas em indivíduos adultos em Chapada dos Guimarães (MT), entre as coordenadas geográficas 15º10-15º30 latitude Sul e 55º40-56º00 longitude Oeste. O clima da região é do tipo Aw (Clima de Cerrado), segundo a classificação de Köppen. As folhas foram colocadas durante 5 min em recipientes contendo 10 ml de hipoclorito de sódio diluído em 500 ml de água destilada para que fossem limpas, depois lavadas em água corrente e secas com papel toalha. As folhas foram trituradas em liquidificador, na proporção de 50g de folhas/500 ml de água destilada. O extrato foi filtrado em papel filtro e armazenado em frascos de vidro (âmbar). Para o bioensaio de germinação foi usado o delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos constituídos pelas concentrações do extrato foliar obtidas por diluição em água destilada (0, 25, 50, 75 e 100%), com quatro repetições de 50 sementes de alface (Lactuca sativa). A determinação do ph foi feita com phmetro e a condutividade elétrica (CE) foi medida pelo condutivímetro. A partir dos valores da CE determinou-se o potencial osmótico (PO) de acordo com a fórmula proposta por Ayers & Westcot (1999): Potencial osmotico em atmosfera (ATM) = - 0,36 * CE. Os dados em ATM foram transformados para (Mpa). As sementes foram colocadas em caixas plásticas transparentes tipo gerbox (11x11x3 cm) sobre duas folhas de papel mata-borrão umedecidas com o respectivo tratamento, na quantidade de 2,5 vezes a massa do substrato. As caixas foram tampadas e vedadas com papel filme, e mantidas em incubadora do tipo BOD a 30 C durante o dia e 20 C durante a noite, em fotoperíodo de 12 h, durante sete dias. A cada 24 h foi anotado o número de sementes germinadas. O critério para avaliar a germinabilidade das sementes baseou-se no conceito de germinação fisiológica citada por Marcos Filho (2015), que aponta o inicio da germinação com a embebição da semente e seu final com a protusão da radícula. Sete dias após a aplicação dos tratamentos, as sementes de alface foram avaliadas quanto ao comprimento da parte aérea: região de transição da raiz até a inserção dos cotilédones e comprimento da raiz: região de transição da parte aérea até o ápice da raiz. As plântulas foram acondicionadas em sacos de papel pardo e expostas a secagem em estufa de ventilação forçada a 70ºC ± 2ºC por 72 h, para a obtenção da massa seca. As plântulas foram classificadas em normais ou anormais de acordo com as especificações de Brasil, (2009). Foram consideradas anormais aquelas que não mostraram potencial para continuar o seu desenvolvimento, e normais, plântulas com pequenos defeitos como danos limitados ou pequenos, retardamento no crescimento no sistema radicular. Sendo assim, foram consideradas anormais as plântulas com sistemas radiculares ou aéreos apodrecidos, ausentes, totalmente atrofiadas. A velocidade de germinação foi determi- Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

31 659 nada segundo Maguire (1962) e calculada pela expressão: IVG = (G 1 /N 1 ) + (G 2 /N 2 ) (G n /N n ), onde: G 1 = número de sementes germinadas na primeira contagem, N 1 = número de dias decorridos até a primeira contagem, G 2 = número de sementes germinadas na segunda contagem, N 2 = número de dias decorridos até a segunda contagem e n = última contagem. Foi avaliado o Índice de Efeito Alelopático (RI), de acordo com a seguinte fórmula: RI = 1 C/T (T C) ou RI = T/C 1 (T < C), onde: C = velocidade de germinação do controle T = velocidade de germinação do tratamento Gao et al. (2009). As variáveis foram submetidas à análise de variância da regressão e, quando significativas, foram selecionados os modelos com maior R 2. RESULTADOS E DISCUSSÃO As características físico-químicas apresentadas pelos extratos de folhas de Davilla elliptica nas diferentes concentrações encontram-se na Tabela 1. Observa-se que houve pequena variação de ph em relação ao controle. De acordo com Gatti et al. (2004) em testes alelopáticos o ph deve estar acima de 4 e abaixo de 7 e o potencial osmótico deve se menor que -0,2 MPa. Portanto estas características dos extratos não são responsáveis por possíveis alterações no comportamento germinativo de alface no presente estudo. TABELA 1. Características físico-químicas de extratos aquosos de folhas de Davilla elliptica, Cuiabá, MT Concentração do Extrato ph PO (MPa) 0% 7,6-0, % 5,06-0, % 5,05-0, % 5,08-0, % 5,05-0, Não houve diferença na porcentagem de germinação de alface, que variou de 99,5 a 100% e na porcentagem de plântulas anormais. O fato das concentrações não afetarem a porcentagem de germinação pode ser explicado por Ferreira & Borghetti (2004), que afirmam que o efeito alelopático não ocorre sobre a porcentagem de germinação final, e sim sobre a velocidade de germinação ou sobre outro parâmetro, como o comprimento médio da raiz primária. A germinação é menos sensível aos metabólitos secundários do que o crescimento das plântulas, pois este parâmetro é influenciado por estas substâncias que podem levar ao aparecimento de plântulas anormais, tendo a necrose como um sintoma comum (Ferreira & Aqüila, 2000). As concentrações do extrato afetaram o IVG, comprimento da raiz e da parte aérea e massa fresca e seca da plântula (Figura 1). O modelo de regressão polinomial quadrático explicou bem os resultados de IVG, comprimento de raiz e de parte aérea, mas esse modelo não explicou a maioria da variação de massa fresca e seca da plântula. O IVG e comprimento da raiz foram mais fortemente afetados pela concentração dos extratos e decresceram à medida que a concentração aumentou. Ação alelopática semelhante foi constatada por Pessoto & Pastorine (2007) com extratos de funcho (Foeniculum vulgare Mill.) sobre alface. Manoel et al. (2009) ao estudarem a ação alelopática de pata-de-vaca (Bauhinia forficata Link) e barbatimão (Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville) em sementes de tomate (Lycopersicum esculentum Mill. a partir de extratos de folhas frescas e secas das espécies-teste nas concentrações de 100%, 75%, 50%, 25% e 0% verificaram que não houve diferença em relação à porcentagem de germinação das sementes de tomate para os diferentes tipos de extrato, mas em relação à velocidade média de germinação todos os tratamentos com extrato foliar fresco diferiram da testemunha e todos os tratamentos apresentaram efeito inibitório sobre o comprimento da raiz primária, como ocorreu no presente estudo. Uma indicação do efeito alelopático é dada também pelo índice de atividade alelopática (Figura 1 F). À medida que aumentou a concentração do extrato de Davilla eliptica maior foi o efeito alelopático e resultados semelhantes foram observados em extratos de Ziziphus joazeiro sobre milho, melão e feijão (Oliveira et al., 2014) e em extratos de Schinus mole que causaram efeitos inibitórios a germinação de rabanete proporcional a concentração Borella et al. (2011). O índice de efeito alelopático RI foi utilizado por Khong et al. (2002) e por Abdelgaleil & Hashinaga (2007) para demonstrar a ação alelopática causados pelos extratos em bioensaios. Os valores de RI variam de acordo com o impacto dos efeitos, sejam positivos ou negativos (Khong et al., 2002). O índice de efeito alelopático indica estimulo quando apresenta valores positivos em relação ao controle e valores negativos indicam inibição. CONCLUSÕES O ph e o potencial osmótico estão dentro de padrões aceitáveis para a germinação indicando que a presença de compostos nos extratos tenha ocasionado os efeitos observados. O extrato foliar de Davilla elliptica, em diferentes concentrações, não afeta a germinação de sementes de alface. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

32 660 IVG y = 49,9-5,45x- 6,7x 2 R² = 0, A 0 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Concentração Concentração de do extratos extrato 3,5 Comprimento da parte aérea (cm) Massa fresca da plântula 4 3 2,5 2 1,5 1 y = 2,4-2,97x + 2,1x 2 R² = 0,8612 0,5 C 0 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,05 0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 E Concentração de extratos y = 0,046-0,04x + 0,039x 2 R² = 0,5686 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Concentração do de extratos Comprimento da raiz (cm) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 B y = 3,3-2,7x + 0,32x 2 R² = 0, ,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Massa seca da plântula Índice Alelopático 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 D y = 0,005-0,0035x x 2 R² = 0, ,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Concentração Concentração de extratos do extrato 0-0,05-0,1-0,15-0,2-0,25-0,3 Concentração de extratos Concentração Concentrações de do extratos 0 0,25 0,5 0,75 1 FIGURA 1. Índice de velocidade de germinação (A), comprimento da raiz (B), comprimento da parte aérea (C), massa seca da plântula (D), massa fresca da plântula (E) e índice de efeito alelopático (F) de alface em diferentes concentrações do extrato de Davilla elliptica. UFMT, Cuiabá, MT F O efeito alelopático verifica-se nas características relacionadas com o desenvolvimento das plântulas de alface. REFERÊNCIAS ABDELGALEIL, S.A.M.; HASHINAGA, F. Allelopathic potential of two sesquiterpene lactones from Magnolia grandiflora L. Biochemical Systematics and Ecology, v.35, p , AYERS, R.S.; WESTCOT, D.W. Water Quality for Agriculture. Roma: Fao, p. (Fao. Irrigation and Drainage Peper, 29). AZEVEDO, A.O.; CAMPOS, J.J.; GALDINO, G.S.; DUARTE, I.D.G.; BRAGA, F.C.; PERES, A.C. Antinociceptive effect from Davilla elliptica hydrooalcoholic extract. Journal of Ethnopharmacology, v.113, p , BORELLA, J.; WANDSCHEER, A.C.D.; PASTORINI, L.H. Potencial alelopático de extratos aquosos de frutos de Solanum americanum Mill. sobre as sementes de Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

33 661 rabanete. Revista Brasileira de Ciências Agrárias v.6, p , BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. (2009) Regras para Análise de Sementes, Brasília: SNAD/CLAV,. 395p. CARLOS, I.Z.; LOPES, F.C.M.; BENZATTI, F.P.; CARLI, C.B.A.; MARQUES, M.F.; JORDÃO JUNIOR, C.M.; RINALDO, D.; CALVO, T.R.; SANTOS, L.C.; VILEGAS, W. Ação do extrato metanólico e etanólico de Davilla elliptica St. Hill. (Dilleniaceae) na resposta imune. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, p.44-45, CENTENARO, C.; CORRÊA, L.G.P.; KARAS, M.J.; VIRTUOSO, S.; DIAS, J.F.G.; MIGUEL, O.G.; MIGUEL, M.D. Contribuição ao estudo alelopático de Erythrina velutina Willd., Fabaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.19, p , Ferreira AG, Borghetti F. (2005) Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre: Artmed, 323p. FERREIRA, A.G.; AQUILA, M.E.A. Alelopatia: uma área emergente da ecofisiologia. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.12, p , GAO, X.; LI, M.; GAO, Z.; LI, C.; SUN, Z. Allelopathic effects of Hemistepta lyrata on the germination and growth of wheat, sorghum, cucumber, rape, and radish seeds. Weed Biology and Management, v.9, p , GATTI, A.B.; PEREZ, S.C.J.G.; LIMA, M.I.S. Efeito alelopático de Aristolochia esperanzae O. Kuntze na germinação e no crescimento de Lactuca Sativa L. e Raphanus sativus L. Acta Botânica Brasílica, v.8, p , GIOTTO, A.C.; OLIVEIRA, S.C.C.; SILVA, J.G.P. Efeito alelopático de Eugenia dysenterica Mart. ex DC. Berg. (Myrtaceae) na germinação e no crescimento de Lactuca sativa L. (Asteraceae). Revista Brasileira de Biociências, v.5, p , INDERJIT, K.; WARDLE, D.A.; KARBAN, R.; CALLAWAY, R.M. The ecosystem and evolutionary contexts of allelopathy. Trends Ecology Evolution, v.1442, p ISTA - International Seed Testing Association International rules for testing seeds. Seed Science and Technology, v.32, p KHONG, C.; HU, F.; XU, X. Allelopathic potenatial and chemical constituents of volatiles from Ageratum conyzoides under stress. Journal of Chemical Ecology, v.28, p , MAGUIRE, J.A. Speed of germination: aid in selection and evaluation for seedling emergence and vigor. Crop Science, v.2, p , MANOEL, D.D.; DOICHE, C.F.R.; FERRARI, T.B.; FERREIRA. G. Atividade alelopática dos extratos fresco e seco de folhas de barbatimão (Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville) e pata-de-vaca (Bauhinia forficata link) sobre a germinação e desenvolvimento inicial de plântulas de tomate. Semina: Ciências Agrárias, v.30, p.63-70, MARCOS FILHO, J. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba: FEALQ, 2015, 795p. MATSUMOTO, R.S.; RIBEIRO, J.P.N.; TAKAO, L.K.; LIMA, M.I.S. Potencial alelopático do estrato foliar de Annona glaba L. (Annonaceae). Acta Botanica Brasilica v.24, p , OLIVEIRA, A.K.M.; PEREIRA, K.C.L.; MULLER, J.A.I.; MATIAS, R. Análise fitoquímica e potencial alelopático das cascas de Pouteria ramiflora na germinação de alface. Horticultura Brasileira, v.32, p.41-47, OLIVEIRA, S.C.C.; FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. Efeito alelopático de folhas de Solanum Lycocarpum A. St.-Hil. (Solanaceae) na germinação e crescimento de Sesamum indicum L. (Pedaliaceae) sob diferentes temperaturas. Acta Botânica Brasílica, v.18, p , PESSOTTO, G.P.; PASTORINI, L.H. Análise da germinação de alface (Lactuca sativa L.) e tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) sob a influência alelopática do funcho (Foeniculum vulgare Mill.). Revista Brasileira de Biociências, v.5, p , RIBEIRO, J.P.N.; MATSUMOTO, R.S.; TAKAO, L.K.; VOLTARELLI, V.M.; LIMA, M.I.S. Efeitos alelopáticos de extratos aquosos de Crinum Americanum L. Revista Brasileira de Botanica, v.32, p , RICE, E.L. Allelopathy. 2.Ed. New York: Academic Press, 1984, 422 p. RODRIGUES, V.E.G.; CARVALHO, D.A. Levantamento etnobotânico de plantas medicinais do domínio do cerrado na região do alto Rio Grande - Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, v.25, p , SANO, S.M.; ALMEIDA, S.P.; RIBEIRO, J.F. Cerrado: Ecologia e Flora. Brasília, DF : Embrapa Informação Tecnológica, v. 1, 2008, p. SOARES, M.L.; REZENDE, M.H.; FERREIRA, H.D.; FIGUEIREDO, A.D.L.; BUSTAMANTE, K.G.L.; BARA, M.T.F; PAULA, J.R. Caracterização farmacognóstica de folhas de Davilla elliptica St. Hil. (Dilleniaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15: p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

34 662 Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de erva-luísa (Aloysia citriodora Palau) sobre Pythium sp. FREDDO, Á.R. 1* ; MAZARO, S.M. 2 ; BORIN, M.S.R. 2 ; BUSSO, C. 2 ; CECHIN, F.E. 2 ; ZORZZI, I.C. 2 ; DALACOSTA, N.L. 2 ; LEWANDOWSKI, A. 2 1 UNISEP União de Ensino do Sudoeste do Paraná, Dois Vizinhos PR, Brasil. 2 Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Dois Vizinhos, Dois Vizinhos PR, Brasil. *Autor para correspondência: alvaro. freddo@hotmail.com RESUMO: O objetivo principal deste trabalho foi o de avaliar a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Aloysia citriodora sobre o fungo fitopatogênico Pythium sp., isolado de plântulas de feijoeiro parasitadas pelo mesmo. Foram realizados dois experimentos, avaliando o efeito do óleo essencial no crescimento micelial e na germinação de esporângios do fungo. No primeiro experimento, em delineamento inteiramente ao acaso, foi avaliado se concentrações (0,0155%; 0,0315%; 0,0625%; 0,125% e 0,250%) do óleo essencial de A. citriodora diluído em meio BDA, no crescimento micelial de Pythium sp. em placas de Petri, mais a testemunha, com meio BDA puro. Cada placa foi considerada como uma repetição, sendo incubadas a 24ºC±1ºC e fotoperíodo de doze horas. Neste primeiro experimento, avaliou-se o crescimento radial do patógeno e quando a primeira placa foi atingida pelas hifas do patógeno em suas bordas, encerraram-se as avaliações. No segundo experimento, testaram-se concentrações (0,0625%; 0,125% e 0,250%) do óleo essencial de A. citriodora, diluído em meio BD (batata dextrose), nas mesmas condições de incubação do primeiro experimento, no entanto, em lâminas de microscopia. Foi utilizado delineamento inteiramente ao acaso, sendo considerada como unidade experimental cada lâmina de microscopia utilizada. Avaliou-se 24 h após a incubação, em microscópio óptico, a germinação dos primeiros vinte esporângios de Pythium sp., visualizados a partir do canto esquerdo superior para o direito. Os resultados do segundo experimento foram expressos em porcentagem de germinação de esporângios. Os resultados obtidos, permitiram concluir que o óleo essencial de A. citriodora possui efeito fungistático e fungicida ao crescimento micelial e na germinação de esporângios de Pythium sp., sendo este efeito mais pronunciado com o aumento da concentração do mesmo. Palavras-chave: fungo fitopatogênico, plantas medicinais, Verbenaceae, Phaseolus vulgaris L. ABSTRACT: Antifungal activity in vitro of essential oil fennel luisa (Aloysia citriodora Palau) on Pythium sp. The aim of this study was to evaluate the antifungal activity in vitro of essential oil of Aloysia citriodora on plant pathology fungus Pythium sp., isolated from bean seedlings parasitized by it. Two experiments were conducted to assess the effects of the essential oil on mycelial growth and fungus sporangia germination. In the first experiment, when in a completely randomized design was evaluated concentrations (0,0155%; 0,0315%; 0,0625%; 0,125% and 0,250%) of essential oil of A. citriodora diluted in PDA medium, growth mycelium of Pythium sp. in Petri plates, plus the control, with half pure BDA. Each plate was taken as a repeat, and incubated at 24 C±1 C and a photoperiod of twelve hours. In the first experiment evaluated the radial growth of the pathogen and when the first plate was hit by the mycelial growth of the pathogen on its edges. In the second experiment, they tested concentrations (0,0625%; 0,125% and 0,250%) of essential oil from A. citriodora, diluted in PD medium (Potato Dextrose), under the same incubation conditions as the first experiment, however, in microscope slides. Design was used completely randomized, being considered as an experimental unit each microscope slides used. It was evaluated 24 h after incubation, in optical microscope, germination of sporangia first twenty viewed from the upper left to the right. The results of the second experiment were expressed as percentage of sporangia germination. The results Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0127 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

35 663 obtained showed that this essential oil has fungistatic and fungicidal effect at the mycelial growth and at the sporangia germination of Pythium sp., and this effect more pronounced with increasing concentration of the same. Keywords: plant pathogenic fungus, medicinal plants, Verbenaceae, Phaseolus vulgaris L. INTRODUÇÃO Os óleos essenciais advindos de plantas medicinais, aromáticas e condimentares são em sua maioria de fácil obtenção e baixo custo, podendo ser uma alternativa viável a agricultura, devido ao seu caráter em sua maioria sistêmico, fácil degradação e pouco ou não fitotóxicos (Morais, 2009). Em trabalhos desenvolvidos com a utilização de extratos brutos ou óleos essenciais de plantas, têm-se evidenciado o seu potencial no controle de fitopatógenos, o que pode estar relacionado a sua ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e a germinação dos esporos (Schwan- Estrada et al., 2000). Espécies do gênero Aloysia (sin. Lippia), pertencentes a família Verbenaceae, são utilizadas na América do Sul e Central e na África Tropical mais comumente para o tratamento de distúrbios gastrintestinais, respiratórios e também como tempero. Algumas espécies deste gênero possuem atividades antimalária, sedativa, controle da hipertensão e anti-inflamatória, devido a principalmente os óleos essenciais e compostos fenólicos (flavonoides) obtidos de extratos destas plantas (Pascual et al., 2001). A erva-luísa (Aloysia citriodora Palau) é um arbusto grande da família Verbenaceae, muito ramificado, ereto, com aroma de citral, de 2 a 3 m de altura, nativo da América do Sul, provavelmente do Chile. Esta planta é cultivada em jardins e hortas domésticas no sul do Brasil, principalmente para fins medicinais e, ocasionalmente, como condimentar na culinária, para temperar saladas e recheios (Lorenzi, 2008). Trabalhos in vitro relatam o potencial do óleo essencial desta planta, no controle de diversas espécies de bactérias (Sartoratto et al., 2004; Ohno et al., 2003; Duarte et al., 2007; Ali et al., 2011) e de fungos (Duarte et al., 2005; Ali et al., 2011; López et al., 2004; Combrinck et al., 2011; Lozada et al., 2012). No entanto, são escassos ou inexistentes na literatura, trabalhos que relatem sua ação no controle de Pythium sp., fungo pertencente ao Reino Chromista. As espécies pertencentes ao gênero Pythium, constituem-se em patógenos de solo, que causam doenças em plantas, conhecidas como tombamentos, que podem ocorrer em pré- ou pósemergência. Essas enfermidades se caracterizam por apodrecerem o sistema radicular e, ou, do coleto das plantas (Pereira & Soares, 2012). Dentre as culturas parasitadas por este agente fitopatogênico, está a do feijoeiro (Bianchini et al., 2005). Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência do uso de óleo essencial de A. citriodora, no controle in vitro do crescimento micelial e da germinação de esporângios de Pythium sp., isolado de plântulas de feijoeiro. MATERIAL E MÉTODOS As plantas utilizadas para extração do óleo essencial foram cultivadas na Horta do Campus Dois Vizinhos da UTFPR de Dois Vizinhos, PR. Primeiramente, foram levadas exsicatas para identificação taxonômica no herbário da mesma instituição. A espécie identificada pelo seu curador foi Aloysia citriodora Palau, da família Verbenaceae, sendo realizado o depósito de uma exsicata neste herbário, mantido sob o número DVPR 842. As plantas foram colhidas em estádio vegetativo, com cerca de 30 a 50 cm de altura, no mês de maio, no início da manhã. Foram retiradas as folhas e, em seguida, seccionadas em porções menores. Logo após, as folhas seccionadas foram colocadas em aparelho de hidrodestilação, modelo Clevenger, para extração do óleo essencial. A extração do óleo essencial desta planta seguiu metodologia descrita por Paulus et al. (2013). O óleo essencial extraído das folhas de A. citriodora foi utilizado para a realização de dois experimentos in vitro. No primeiro experimento foi avaliado o efeito de concentrações do óleo essencial de A. citriodora (0,0155%; 0,0315%; 0,0625%; 0,125% e 0,250%), diluídas em meio de cultivo semi-sólido BDA (batata-dextrose-ágar), mais a testemunha (meio BDA puro), no crescimento micelial de Pythium sp. O isolado do fitopatógeno utilizado no trabalho foi obtido a partir de plântulas de feijoeiro infectadas com o mesmo. Primeiramente, foi realizado o seu cultivo puro com meio BDA em placas de Petri, sendo incubado em câmara de crescimento a 24ºC±1ºC, com fotoperíodo de 12 h, sendo repicado até a obtenção de colônias puras do seu micélio. Este experimento foi conduzido em placas de Petri de 8 cm de diâmetro, em delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições para cada concentração testada, sendo considerada Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

36 664 como unidade experimental, cada placa de Petri utilizada. O meio de cultura BDA utilizado no experimento foi esterilizado em autoclave, a temperatura de 120 C, por vinte minutos. O óleo essencial foi incorporado ao meio, após o resfriamento deste (40ºC), sendo em seguida, vertido nas placas. Após, as placas foram esterilizadas abertas em câmara de fluxo laminar, com luz ultravioleta germicida por dez minutos. O micélio de Pythium sp. foi manipulado em câmara de fluxo laminar, sendo colocado no centro de cada placa, discos de micélio puro, com diâmetro de 7 mm. Em seguida, as placas foram tampadas e vedadas com filme plástico esticável (tipo PVC). Foram marcados nas tampas, com caneta de retroprojetor, os diâmetros A e B, de forma perpendicular, onde foram realizadas as medições para avaliação do crescimento radial do micélio. As placas foram acondicionadas em câmara de crescimento, com temperatura de 24ºC±1ºC e fotoperíodo de doze horas. O experimento foi encerrado quando a primeira placa foi atingida em suas bordas pelo crescimento radial do micélio do fungo, tendo isto ocorrido em dez dias (240 h). Os resultados foram expressos em crescimento micelial em centímetros. No segundo experimento realizado, foram avaliadas as concentrações (0,0625%; 0,125%; 0,250%) de óleo essencial de A. citriodora em meio de cultivo líquido BD (batata dextrose), mais a testemunha (meio BD puro) sobre a germinação de esporângios de Pythium sp. Este experimento foi realizado em delineamento inteiramente ao acaso, com cinco repetições para cada tratamento, sendo consideradas como repetições lâminas de microscopia, com 1 ml de cada concentração utilizada. O inoculo de Pythium sp. foi proveniente de placa de Petri com meio BDA, cultivado por dez dias. Para obtenção da suspensão de esporângios, foi adicionado 20 ml de água destilada e esterilizada na placa. Com auxílio de escova de cerdas macias, procedeu-se a raspagem das colônias. Em seguida, as suspensões foram filtradas em camada dupla de gase esterilizada. Para serem adicionados ao meio de cultura, procedeu-se a calibração da suspensão de esporângios em Câmara de Neubawer (hemacitômetro), para 2,2 X 10 6 esporângios ml -1. As lâminas foram primeiramente esterilizadas em autoclave a 120ºC por 20 min e, após, receberam 1 ml dos tratamentos com a suspensão do inoculo de esporângios de Pythium sp. Após, as lâminas com seus respectivos tratamentos e o inoculo do patógeno, foram acondicionadas em caixas plásticas transparentes esterilizadas, forradas com papel filtro esterilizado e umedecido com água deionizada. Em seguida, as caixas plásticas foram incubadas em câmara de crescimento a 24ºC±1ºC, fotoperíodo de 12 h, por 24 h. Este experimento foi avaliado em microscópio óptico, mediante a contagem da germinação dos primeiros vinte esporângios visualizados de Pythium sp., do canto esquerdo superior, em direção ao canto direito superior da lâmina. Considerouse como germinado, o esporângio que possuía iniciação do tubo germinativo visível ao avaliador. Os resultados obtidos neste segundo experimento, foram expressos em porcentagem de germinação de esporângios. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística, por meio de análise de variância a 5% de probabilidade de erro e testes complementares, por meio de análise de regressão. RESULTADOS E DISCUSSÃO O crescimento micelial in vitro de Pythium sp. foi influenciado pelas concentrações do óleo essencial de A. citriodora, sendo observado comportamento quadrático decrescente do mesmo, com o aumento das concentrações testadas. Até a concentração de 0,146% observou-se efeito fungistático e, acima disso, observou-se efeito fungicida, ou seja, o micélio do fitopatógeno não cresceu no meio de cultura (Figura 1). Combrinck et al. (2011) verificaram que o óleo essencial de A. citriodora em teste in vitro, na concentração mínima de 0,2%, obtiveram efeito fungicida, inibindo em 100% o crescimento micelial dos patógenos Colletotrichum gloeosporioides do abacate e da manga, Alternaria citrii de laranjas e Botrytis cinerea de uvas. Os autores observaram também que para Penicillium digitatum de laranjas e Lasiodioplodia theobramae de mangas, esta concentração mínima para inibir totalmente o crescimento micelial, foi de 0,3%. Lozada et al. (2012) também observaram que a utilização de óleo essencial de A. citriodora e de outras espécies de Aloysia, na concentração de 0,2% reduziram o crescimento micelial in vitro fungo também fitopatogênico, Moniliophthora roreri, causador de moniliniose em cacau. Os autores encontraram ainda, efeito fungicida, com inibição total do micélio do patógeno, nas concentrações de 0,8% a 1% do óleo essencial em meio de cultura. Com relação aos patógenos acima apresentados, observados nos trabalhos de Combrinck et al. (2011) e Lozada et al. (2012), Pythium sp. foi mais sensível ao óleo essencial de A. citriodora, tendo inibição total do crescimento micelial em concentrações mais baixas. Outros trabalhos na literatura corroboram com o potencial de inibição do óleo essencial de A. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

37 665 Concentração de óleo essencial de A. citriodora (%) FIGURA 1. Crescimento micelial de Pythium sp. in vitro, em função de concentrações de óleos essencial de A. citriodora em placas de Petri contendo meio BDA, 240 horas após incubação em câmara de crescimento a 24ºC±1ºC e fotoperíodo de 12 horas. citriodora no crescimento micelial de vários fungos fitopatogênicos, como por exemplo no trabalho de López et al. (2004). Estes autores observaram redução significativa do crescimento micelial in vitro do fungo Fusarium verticillioides, na faixa de concentração entre 0,025% a 0,05% do óleo essencial desta planta. Bouchra et al. (2003) observaram na concentração de 0,025% do óleo essencial desta planta em meio BDA in vitro, que houve redução do crescimento micelial, nas taxas de 69,4% para B. cinerea, 68,2% para Phytophthora citriophthora, 44,4% para Penicillium digitatum e em 40,4% para Geotrichum citri-aurantii (Bouchra et al., 2003). No segundo experimento, também houve efeito significativo das concentrações do óleo essencial de A. citriodora. Observou-se redução da porcentagem da germinação de esporângios de Pythium sp. de forma linear decrescente, com o aumento da concentração do produto no meio de cultura onde foi realizado o microcultivo dos mesmos (Figura 2). Observa-se na Figura 2 que. a cada aumento de 0,0625% na concentração do óleo essencial em meio BD, houve diminuição de 13,22% na germinação dos esporângios de Pythium sp., até chegar a 0% de germinação, na concentração de 0,247%. Estes resultados demonstram que, Germinação de esporângios (%) Crescimento micelial (cm) Concentração de óleo essencial de A. citriodora (%) FIGURA 2. Porcentagem de germinação de esporângios de Pythium sp. in vitro, em função de concentrações de óleos essencial de A. citriodora em lâminas de microscopia, contendo meio BD, 24 horas após incubação em câmara de crescimento a 24ºC±1ºC e fotoperíodo de 12 horas. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

38 666 com relação ao efeito fungicida do óleo essencial, o crescimento micelial de Pythium sp. é mais sensível, quando comparado a germinação dos esporângios, pois este último, teve total inibição em concentrações maiores. A composição química do óleo essencial de A. citriodora, em condição ecológica semelhante, mesma época do ano, estádio vegetativo, tipo de coleta e extração, observado por Paulus et al. (2013), revelou que seus principais componentes são o citral (geranial + neral) (49,69%), seguido de limoneno (14,10%). O citral presente em óleos essenciais de várias plantas possui efeito antifúngico. Em citronela (Cymbopogon citratus) é relatado com potencial a várias espécies de fungos, como Candida albicans, Alternaria citrii, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Helminthosporium compactum, Sclerotium rolfsii, Trichophyton mentagrophytes (Pattnaik et al., 1997) e Rhizoctonia solani (Gonçalves, 2012). Extraído de Lippia alba, este composto teve atividade antifúngica a Aspergillus fumigatus e Candida krusei (Mesa- Arango et al., 2009). O limoneno presente em óleos essenciais das plantas Mentha spicata e Anethum sowa também é relatado com efeito antifúngico a vários patógenos humanos (Aggarwal et al., 2002). Os resultados obtidos no presente trabalho, permitem concluir que o óleo de A. citriodora possui efeito fungistático e fungicida in vitro no controle do crescimento micelial e na germinação de esporângios de Pythium sp., isolado de plântulas de feijoeiro infectadas. Este efeito foi maior quanto maior foi a concentração testada, sendo que, o crescimento micelial foi mais sensível que a germinação de esporângios. Também, conclui-se que o efeito antifúngico do óleo essencial desta planta, seja provavelmente decorrente dos seus componentes majoritários, citral e limoneno. REFERÊNCIAS AGGARVAL, K.K. et al. Antimicrobial activity profiles of the two enantiomers of limonene and carvone isolated from the oils of Mentha spicata and Anethum sowa. Flavour and Fragance Journal, v.17, n.1, p , ALI, H.F.M. et al. Evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of Aloysia triphylla. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, v. 10, n. 11, p , BIANCHINI, A.; MARINGONI, A.C.; CARNEIRO, S.M.T.P.G. Doenças do Feijoeiro. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, L.E.A.; CAMARGO, J.A.M. Manual de Fitopatologia 2: Doenças das Plantas Cultivadas. São Paulo: Agronômica Ceres, 2005, p BOUCHRA, C. et al. Antifungal activity of essential oils from several medicinal plants against four postharvest citrus pathogens. Phytopathologia Mediterranea, v.42, p , COMBRINCK, S. et al. In vitro activity of eighteen essential oils and some major components against common postharvest fungal pathogens of fruit. Industrial Crops and Products, v. 33, p , DUARTE, M.C.T. et al. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 97, n. 2, p , DUARTE, M.C.T. et al. A. Activity of essential oils from Brazilian medicinal plants on Escherichia coli. Journal of Ethnopharmacology, v. 111, n. 2, p , GONÇALVES, A.H. Atividade fungitóxica dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. no controle de fitopatógenos do feijoeiro comum p. Dissertação de Mestrado Área de Concentração em Produção Vegetal - Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, UFT, Gurupi. LÓPEZ, A.G. et al. Aromatic plants essential oils activity on Fusarium verticillioides Fumonisin B 1 production in corn grain. Mycopathologia, v. 158, p , LORENZI, H. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. 2 ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2008, 544p. LOZADA, B.S. et al. In vitro effect of essential oils of three Lippia species on Moniliophthora roreri (Cif. and Par.) Evans et al., causative agent of moniliasis of cocoa (Theobroma cacao L.). Acta Agronomica, v. 61, n. 2, p , MESA-ARANGO, A.C. et al. Citral and carvone chemotypes from the essential oils of Colombian Lippia alba (Mill.) N. E. Brown: composition, citotoxity and antifungal activity. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.104, n.6, p , MORAIS, L.A.S. Óleos essenciais no controle fitossanitário. In: BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B. Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2009, p OHNO, T. et al. Antimicrobial activity of essential oils against Helicobacter pylori. Helicobacter, v. 8, n. 3, p , PASCUAL, M.E.; SLOWING, K.; CARRETERO, E.; SÁNCHEZ MATA, D.; VILLAR, A. Lippia: traditional uses, chemistry and pharmacology: a review. Journal of Ethnopharmacology, v. 76, n. 3, p , PEREIRA, O.L.; SOARES, D.J. Fungos fitopatogênicos. In: ZAMBOLIM, L.; JESUS JÚNIOR, W.C.; PEREIRA, O.L. O essencial da fitopatologia Agentes Causais. Viçosa: UFV, 2012, p PATTNAIK, S. et al. Antibacterial and antifungal activity of aromatic constituintes of essential oils. Microbios, v.89, p ,1997. PAULUS, D. et al. Teor e composição química do óleo essencial e crescimento vegetativo de Aloysia triphylla em diferentes espaçamentos e épocas de colheita. Revista Ceres, v.60, n.3, p , SARTORATTO, A. et al. Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 35, n. 4, p , SCHWAN-ESTRADA, K.R.F. et al. Uso de extratos vegetais no controle de fungos fitopatogênicos. Revista Floresta, v. 30, n. 1/2, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

39 667 Avaliação da toxicidade e obtenção de triterpenos de populações de Miconia rubiginosa (Bonpl.) DC. (Melastomataceae) em área de savana CORREIA, T.C. 1 ; LIMA, SILVA, R.M. 1 ; RODRIGUES, A.J. 1 * 1 Universidade Federal de Roraima, Centro de Estudos da Biodiversidade, campus Paricarana, Laboratório de Substâncias Bioativas. Boa Vista/Roraima; * albanita.dejesusrodriguesdasil@gmail.com RESUMO: A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. Esta pesquisa tem como objetivos a obtenção de triterpenos do subextrato ciclohexânico do período chuvoso, utilizando a cromatografia gasosa, e a avaliação da atividade toxicológica do extrato bruto etanólico e subextrato ciclohexânico de Miconia rubiginosa (Bonpl.) DC. A análise fitoquímica foi realizada utilizando as partes aéreas da planta e essas foram processadas para a obtenção do subextrato ciclohexânico e, posteriormente, os eluatos foram analisados por cromatografia. O bioensaio frente à Artemia salina Leach. foi desenvolvido em triplicata nas concentrações de 200, 100, 50 e 10 μg/ml. Quanto aos resultados, foram obtidos três compostos terpênicos todos evidenciados como triterpênicos, tais como α-amirina, β-amirina e β-sitosterol. Todos os extratos analisados foram considerados tóxicos, o que indica o alto potencial destes para atividades biológicas. Palavras-chave: farmacoquímica, Artemia salina, fitoextratos, metabólitos secundários. ABSTRACT: Evaluation of toxicity and obtaining of population triterpenes Miconia rubiginosa (Bonpl.) DC. (Melastomataceae) in savannah area. The use of plants for medicinal purposes for treatment, cure and prevention of diseases is one of the oldest forms of medical practice of humankind. This research aims to obtain triterpenes of cyclohexane substrate in the rainy season, using gas chromatography, and assessing the toxicological activity of the ethanol crude extract and of cyclohexane substrate Miconia rubiginosa (Bonpl.) DC. The phytochemical analysis was performed using the aerial parts of the plant and these were processed in order to obtain cyclohexane substrate and then the eluates were analyzed by chromatography. The bioassay against the Artemia salina Leach. was developed in triplicate at the concentrations of 200, 100, 50 and 10 ug/ml. Regarding the results, three terpene compounds were obtained and all of them highlighted as triterpenic such as α-amyrin, β-amyrin and β-sitosterol. All extracts analyzed were considered toxic, suggesting high potential for these biological activities. Keywords: pharmacochemical, Artemia salina, plant extracts, secondary metabolites. INTRODUÇÃO Indícios da utilização de plantas medicinais e tóxicas foram encontrados nas civilizações mais antigas, sendo esta considerada uma das práticas mais remotas empregadas pelo homem para o tratamento, cura e prevenção de muitas doenças. Diversas culturas incluindo países desenvolvidos ou não, utilizam o potencial terapêutico das plantas no tratamento de doenças. Essas observações populares sobre o uso e eficácia da medicina tradicional são relevantes para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais. Com a evolução do conhecimento científico, intensificaram-se os estudos das plantas medicinais, relacionando o seu perfil químico com os seus efeitos, ratificando, muitas vezes, a sua utilização popular (Maciel et al., 2002; Andrade; Cardoso; Bastos, 2007). De fato, os metabólitos secundários são encontrados em baixas concentrações e são restritos a determinados grupos taxonômicos de plantas, os quais possuem diversas atividades biológicas contra micro-organismos, atuando como antivirais, antibióticos, antifúngicos, bem como na defesa contra insetos e possíveis predadores, colaborando Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0130 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

40 668 ainda como atrativos de polinizadores (Fumagali et al., 2008). A família Melastomataceae Juss. descrita por Antonie Laurent de Jussieu, constitui uma das famílias mais importantes da flora neotropical. Esta é composta por 11 tribos, as quais compreendem espécies já descritas, distribuídas em cerca de 170 gêneros, ocorrentes nas regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. No Brasil está entre as seis maiores famílias das Angiospermas, e a segunda com o maior número de espécies raras no país (Rapini, 2009), onde ocorrem 66 gêneros e aproximadamente espécies, as quais estão distribuídas desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul (Goldenberg; Bacci; Moraes, 2015). As espécies apresentam os mais diversos hábitos, desde herbáceas até arbóreas e mais raramente lianas e epífitas, ocorrem em praticamente todos os tipos de formações vegetacionais, tendo como gêneros mais representativos e com alto grau de endemismo a Miconia Ruiz & Pav., Leandra Raddi e Tibouchina Aubl. Os representantes desta família são facilmente identificáveis por suas características morfológicas como folhas simples opostas cruzadas, com nervação acródoma basal ou suprabasal, frequentemente revestidas por tricomas. Os frutos em geral são capsulados, ou bagas em algumas espécies (Clausing; Renner, 2001; Romero; Martins, 2002; Baumgratz et al., 2010; Rezende, 2012). No levantamento realizado por Cruz et al. (2004), o emprego das Melastomataceae para fins medicinais no Brasil tem poucos registros, devido ao fato do número reduzido de espécies conhecidas como medicinais, e pela tradição da indicação como plantas ornamentais. Entretanto, podem-se destacar espécies do gênero Tibouchina Aubl. que são utilizadas em tratamentos tópicos para alívio de dores. Quanto aos estudos etnobotânicos sobre esta família, há registros da ação contra erisipela, vermífugos intestinais, tratamento de leucorréia, ulcerações, palpitações, pressão alta, males dos rins e bexiga, dermatoses, asma, reumatismo, resfriado, febre, infecções vaginais, cicatrizante e antisséptica (FENNER et al., 2006). Do ponto de vista farmacológico encontra- -se registrado na literatura que a família Melastomataceae apresenta diversas atividades biológicas tais como citotóxica e mutagênica (Gunatilaka et al., 2001), bem como antiviral apresentada pela a espécie Melastoma malabathrium, a qual indicou atividade significativa contra poliovírus e também contra o vírus herpes simples do tipo I (Dévéhat et al., 2002), analgésica (Spessoto et al., 2003), antitumoral (Cunha et al., 2008), tripanocidal, avaliada do extrato diclorometânico de Miconia fallax DC. (Cunha et al., 2003), antioxidante sem efeitos tóxicos (Andreo, 2008), atividade antibacteriana, evidenciada por meio do extrato metanólico de Miconia cabucu Hoenhne e antifúngica do extrato clorofórmio (Rodrigues, 2007). De acordo com Rodrigues (2007), a química da família ainda é pouco conhecida, mas pode ser verificada uma variedade de classes de metabólitos secundários presentes nas poucas espécies estudadas, bem como o isolamento de substâncias, mas iato ainda não reflete sua grande diversidade. Grupos de metabólitos como taninos hidrolisáveis e flavonoides são os mais frequentes nas Melastomataceae, assim também como hidrocarbonetos saturados e insaturados, compostos oxigenados e esteroides (Cruz, 2004; Mancini et al., 2008). A espécie Miconia rubiginosa (Bonpl.) DC. é conhecida popularmente como capiroroquinha (Alonso et al., 2006). Ocorre desde a Costa Rica até Bolívia e sudeste do Brasil (Goldenberg, 2008). Com base no estudo sobre Miconia sul-americanas realizado por Goldenberg (2010), a espécie pode ser encontrada nos domínios Amazônico e do Cerrado, nos estados de Roraima, Pará, Amazonas, Tocantins, Rondônia, Pernambuco, Piauí, Bahia, Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais e São Paulo. A Miconia rubiginosa apresenta-se como arbustos ou arvoretas, podendo atingir até 6 metros de altura, possue os ramos cilíndricos; ramos, pecíolos, nervuras e inflorescência moderado a densamente revestida por indumento estrelado. As folhas possuem o ápice agudo a acuminado, face adaxial moderadamente recoberta por tricomas estrelado, depois glabra, face abaxial moderada a densamente revestida por tricomas do tipo estrelado ferrugíneo-avermelhado, característica específica da espécie observada em ambas às faces da folha. As flores são brancas, pentâmeras, com 10 estames. A baga é verde quando recém-fecundada e, violácea quando madura, e esta tem a forma globosa com sementes de (Rezende, 2012). Quanto ao levantamento etnobotânico das espécies de Miconia, Rodrigues e Carvalho (2001) relatam o uso de M. rubiginosa no tratamento de afecções da garganta, sendo utilizadas as folhas em forma de chá. Em relação à farmacologia, Rodrigues (2007) verificou o potencial biológico do extrato metanólico de M. rubiginosa, o qual apresentou atividade contra os microorganismos Sthaphylococcus epidermes (Winslowe Winslow) Evans, Candida albicans Berkhout, Sthaphylococcus aureus Rosenbach, Micrococcus luteus (Schroeter) Cohn., Bacillus subtilis (Cohn.) e Bacillus cereus Frankland e Frankland, bem como atividade analgésica verificada para os extratos hexano, diclorometano e etanólico. O efeito analgésico significativo do extrato hexânico pode ser explicado pela presença de mis- Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

41 669 turas de substâncias no extrato com propriedades analgésicas. Neste caso, os triterpenos presentes neste extrato podem ser as substâncias responsáveis por esse efeito, visto que já foi comprovado em estudos anteriores que essas substâncias possuem atividade biológica quando associadas (Cunha et al., 2003). De acordo com Rodrigues (2007), em relação ao perfil químico do extrato metanólico, a espécie apresentou principalmente flavonoides glicosilados derivados da quercetina, além de ácidos fenólicos, catequinas e taninos. Algumas substâncias foram isoladas e identificadas tais como quercetina-3-o-α-rhamnopiranosídeo, quercetinha- 3-O-α-arabinofuranosídeo, epicatequina, e o ácido gálico. Rodrigues (2007) ainda ressalta que a espécie foi pouco estudada quanto ao seu perfil químico. Nos estudos fitoquímicos das poucas espécies investigadas da família Melastomataceae foram encontrados principalmente taninos hidrolisáveis e flavonoides. Portanto, apesar dos poucos dados referidos sobre esta espécie, pode-se perceber o seu potencial químico e farmacológico. OBJETIVOS Com base nesse contexto, esta pesquisa tem como objetivos obter triterpenos do subextrato ciclohexânico do período chuvoso, utilizando a cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa (CG-EM) e avaliar a atividade toxicológica dos extratos brutos etanólicos (EBE) e subextratos da fase ciclohexânica (SCH) de M. rubiginosa. MATERIAL E MÉTODOS As áreas selecionadas para esta pesquisa foram estabelecidas no município de Boa Vista, em 2004, através do Núcleo Regional de Roraima (NR-RR) do Programa de Pesquisa em Biodiversidade (PPBio) do Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT). O método básico da amostragem do PPBio é a da distribuição de parcelas padronizadas (unidades amostrais) em sítios do tipo PELD (Projetos Ecológicos de Longa Duração). Estas parcelas seguem as curvas de nível do terreno na tentativa de manter os mesmos níveis ambientais ao longo da amostragem dos diferentes organismos biológicos (MAGNUSSON; MARTINS, 2005). Áreas de Estudo A coleta do material botânico foi realizada nos dois módulos de savana do PPBio do estado de Roraima: (1) Campo experimental Água Boa, de propriedade da Embrapa Roraima e (2) Campus Experimental do Cauamé, pertencente à Universidade Federal de Roraima (UFRR) (Magnusson; Martins, 2005). Estas savanas possuem um tipo de vegetação representado sob a forma de mosaico com predominância de savana parque, formação predominante no Cauamé, que se desenvolve em relevo plano e levemente ondulado. Outra forma comum é a savana gramíneo-lenhosa, que se caracteriza por apresentar uma cobertura vegetal predominante de gramíneas, esta vegetação também é predominante no módulo Água Boa, bem como a savana do tipo gramíneo lenhosa (campo) com alguns mosaicos pobremente adensados com espécies arbóreo- -arbustivas (Barbosa; Araújo; Melo, 2010). Seleção dos locais e processo de amostragem O protocolo para amostragem da vegetação lenhosa proposto pelo PPBio foi adaptado, visto que as populações de M. rubiginosa possuem uma distribuição aleatória por conglomerados, tendo em vista que a população apresenta este tipo de ocorrência TABELA 1. Amostragem populacional de Miconia rubiginosa nos módulos do PPBio-Roraima ocorrentes em áreas de savana. Módulo Água Boa Ponto de coleta N de Indivíduos Parcelas dos módulos 1 3 WE WE WE Coordenadas geográficas N ,8 W ,0 N ,8 W ,1 N ,2 W ,6 Local de coleta Próximo a veredas de buritizeiros Nas proximidades do igarapé Barragem do igarapé que funciona como estrada WE N ,9 W ,3 Na estrada de acesso ao módulo Cauamé WE N ,0 W ,9 Próximo à margem de curso d água Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

42 670 quando está subdividida em pequenos grupos ou conglomerados (Callegari-Jacques, 2004). Neste caso, utilizando um localizador geográfico (GPS) foram determinados cinco pontos de coleta no módulo Água Boa, onde coletaram-se amostras de 12 indivíduos, e dois pontos no módulo Cauamé, com 6 indivíduos amostrados (tabela 1). Todas as coletas foram realizadas no período chuvoso, porém em dia sem chuva. Coleta e processamento do material vegetal para o estudo fitoquímico Foram coletadas partes aéreas vegetativas de um total de 12 plantas do Água Boa e 6 do Cauamé, evitando coletar partes do vegetal visivelmente afetada por pragas e doenças (Simões et al., 2010). Ainda no sítio de coleta, selecionaram-se ramos férteis para a herborização com a finalidade de confeccionar exsicatas, as quais se encontram depositadas no Herbário UFRR localizado no Centro de Estudos da Biodiversidade sob o número 3930 e 3931 para Cauamé e Água Boa, respectivamente. As amostras foram submetidas a uma triagem e posterior lavagem em água corrente com a finalidade de remover as sujeiras superficiais. Em seguida, o material foi mantido à temperatura ambiente durante 24 h, com a finalidade de retirar o excesso de água. Na sequência, as amostras foram pesadas em balança, colocadas em envelopes de cartolina e secas em estufa de ar circulante a 40 C (Figura 1) e, em seguida moídas em moinho de facas. Obtenção dos extratos e partição por meio de solventes Para a obtenção dos extratos brutos etanólicos (EBE), para o teste de toxicidade, foi realizada a extração por maceração (sólido/líquido). Em um balão volumétrico de 1000 ml foram adicionados 100 g do pó (farinha), resultante da moagem e 500 ml de solução hidroalcóolica (95 % de etanol PA e 5 % água). A solução permaneceu em contato por 28 dias e a cada 7 dias a solução era filtrada utilizando gazes, algodão e funil. Posteriormente, a solução foi concentrada em evaporador rotativo, resultando no EBE (Matos, 2009). Em seguida, o extrato foi acondicionado em recipiente de vidro (Figura 2) e, para uma melhor evaporação do solvente este foi colocado em capela de exaustão. As partições dos EBE foram realizadas com solventes orgânicos de polaridade crescente de acordo com a metodologia proposta por Matos (2009) com algumas modificações. Para esta técnica, pesou-se de 6 a 7 g do extrato bruto das amostras, em balança semianalíca, com o solvente totalmente evaporado. Em seguida, foram preparados 150 ml de solução para a suspensão dos FIGURA 1. Preparação do material vegetal. Lavagem em água corrente, secagem das plantas em temperatura ambiente, pesagem do material fresco, secagem em estufa de ar circulante. extratos, sendo esta composta de 70 % de metanol e 30 % de água destilada. Após o processo de suspensão, adicionou- -se no material ciclohexano homogeneizando, e a solução foi transferida para o funil de separação de ml. Em seguida, foram realizados movimentos rotativos suaves para facilitar a separação das fases. Após esta separação, a fase correspondente ao solvente utilizado foi coletada em Erlenmeyer e, dessa mesma forma, procedeu-se com o diclorometano e acetato de etila seguindo a polaridade crescente. Posteriormente, foi adicionado em cada Erlenmeyer sulfato de sódio anidro PA para a retirada de água, e o mesmo permaneceu em repouso durante 24 h. Em seguida, as fases foram filtradas, com gases e algodão, concentradas em evaporador rotativo e armazenadas em frascos de vidro sendo submetidos à exaustão da capela para a evaporação do solvente. Obtenção dos terpenos Para a obtenção dos compostos da classe terpênica, foram inicialmente selecionadas as partes aéreas da planta coletada no período de Estas foram submetidas ao processo conforme estabeleci- Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

43 671 FIGURA 2. Extração a frio. Solução hidroalcóolica das partes aéreas de Miconia rubiginosa ao abrigo da luz, filtração da solução, concentração da solução em evaporador rotativo à temperatura de 60 C e EBE concentrado. do anteriormente e a fase ciclohexânica foi encaminhada para a Central Analítica do Departamento de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco (DQF-UFPE), sendo então a amostra analisada em cromatografia gasosa no equipamento Shimadzu modelo CGMS-QP2010 com o injetor automático AOC-20 acoplado ao espectrômetro de massa utilizando coluna 00-5MS (30x0, 25 mm) e gás de arraste hélio. Bioensaio de avaliação da toxicidade dos extratos A avaliação de toxicidade foi desenvolvida tomando como base a metodologia descrita por Meyer et al. (1982) e McLaughlin, Rogers e Anderson (1998) com algumas modificações. Assim sendo, foram pesados 50 mg dos EBE e dos SCH, de ambos os locais de coleta, estes foram diluídos em 5 ml de álcool etílico e ciclohexano, respectivamente. A partir desta solução (solução mãe) foram realizadas sucessivas diluições, nas concentrações de 200, 100, 50 e 10 µg/ml (figura 3), sendo estas transferidas para tubos de ensaios para a evaporação do solvente até a obtenção da massa seca. Foi preparado 1L de solução de sal marinho sintético a uma concentração de 3,8 % para a incubação dos ovos de A. salina (46 mg), que foram expostos a luz artificial, aeração constante e ph entre 8,0 e 9,0 durante 48 h para que houvesse a eclosão das larvas. Após a evaporação dos solventes das diferentes concentrações, adicionou-se 50 µl de DMSO (dimetilsulfóxido) e 2 ml de uma solução a 6% do surfactante Tween 80 para auxiliar na solubilização dos extratos. Para efetivar o ensaio, em triplicata, foram colocados 10 exemplares de náuplios em tubos de ensaio, sendo o volume final acrescido com solução salina para 5 ml. Uma triplicata de controle negativo foi preparada sob as mesmas condições, porém sem a presença das amostras testes. Os tubos foram mantidos a uma temperatura de 28 C por 24 h sob luz artificial. Após este período, foi efetuada a leitura do teste contando-se o número de larvas sobreviventes em cada tubo por meio de verificação visual (figura 3), sendo considerados vivos todos aqueles que apresentassem algum tipo de movimento. Foram calculadas as taxas de mortalidade (%) para cada concentração através da razão entre o número de indivíduos mortos ou com inibição de movimentos sobre o número total de larvas submetidas ao mesmo tratamento. A partir dos valores da porcentagem de larvas de A. salina mortas, ajustou- -se uma equação linear simples capaz de levar a óbito 50 % de indivíduos. Para isso foi utilizado o método gráfico (regressão linear) para a obtenção da dose letal (DL 50 ) através do programa estatístico software Origin Microcal versão 6.0, conforme está representado na Figura 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com a análise do rendimento dos extratos, pôde-se observar que foi obtida uma quantidade considerável dos extratos, tendo em vista que se utilizou aproximadamente 100 g da massa seca para a maceração. A média do rendimento do EBE de Água Boa e de Cauamé foi de 8,72 e 8,95 g, respectivamente. No que se refere ao SCH, a média para Água Boa foi de 1,81 g, enquanto que para o Cauamé foi de 1,53 g. A extração com álcool etílico foi realizada quatro vezes, a fim de se extrair ao máximo e assim obter um bom rendimento para a partição, a qual foi realizada utilizando de 6 a 7 g da massa. O rendimento da fase (ciclohexânica) obtida foi calculado a partir da massa do material inicialmente utilizado (massa do EBE). Segundo Yunes e Calixto (2001), a extração por maceração prolongada, possibilita uma extração exaustiva, capaz de extrair diferentes categorias de princípios ativos, o que inclui também as substâncias de polaridades distintas. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

44 672 Diluição Incubação Pós-incubação FIGURA 3. Diluição dos extratos nas diferentes concentrações determinadas, contagem das larvas e esquema geral da metodologia utilizada para efetuar o ensaio. Obtenção de triterpenos por CG/EM Com base nas análises realizadas pelo CG/EM foram obtidos três compostos terpênicos todos evidenciados como triterpênicos, porém dois compostos foram identificados como triterpenos pentacíclicos, tais como α-amirina e β-amirina com pico base de 218 m/z (massa/carga) e 189 m/z (Figura 4). Estes compostos são constituídos por seis unidades de isoprenos apresentando em seu esqueleto básico 30 átomos de carbono. O terceiro composto foi detectado como triterpeno esteroidal, β-sistosterol com pico base de 43 m/z e 315 m/z, também constituído por seis unidades de isopreno, porém com 28 átomos de carbono. Vale destacar que a classe terpênica é constituída com cerca de compostos, além de uma variedade estrutural de 40 tipos de esqueletos básicos (JÚNIOR, 2005). Virtuoso (2005) relata que os esteroides e triterpenos presentes nas plantas estão concentrados geralmente na fração mais apolar, neste caso na fração ciclohexânica, e são conhecidos por possuir importantes atividades farmacológicas, por exemplo, antimicrobianas, antitumoral (Carnesecchi et al., 2004), anti-inflamatórias (Aragão et al., 2007), analgésicas (Rodrigues, 2007). De acordo com Virtuoso (2005) as substâncias α-amirina e β-amirina apresentam atividade antimicrobiana contra as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus, sendo que em seu estudo a α-amirina demostrou um maior potencial entre os triterpenos de Arnebia hispidissima (Lenhm.) DC. (Boraginaceae). Segundo Bruneton (2001), todo fitomedicamento é constituído principalmente por β-sitosterol e este tem uma forte comercialização como fitoterápico na Alemanha. Ademais, é um fitoesteroide que está presente em quase todos os vegetais e ao qual várias atividades são atribuídas. Por exemplo, isolado ou em sinergismo com outros fitoesteroides similares, age na redução do nível de colesterol sanguíneo, sendo algumas vezes usado no tratamento da hipercolesterolemia. Apresenta ainda um efeito positivo no tratamento da perda do cabelo masculino, bem como no tratamento da hipertrofia prostática benigna e do câncer de mama. Além disso, David (2001) referencia que este fitoesteroide age como Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

45 673 Fórmula química: C 30 H 50 O pb 218 m/z, 189 m/z Fórmula química: C 30 H 50 O pb 218 m/z, 109 m/z Fórmula química: C 29 H 50 O pb 43 m/z, 315 m/z FIGURA 4. Estrutura química dos triterpenos de Miconia rubiginosa. anticonceptivo e anti-inflamatório. Avaliação da toxicidade A indicação da atividade in vitro com A. salina é proposta como um simples bioensaio para o monitoramento de extratos vegetais, com o intuito de uma pesquisa preliminar de bioatividade de produtos naturais. É um ensaio bastante indicado pela literatura devido à simplicidade com que pode ser manuseado, o fato de ser de baixo custo, de alta sensibilidade e de rapidez quanto ao resultado, o que favorece a sua utilização corriqueira em vários estudos. Outro fato é que os ovos podem ser armazenados por vários anos sem perder a viabilidade e os mesmos são obtidos comercialmente. Ademais, a letalidade desta forma de vida tem sido empregada para a determinação da toxicidade em relação à incidência de indivíduos mortos e vivos (Sorgeloos; Wielen; Persoone, 1978; Cavalcante, 2000; Luna et al.,2005). Segundo Meyer et al. (1982) concentrações de extratos com valores de DL 50 inferiores a µg/ml são considerados bioativos. O critério estabelecido por Dolabela (1997) para a classificação de toxicidade foi baseado nas concentrações das DL 50, onde: DL 50 menor que 80 µg/ml, foram consideradas altamente tóxicas, enquanto que entre 80 e 250 µg/ml moderadamente tóxicas e acima de 250 µg/ml com baixa toxicidade ou não tóxica. Neste contexto, o EBE de Cauamé apresentou sua maior taxa de mortalidade (93,3 %) na concentração de 200 µg/ml. Já para as concentrações de 100 e 50 µg/ml foram observadas taxas de 53,3 % e 30 %, respectivamente, sendo que na menor concentração (10 µg/ml) ainda houve mortalidade de 3,3% (tabela 2), ressaltando que não houve óbitos no grupo controle. A DL 50 foi de 100,86 µg/ml (tabela 2), sendo considerado ativo, mas moderadamente tóxico conforme os parâmetros de Dolabela (1997). Lage (2011) testou o EBE de Annona crassiflora Mart. contra A. salina, porém este não foi considerado ativo, pois apresentou DL 50 em concentração acima de µg/ml. Em contrapartida, Pereira (2013) testou o EBE de Rhynchantera grandiflora (Aubl.) DC. (Melastomataceae) do módulo de Cauamé nas concentrações de 1000, 500, 200, 100 e 20 µg/ml e observou que na menor concentração a taxa de mortalidade foi de 0%, porém em seu experimento o extrato foi considerado de baixa toxicidade por apresentar DL 50 de 451 µg/ml. No caso do SCH, este também apresentou uma maior taxa de mortalidade nas maiores concentrações semelhante aos resultados do EBE. Entretanto, houve uma variação significativa na concentração de 50 µg/ml, onde foram eliminados 13,3 % dos indivíduos. A dose letal referente ao SCH de Cauamé foi de 86,53 µg/ml (tabela 2), sendo o subextrato considerado moderadamente tóxico, por apresentar a DL 50 em concentração entre 80 e 250 µg/ml. O SCH apresentou-se mais tóxico quando comparado ao EBE. O solvente ciclohexano separa compostos apolares, tais como: esteroides, terpenos e acetofenonas (Yunes; Filho, 1997). Júnior (2003) e Czlusniak et al. (2012) mencionam que as cumarinas, sequisterpenos e triterpenoides são os compostos de maior interesse, pois em diversos estudos já foram evidenciados suas propriedades bioativas. Possivelmente a presença de compostos terpênicos neste subextrato podem estar associada ao efeito da toxicidade, fato comprovado por Cunha et al. (2003) que afirma a potencialidade dessas substâncias em relação ao sinergismo com outras moléculas. Quanto ao EBE do módulo de Água Boa este apresentou a menor DL 50 de 74,10 µg/ml (Tabela 2), sendo considerado altamente tóxico, o que, por sua vez, talvez esteja relacionado à interação de compostos com polaridades diferenciadas. Moshi et al. (2009), em seus experimentos, testaram o extrato bruto etanólico de Dissotis brazzae Cong. (Melastomataceae) contra A. salina. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

46 674 TABELA 2. Taxa de mortalidade de Artemia salina frente aos extratos brutos etanólicos e subextratos ciclohexânicos testados e suas respectivas concentrações e doses letais. Módulo Extrato/Subextrato Concentração (μg/ml) / Taxa de mortalidade % DL 50 μg/ml EBE 93,3 53,3 30 3,3 100,86 Cauamé SCH 96,6 46,6 13,3 3,3 86,53 EBE 90 96,6 53,3 13,3 74,10 Água Boa SCH 83,3 63,3 23,3 3,3 105,72 FIGURA 5. Mortalidade das larvas de Artemia salina em função de diferentes concentrações dos extratos brutos etanólicos e subextratos ciclohexânicos de Miconia rubiginosa (EBE 1 e SCH 1 Cauamé; EBE 2 e SCH 2 Água Boa). Neste caso, não houve morte de larvas em concentrações menores que 1000 µg/ml, sendo o extrato considerado atóxico, ou seja, sem bioatividade. Para SCH a DL 50 foi 105,72 µg/ml (Tabela 2), sendo este subextrato classificado como moderadamente tóxico, o que se assemelha ao EBE de Cauamé. Nas concentrações maiores houve uma taxa de mortalidade de 83,3% e 63,3 %, e esta porcentagem reduziu nas menores concentrações, apesar de que na concentração de 10 µg/ml ainda houve 3,3 % de mortalidade. Comparando este resultado com o de Pereira (2013) em seu experimento com Rhynchanthera grandiflora, na sua menor concentração de 20 µg/ml, foi obtido uma mortalidade de 3,3 %, sendo a DL 50 de 362 µg/ml, onde a mesma considera o extrato de baixa toxicidade. De acordo com a classificação para toxicidade de Dolabela (1997), todos os extratos e subextratos analisados apresentaram efeito tóxico (Figura 5). No entanto, o EBE de Água Boa apresentou um maior perfil de toxicidade, sendo considerado altamente tóxico, diferindo qualitativamente do EBE de Cauamé, que se mostrou moderadamente tóxico. Para os SCH, o grau de toxicidade foi semelhante, ou seja, são subextratos bioativos classificados como moderadamente tóxicos. O estudo fitoquímico e o bioensaio de toxicidade utilizando três espécies do gênero Phyllanthus L. coletados em três ambientes distintos, realizado por Nascimento et al. (2008), concluiu que o bioensaio frente à A. salina é uma análise prévia de substâncias ativas, de modo que, em função do local Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

47 675 de coleta, a atividade biológica pode ser diferente, pois as concentrações letais podem sofrer influência do ambiente onde as plantas são coletadas, o que confirma os dados da presente pesquisa. Segundo Meyer et al. (1982), existe uma boa correlação deste teste com atividades biológicas tais como antifúngica, antimicrobiana, antitumoral, e que por sua vez as frações ou substâncias consideradas bioativas são, ulteriormente, testadas em ensaios de citotoxicidade. McLaughlin (1991) e Dolabela (1997) comentam que os extratos considerados altamente tóxicos para A. salina apresentam alto potencial para essas atividades. Por conseguinte os extratos e subextratos, de ambos locais de coleta, considerados ativos frente à A. salina, tornam considerável o direcionamento para isolamento e identificação das substâncias bioativas presentes nos extratos analisados, além da caracterização da atividade biológica de M. rubiginosa. CONCLUSÕES Através da técnica CG/EM foram obtidos triterpenos, sendo dois pentacíclicos, α-amirina e β-amirina e um tetracícliclo, β-sitosterol e os mesmos já são referenciados pela literatura para várias categorias taxonômicas e também bastante evidenciados no gênero Miconia, bem como para M. rubiginosa. Quanto à toxicidade, foi possível obter a dose letal dos extratos, sendo quase todos os extratos analisados moderadamente tóxicos, exceto o EBE do módulo de Água Boa que demonstrou um maior potencial bioatividade com DL 50 de 74, 1 µg/ml. Todavia, fica claro a necessidade do estudo em relação à fase ciclohexânica para evidenciar o rendimento dos compostos químicos obtidos com relação aos pontos de estudo ora delimitados, com a finalidade de adquirir um melhor conhecimento das substâncias terpênicas. REFERÊNCIAS ALONSO, A. P. O. et al Um olhar sobre o cerrado de Itirapina-SP: avaliações e propostas de trabalho. Disponível em: < ecocampo/bt91/ 2005/R3-b>. Acesso em: 12 de janeiro de ANDRADE, S. F., CARDOSO, L. G.,BASTOS, J. K. Anti-inflamatory and antinociceptive activities of extracts, fractions and populnoic acid from bark wood of Austroplenckia populnea. Journal of Ethnopharmacology, [S.L], v. 109, n. 3, p , ANDREO, M. A. Prospecção químico-farmacológico em plantas superiores: estudo químico sobre o sistema gastrintestinal de Mouriripusa Gardner e Mouririelliptica Martins (Melastomataceae) p. Tese (Doutorado em Química) Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Araraquara, ARAGAO, G. F. et al. Analgesic and anti-inflammatory activities of the isomeric mixture of alpha- and betaamyrin from Protium heptaphyllum (Aubl.) march. Journal of Herbal Pharmacotherapy, [S.l], v. 7, n. 2, p.31-47, BARBOSA, R. I.; ARAÚJO, A. C. O.; MELO, M. C. Relatório 2010 (PPBio)- Núcleo Regional de Roraima. Boa Vista: INPA, p. BAUMGRATZ, J. F. A. et al Melastomataceae Lista de espécies da flora do Brasil. Disponível em: Acesso em: 10 de Dezembro de BRUNETON, J. Farmacognosia: fitoquímica plantas medicinales. 2. ed. Espanha: Acribia, p. CALLEGARI-JACQUES, S. M. Bioestatística: Princípios e aplicações. Porto Alegre: Artmed, p. CAVALCANTE, M. F. Síntese de 1,3,5- Triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente Artemia salina. Química Nova, [S.l], v. 23, n. 1, p.20-22, CLAUSING, G.; RENNER, S. S. Molecular phylogenetics of Melastomataceae and Memecylaceae: implications for character evolution. American Journal of Botany, [S.l], v. 88, n. 3, p , CARNESECCHI, S. et al. Geraniol, a component of plant essential oils, modulates DNA synthesis and potentiates 5-fluorouracil efficacy on human colon tumor xenografts. Cancer Letters, [S.l], v. 215, n. 1, p , CRUZ, A. V. M.; KAPLAN, M. A. C. Estudo comparativo do perfil químico e do uso popular de espécie da família Myrtaceae e Melastomataceae no Brasil. Revista Floresta e Ambiente, [S.l], v. 11, n. 1, p.47-52, CUNHA, W. R. et al. In vitro trypanocidal activity of triterpenes from Miconia species. Planta Médica. [S.l], v. 69, [s.n], p , In vitro inhibition of tumor cell growth by Miconia fallax. Pharmaceutical Biology, Brazil, v. 46, n. 4, p , CZELUSNIAK, K.E. et al. Farmacobotânica, fitoquímica e farmacologia do Guaco: revisão considerando Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schulyz Bip. ex Baker. Planta Médica, Botucatu, v. 14, n. 2, p , DAVID, J. P. et al. Ligninas e triterpenos do extrato citotóxico de Eriope blachetii. Quimica Nova, São Paulo, v. 24, n. 6, p , nov./dec DÉVÉHAT, F. L. et al. Antiviral and cytotoxic activities of some Indonesian plants. Fitoterapia, [S.l], v. 73, n. 5, p , DOLABELA, M. F. Triagem in vitro para a Atividade Antitumoral e Anti Trypanossoma cruzi de Extratos Vegetais, Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas. Dissertação (Mestrado em Farmácia) Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, FENNER, R. et al. Plantas utilizadas na medicina popular com potencial atividade antifúngica. Revista Brasileira de Farmacognosia, [S.l], v. 42, [s.n], p , FUMAGALI, E. et al. Produção de metabólitos secundários em cultura de células e tecidos de plantas: o exemplo dos gêneros Tabernaemontana e Aspidosperma. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

48 676 Revista Brasileira de Farmacognosia, [S.l], v. 18, n. 4, p , GOLDENBERG, R.; MARTIN, C. Taxonomic notes on South American Miconia (Melastomataceae). Harvard Papers in Botany, [S.l], v. 13, n. 2, p , GOLDENBERG, R.; CADDAH, M. K; MARTIN, C. V. Notas taxonômicas sobre Miconia (Melastomataceae) sul-americanas II. Rodiguésia, [S.l], v. 61, [s.n], p.23-28, GOLDENBERG, R.; BACCI, L. F.; MORAES, J. W. A tribo Microlicia (Melastomatacea) no estado do Paraná. Rodriguésia, Paraná, v. 66, n. 1, p , GUNATILAKA, A. A. L. et al. Isolation, Synthesis, and Structure-Activity Relationships of Bioactive Benzoquinones from Miconia lepidota from the Suriname Rainforest. Journal of Natural Products, [S.l], v. 64, n. 1, p.2-5, JÚNIOR, C. V. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle químico de insetos. Quimíca Nova, São Paulo, v. 26, n. 3, p , mai./jun JÚNIOR, R. C. P. L. Efeito antinoceptivo da mistura de triterpenos pentacíclicos α- e β-amirina em modelos de nocicepção visceral em camundongos p. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, LAGE, G. A. Isolamento, identificação química e bioprospcção de metabólitos secundários nas folhas de Annona crassiflora Mart p. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica) Programa de Pós- Graduação em Química, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, LUNA, J. S. et al. A study of larvicidal and molluscicidal activities of some medicinal plants from northeast Brazil. Journal of Ethnopharmacology, [S.l], v. 97, n. 2, p , MACIEL, M. A. M. et al. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, [S.l.], v. 25, n. 3, p , MAGNUSSON, W. E.; MARTINS, M. B. Delineamento espacial e protocolos de coleta-ppbio Amazônia. Ministério da Ciência e Tecnologia/Programa de Biodiversidade, Manaus: INPA/MPEG, p. MANCINI, E. et al. Flavonoids of Miconia alypifolia and their antioxidant activity. Phamacologyonline, [S.l], v. 2, [s.n], p , MATOS, A. F.J. Introdução à fitoquímica experimental. 3. ed. Fortaleza: UFC, MCLAUGHLIN, J. L. Crown gall tumours on potato discs and brine shrimp lethality: two simple bioassays for higher plant screening and fractions. In: Dey PM, Harborne JB (ed.). Methods in Plant Biochemistry. New York, [s.n], p MCLAUGHLIN, J. L.; ROGERS, L. L.; ANDERSON, J. E. The use of biological assays to avaluate botanicals. Drug Information Journal, [S.l], v. 32, [s.n], p , MEYER, B. N. et al. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica, [S.l], v.45, n. 5, p.31-34, MOSHI, M. J. et al. Antimicrobial and brine shrimp toxicity of some plants used in traditional medicine in Bukoba District, North-Western Tanzania. Tanzania Journal of Health Research, [S.l], v. 11, n. 1, p.23-28, jan NASCIMENTO, J. E. et al. Estudo fitoquímico e bioensaio toxicológico frente a larvas de Artemia salina Leach. De três espécies medicinais do gênero Phyllanthus (Phyllanthaceae). Revista de Ciências Framacêuticas Básica e Aplicada. Pernambuco, v. 29, n. 2, p , PEREIRA, P. R. L. Toxicidade de Rhynchanthera grandiflora (Aubl.) DC. (Melastomataceae) frente à Artemia salina Leach p. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) Centro de Estudos da Biodiversidade, Universidade Federal de Roraima, Boa Vista, RAPINI, A. et al. Introdução: espécies raras de fanerógamas do Brasil. In: GIULIETTI, A. M et al. Plantas raras do Brasil. Belo Horizonte: Conservação Internacional e UEFS, 2009, p.496. REZENDE, A. R. Sistemática e conservação de Miconia seção Miconia DC. (Melastomataceae) no estado de Minas Gerais, Brasil p. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) Programa de Pós- Graduação em Biologia Vegetal, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, RODRIGUES, V. E. G.; CARVALHO, D. A. Levantamento etnobotânico de plantas medicinais no domínio do cerrado na região do Alto Rio Grande-Minas Gerais. Ciências Agrotécnica, [S.l], v. 25, n. 1, p , RODRIGUES, J. Uso sustentável da biodiversidade brasileira: prospecção químico-farmacológica em plantas superiores: Miconia spp p. Dissertação (Mestrado em Química) Universidade Estadual Paulista, Araraquara, ROMERO, R.; MARTINS, A. B. Melastomataceae do Parque Nacional da Serra da Canastra, Minas Gerais, Brasil. Revista Brasileira de Botânica, [S.l], v. 25, n. 1, p , nov./set SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 6. ed. Porto Alegre-Florianópolis: UFRGS/UFSC, 2010, 1104p. SPESSOTO, M. A. et al. Evaluation of the analgesic activity of extracts of Miconia rubiginosa (Melastomataceae). Phytochemistry, [S.l], v. 10, n. 6, p , SORGELOOS, P.; WIELEN, C. R. V. D.; PERSOONE, G. The use of Artemia nauplii toxicity tests: A critical analysis. Ecotoxicology and environmental safety, [S.l], v.2, n. 3, p , VIRTUOSO, S. et al. Estudo preliminar da atividade antibacteriana das cascas de Erythrina velutina Willd., Fabaceae (Leguminosae). Revista Brasileira de Farmacognosia, Curitiba v.15, n.2, p , abr./ jun YUNES, R. A.; FILHO, V. C. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Quím. nova, [s.l], v.21, n YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, p. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

49 Crescimento e composição da fração volátil de Mentha arvensis L. cultivada em solução nutritiva com omissão de nutrientes 677 CARVALHO, A.A. 1 ; BERTOLUCCI, S.K.V. 1 ; FIGUEIREDO, F.C. 2 ; PINTO, J.E.B.P. 1* 1 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, Lavras, MG. 2 Instituto Federal do Sul de Minas Gerais, Muzambinho, MG. *Autor para correspondência: jeduardo@dag.ufla.br RESUMO: O presente trabalho teve por objetivo verificar o efeito da omissão de macros e micronutrientes em solução nutritiva, no crescimento de plantas e na composição da fração volátil de Mentha arvensis L.. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), com três repetições e 12 tratamentos: solução completa de Hoagland & Arnon e omissões de nutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Cu, Fe, Mn e Zn) dessa solução. A parcela experimental foi composta por uma planta por vaso. As plantas foram avaliadas quanto à massa seca das folhas, parte aérea, raiz e total. A análise da fração volátil foi realizada por cromatografia gasosa. O crescimento de Mentha arvensis foi afetado pela omissão de quase todos os nutrientes. Sintomas mais intensos de deficiência foram observados na ausência de N, P, Ca e B. As omissões de Mn e de Cu na solução de cultivo não afetaram negativamente o crescimento de Mentha arvensis. Observou-se porcentagem superiores de mentol, em relação ao tratamento controle, na omissão de P, S, Mg, Ca e B da solução nutritiva de Hoagland & Arnon. Palavras-chave: Elemento faltante. Nutrição de plantas. Planta medicinal. Óleo essencial. ABSTRACT: Growth and volatile fraction composition of Mentha arvensis L. in nutritive solution yield with nutrients omissions. This study aimed to determine the effect of the absence of macro and micronutrients in the nutrient solution in plant growth and analysis volatile fraction of the Mentha arvensis plants. The experimental design was a completely randomized design (CRD) with three replications and 12 treatments: complete solution of Hoagland & Arnon and omission of nutrients (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Cu, Fe, Mn and Zn) in this solution. The experimental plot consisted of one plant per pot. Plants were evaluated for dry mass of leaves, shoots, roots and all. The analysis of volatile fraction was performed by gas chromatography. The growth of Mentha arvensis was affected by the omission of almost all nutrients. More intense symptoms were observed in the absence of N, P, Ca and B. The omission of Mn and Cu in the culture solution did not adversely affect the growth of Mentha arvensis. It was observed a higher proportion of menthol, relative to the control, by the omission of P, S, Mg, Ca and B in the Hoagland & Arnon nutritive solution. Keywords: Missing element. Plant nutrition. Medicinal plants. Essential oil INTRODUÇÃO A hortelã-japonesa ou menta (Mentha arvensis L.) é uma planta herbácea pertencente à família Lamiaceae. Destaca-se no uso culinário ou em chás medicinais, e há também amplo interesse industrial para a fabricação de produtos farmacêuticos, higiene, alimentos e bebidas, cosméticos, aromatizantes e flavorizantes (Lorenzi & Matos, 2002; Garlet et al., 2007). Na literatura há poucas informações sobre a adubação mineral e exigências nutricionais de plantas medicinais, principalmente no Brasil (Blank et al., 2006). Para Mentha arvensis, um estudo conduzido por Garlet & Santos (2008), em solução nutritiva, permitiu concluir que nitrogênio, cálcio e potássio são os macronutrientes de maior concentração em todas as partes dessa erva. A técnica do elemento faltante é uma metodologia usada para a identificação de deficiências nutricionais. Envolve o crescimento de uma planta sob condições de campo ou na casa de vegetação, em que é testado um tratamento completo (com todos os nutrientes necessários em doses adequadas) e uma série de tratamentos, nos quais é feita a omissão de um nutriente de cada vez (Silva et al., 2005). Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/ 0133 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

50 678 A hortelã-japonesa concentra óleos voláteis ricos em terpenoides, sendo o mentol o composto orgânico encontrado em maior proporção. A biossíntese dos metabólitos secundários em plantas medicinais e aromáticas depende de fatores genéticos, fisiológicos, ambientais e nutricionais da planta. Esses fatores podem atuar isoladamente ou exercer influência conjunta no metabolismo secundário (Freitas et al., 2004; Souza et al., 2007). A deficiência de alguns elementos essenciais pode estimular a formação de certas moléculas em detrimento de outras, reforçando o papel exercido pelas condições nutricionais na produção de substâncias pelo metabolismo especial ou secundário (Souza et al., 2007). A concentração de metabólitos secundários utilizados para defesa do vegetal tende a ter uma concentração inversa às taxas de crescimento, por ser este o custo da defesa das plantas, com o desvio de substâncias que poderiam gerar açúcares, proteínas e gorduras para produção de metabólitos secundários (Garlet et al., 2007). Por outro lado, Paulus et al. (2008) observaram o maior rendimento de óleo essencial no tratamento que apresentou maior produção de massa seca e, ao mesmo tempo, a maior concentração de óleo na massa seca de M. arvensis. Como resposta à demanda farmacêutica, a obtenção de princípios ativos vegetais está deixando de ser extrativista e assumindo caráter produtivo com sustentabilidade. Na busca por qualidade superior da matéria prima de origem vegetal, o cultivo sistemático aparece como uma saída promissora (Pichi et al., 2012). Diante do exposto, o presente trabalho teve por objetivo verificar o efeito da ausência de macro e micronutrientes em solução nutritiva no crescimento de plantas e qualidade da fração volátil de Mentha arvensis. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado durante os meses de setembro e de outubro em casa de vegetação do Departamento Ciência do Solo, na Universidade Federal de Lavras (Lavras, MG). O município de Lavras está situado na região Sul do estado de Minas Gerais e, de acordo com a classificação climática de Köppen, o clima regional é do tipo Cwa com clima temperado chuvoso (mesotérmico) com inverno seco e verão chuvoso, subtropical, com inverno seco (Dantas et al., 2007). Exsicatas de hortelã-japonesa (Mentha arvensis L.), família Lamiaceae, estão depositadas no herbário ESAL, do Departamento de Biologia da UFLA, sob o registro n As mudas foram produzidas a partir de plantas matrizes disponíveis no Horto de Plantas Medicinais da UFLA. Microestacas apicais de 5 cm de comprimento e 2 mm de diâmetro foram enraizadas em bandejas de poliestireno de 128 células, contendo o substrato comercial Plantmax. Após 15 dias da propagação, as plantas foram transferidas para a solução nutritiva de Hoagland & Arnon (1950), com 20% da sua força iônica, onde ficaram por 15 dias para adaptação. Após o período de adaptação, as plantas foram individualizadas em vasos com capacidade para três litros de solução nutritiva com 100% da força iônica, aplicando-se os tratamentos empregados sob a técnica do elemento faltante, durante 45 dias. A solução completa possuía as seguintes concentrações: 210,1 de N; 31,0 de P; 234,6 de K; 200,4 de Ca; 48,6 de Mg; 64,2 de S; 0,5 de B; 0,02 de Cu; 0,6 de Cl; 5 de Fe; 0,5 de Mn; 0,01 de Mo e 0,05 de Zn em mg L -1. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), com três repetições e 12 tratamentos: solução completa e omissões de (N; P; K; Ca; Mg; S; B; Cu; Fe; Mn; e Zn) da solução nutritiva de Hoagland & Arnon. A parcela experimental foi composta por uma planta por vaso. Os vasos foram pintados em sua superfície externa com tinta alumínio e foi colocada uma tampa de isopor com pequeno orifício no centro para a fixação da planta. As soluções foram trocadas quinzenalmente e mantidas sob aeração constante durante todo o período experimental. As soluções estoques e nutritivas foram preparadas com reagentes p.a. e água deionizada. Durante o intervalo de renovação das soluções, o volume dos vasos foi completado, sempre que necessário, utilizando-se água deionizada. Ao final do período experimental, os sintomas foram observados, descritos e fotografados. O material colhido foi lavado em água destilada, acondicionado em saco de papel e colocado em estufa com circulação forçada de ar a 40 o C, até atingir massa constante. As plantas foram avaliadas quanto à massa seca da parte aérea, folha, raiz e total. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott & Knott, a 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa computacional Sisvar (Ferreira, 2011). Para a análise da fração volátil, foi coletada uma amostra composta contendo 90 mg de folhas secas para cada tratamento. As análises químicas foram realizadas por headspace-cg/em empregando um cromatógrafo gasoso Agilent 7890A acoplado a um detector seletivo de massas Agilent MSD 5975C. As concentrações dos constituintes presentes na fração volátil foram expressas pela porcentagem de área relativa dos picos cromatográficos. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

51 679 RESULTADOS E DISCUSSÃO Para todas as variáveis analisadas nesse experimento observou-se que as médias dos tratamentos diferiram estatisticamente (Tabela 1). TABELA 1. Massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca das folhas (MSF), massa seca da raiz (MSRA), e total (MST) de Mentha arvensis cultivada em solução nutritiva com omissão de nutrientes. Tratamento MSPA (g/vaso) MSF (g/vaso) MSRA (g/vaso) MST (g/vaso) Completo 9,21a 9,27a 3,06a 21,55a -N 0,84d 0,74g 0,60c 2,18f -P 1,83d 2,22f 1,48b 5,53e -K 3,85c 6,79c 1,24b 11,88d -Ca 1,19d 2,31f 0,53c 4,03f -Mg 6,89b 6,24c 3,36a 16,49c -S 4,97b 4,73d 3,04a 12,73d -B 2,27d 3,63e 1,09b 7,00e -Cu 8,77a 9,41a 3,26a 21,45a -Fe 6,10b 6,72c 3,26a 16,10c -Mn 8,07a 8,61a 2,84a 19,52b -Zn 6,51b 7,69b 3,58a 17,78b C.V. (%) 18,63 9,53 14,51 10,77 Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott & Knott a 5% de probabilidade. Verificou-se que a ordem de limitação nutricional foi: N>P=Ca>B>S>Mg=Fe=K>Zn>Mn =completo=cu para massa seca de folhas e N=C a=p=b>k>s=fe=zn=mg>mn=cu=completo para massa seca de parte aérea. Os tratamentos com omissão Cu e Mn não diferiram estatisticamente dos resultados obtidos pelo tratamento controle para as variáveis massa seca das folhas e da parte aérea. Garlet & Santos (2008), ao trabalharem com a Mentha arvensis em sistema hidropônico, encontraram resultados semelhantes para estes dois nutrientes. Isto demonstra que estes nutrientes não afetam negativamente o crescimento desta espécie, pois mesmo em sua ausência a planta se desenvolveu com a mesma capacidade de que quando colocadas sob o tratamento controle. Além do N, as omissões de B, Ca e P reduziram a produção de massa seca da parte aérea. A deficiência de B reduz a atividade da ATPase e, consequentemente, a disponibilidade de energia necessária à absorção iônica ativa, podendo reduzir a absorção de Ca (Malavolta, 2006). A interação entre omissão de B e redução nos teores de Ca deve estar baseada no fato de que ambos os nutrientes exercem função estrutural nas membranas e na parede celular (Marschner, 2012). A ordem de limitação nutricional para produção de massa seca de raízes foi: Ca=N>B=K =P>Zn=Mn=Fe=Cu=S=Mg=completo. As omissões de Mg, S, Cu, Fe, Mn e Zn não reduziram a massa seca do sistema radicular, sendo estatisticamente igual a solução completa. Reduções drásticas de massa seca de raiz foram observadas na supressão de N e Ca. Menores massas secas de raiz também foram encontradas com a retirada de P, K e B da solução nutritiva. De acordo com Taiz & Zeiger (2009), plantas em condições de deficiências nutricionais tendem a investir mais energia na produção de raízes para ampliar o potencial de absorção desses nutrientes. A produção de massa seca total das plantas foi mais limitada pelos seguintes nutrientes: N=Ca>P =B>K=S>Fe=Mg>Zn=Mn>Cu=completo. De acordo Sanchez & Uehara (1980), considera-se como deficiência severa quando a produção de massa seca cai a 40% em relação ao tratamento completo. Ao analisar as massas secas totais, verifica-se que as omissões de N, Ca, P, B, K e S, resultaram em deficiência severa com reduções de (90, 81, 74, 68, 45 e 41%) respectivamente. Foram observados sintomas característicos com a omissão dos nutrientes estudados em solução nutritiva (Figura 1). A omissão de N causou clorose generalizada nas folhas mais velhas. Com o avanço do cultivo, toda a planta se mostrou clorótica, além de menor crescimento, menor número de hastes, folhas e do sistema radicular (Figura 1A). A deficiência de N inibe o crescimento vegetal, pelo fato desse nutriente ser constituinte de muitos componentes da célula vegetal, incluindo aminoácidos e ácidos nucléicos. A clorose generalizada em folha velha foi observada devido a alta mobilidade do nutriente na planta (Marchner, 2012). As plantas deficientes em P também apresentaram menor tamanho e menor número de hastes e folhas, quando comparados às plantas do tratamento controle. As raízes ficaram menos densas e com coloração verde mais escura (Figura 1B). De acordo Taiz & Zeiger (2009), o crescimento reduzido é um dos sintomas característicos da deficiência de P que está presente em diversos compostos orgânicos essenciais e participa de processos de transferência de energia. Segundo Coelho et al. (2011), a coloração verde escura aparece devido ao decréscimo da síntese de proteína, quando o P está deficiente resultando no aumento da quantidade de açúcares nos órgãos vegetativos da planta, favorecendo a síntese de antocianina nas folhas que produz a coloração. Na ausência de K ocorreu redução no crescimento da parte aérea e raiz e com o decorrer Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

52 680 FIGURA 1. Sintomas visuais de deficiência mineral em Mentha arvensis. Aspecto geral da parte aérea e do sistema radicular. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , Legenda: A) - Nitrogênio; G) - Boro; B) - Fósforo; H) - Cobre; C) - Potássio; I) - Ferro; D) - Cálcio; J) - Manganês; E) - Magnésio; K) - Zinco. F) - Enxofre;

53 681 do tempo, clorose nas folhas mais velhas com posterior necrose na sua extremidade (Figura 1C). Os sintomas típicos de deficiência de K, clorose e posterior necrose dos ápices e margens das folhas mais velhas podem também ser explicados ao acúmulo de putrescina tetrametilenodiamina (Pulga et al., 2010). As plantas sob deficiência de Ca tiveram o crescimento afetado negativamente, com folhas menores e em menor número. O sistema radicular teve o crescimento reduzido, e as raízes se tornaram mais escuras quando comparadas com plantas do tratamento controle (Figura 1D). Epstein & Bloom (2004), mencionam que os sintomas de deficiência de Ca aparecem mais cedo, e, mais severamente, em regiões meristemáticas e folhas jovens. Como o nutriente não é redistribuído, os pontos de crescimento são danificados ou mortos e o crescimento das raízes é severamente afetado. Na ausência do Mg, as folhas desenvolveram sintoma típico, com clorose internerval nas folhas mais velhas (Figura 1E). Esse padrão de clorose, segundo Taiz & Zeiger (2009), ocorre porque a clorofila nos feixes vasculares permanece inalterada por períodos mais longos do que a clorofila nas células entre os feixes. Na omissão do S ocorreu clorose generalizada do limbo foliar das folhas novas (Figura 1F). Como o S é um constituinte essencial das proteínas, a deficiência desse elemento resulta na inibição da síntese de proteínas e aminoácidos, que contêm esse elemento, como, por exemplo, a metionina, cistina e a cisteína (Marschner, 2012). Em relação aos micronutrientes, a omissão do B causou menor crescimento quando comparados ao tratamento completo (Figura 1G). Com a progressão do sintoma, as folhas lançadas pela planta eram menores, mal formadas e encarquilhadas além da diminuição do sistema radicular. De acordo com Taiz & Zeiger (2009), em plantas com pouca mobilidade do boro, a deficiência resulta em necrose de tecidos meristemáticos na região de crescimento, conduzindo à perda da dominância apical. Na ausência do Cu, as folhas possuíam sintomas de perda de turgidez e de água, semelhante uma desidratação (Figura 1H). Na planta o cobre é considerado parcialmente móvel, o que faz com que os sintomas visuais de sua deficiência apareçam primeiramente nas folhas mais novas. As folhas mais novas tornam-se cloróticas e murchas, e há envergamento excessivo das lâminas foliares, inclusive com quebra (Malavolta, 2006). Na ausência de Fe, as plantas desenvolveram clorose internerval nas folhas novas e um reticulado constituído de nervuras rudimentares muito finas. O sistema radicular apresentou coloração alaranjada (Figura 1I). Garlet & Santos (2008), relatam que os sintomas de clorose observados em plantas deficientes em ferro podem ser causados por distúrbio na estrutura do cloroplasto, como consequência da inibição na síntese de lipídios. Já na ausência do Mn, as plantas desenvolveram sintoma típico, com clorose nas folhas novas (Figura 1J). De acordo com Kirkby & Römheld (2007), o Mn atua diretamente na fotossíntese e indiretamente na formação de carboidratos. Assim, deficiências leves de Mn afetam a fotossíntese e diminuem o nível de carboidratos solúveis na planta. Na ausência do Zn foi observado redução dos internódios e aumento da brotação (Figura 1K). O ácido indolacético (AIA) está intimamente relacionado com os sintomas de deficiência de zinco, portanto, quando ocorre deficiência desse micronutriente, menos AIA é sintetizado, como também, o que é produzido está sujeito a uma maior degradação oxidativa (Kirkby & Römheld, 2007). Ressalta-se que a produção de plantas sem sintomas visuais de deficiência nutricional, matéria prima de qualidade e padronizada, é de grande interesse para a indústria na produção de fitoterápicos e para o produtor, aumentando sua rentabilidade (Rodrigues et al., 2004). No presente estudo foram identificados 22 constituintes (tabela 2). Com relação aos principais constituintes da fração volátil, destacamse as variações em mentol (71,39 a 86,19%), isomentona (4,22 a 5,07%), mentona (0,88 a 7,47%), α-pineno (0,94 a 1,97%), 3-octanol (0,57 a 1,28%) e d-limoneno (0,89 a 4,81%). Garlet et al. (2007) identificaram por destilação 21 constituintes que, na média, corresponderam a 97,95% do total. Os componentes majoritários encontrados foram mentol com 57,13 a 71,20% e mentona com 13,83 a 26,47%, alfa-pineno com 0,17 a 0,43%, beta-pineno com 0,23 a 0,57%, limoneno com 1,00 a 2,30% e acetato de mentila com 0,63 a 1,17%. Foram detectados traços (<0,1%) de 3-octanol, (Z)-beta-ocimeno, (E)-beta-ocimeno, carvonatacetona e biciclogermacreno em todas as amostras. Quando os nutrientes P, S, Mg, Ca e B foram omitidos da solução de cultivo observou-se porcentagem superiores de mentol em relação ao tratamento controle (solução completa), apesar do crescimento do vegetal ser prejudicado na omissão desses nutrientes, principalmente para Ca e B, como discutido anteriormente. Rodrigues et al. (2004), cultivando Mentha piperita com diversas soluções de fósforo, obtiveram aumento na produção de massa fresca e seca com o aumento das dosagens de fósforo, que Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

54 682 Tabela 2. Área relativa (%) de picos cromatográficos da fração volátil de Mentha arvernsis. I.R COMPONENTES Compl N P K Ca Mg 932 α-pineno 1,69 1,24 1,28 1,55 1,34 1, sabineno 0,80 0,58 0,51 0,72 0,55 0, β-pineno 1,45 1,06 1,10 1,34 1,14 1, mirceno 1,14 0,71 0,52 1,00 0,70 0, octanol 1,28 0,65 0,93 1,12 0,86 0, d-limoneno 2,51 3,17 1,20 2,46 1,78 3, ,8-cineaol 0,21 0,17 0,16 0,19 0,16 0, β-cis-ocimeno 0, , terpinoleno 0, hidrato de cissabineno 0,82 0,70 0,80 0,81 0,68 0, iso-pulegol 0,35 0,28 0,30 0,32 0,28 0, mentona 3,67 5,88 0,88 6,32 3,00 1, iso-mentona 4,97 4,22 4,24 5,07 4,67 4, lavandulol 0,11 0,15-0,10-0, mentol 76,65 76,05 84,36 75,22 81,25 80, iso-mentol 0,35 0,17 0,44 0,28 0,42 0, α-terpineol 0,25 0,17 0,20 0,21 0,22 0, cis-3-hexenil isovalerato 0,42 0,44 0,29 0,47 0,37 0, piperitone 0,76 0,36 0,61 0,56 0,58 0, β-cubebeno 0,78 0,99 0,39 0,68 0,41 0,77 Total 98,46 98,90 98,85 98,48 98,60 98,34 I.R COMPONENTES S B Cu Fe Mn Zn 932 α-pineno 1,41 0,94 1,97 1,95 1,83 1, sabineno 0,63 0,37 1,00 0,94 0,90 0, β-pineno 1,19 0,81 1,66 1,66 1,57 1, mirceno 0,87 0,42 1,44 1,38 1,27 1, octanol 0,63 0,57 1,02 1,15 1,04 0, d-limoneno 3,57 0,89 3,53 3,79 4,03 4, ,8-cineaol 0,17 0,12 0,24 0,23 0,22 0, β-cis-ocimeno - - 0,16 0,13 0,16 0, terpinoleno - - 0,11 0,11 0,10 0, hidrato de cissabineno 0,61 0,48 0,81 0,82 0,75 0, iso-pulegol 0,27 0,26 0,35 0,34 0,34 0, mentona 2,69 1,38 5,24 5,42 7,47 6, iso-mentona 4,49 4,00 4,97 4,89 4,88 4, lavandulol - - 0,08 0,08 0,08 0, mentol 79,79 86,19 73,43 73,18 71,39 71, iso-mentol 0,39 0,39 0,23 0,30 0,22 0, α-terpineol 0,22 0,20 0,21 0,22 0,24 0, cis-3-hexenil isovalerato 0,39 0,20 0,37 0,36 0,48 0, piperitone 0,51 0,56 0,79 0,65 0,78 0, β-cubebeno 0,64 0,45 0,79 0,70 0,77 0,73 Total 99,02 98,48 98,59 97,33 98,51 98,53 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

55 683 não aumentou os teores de óleo essencial, não significando, portanto, ganhos de produção de óleo por planta. A concentração de metabólitos secundários utilizados para defesa das plantas tende a apresentar concentração inversa às taxas de crescimento, havendo então desvio de compostos do metabolismo primário (açúcares, proteínas, lipídios) para produção de metabólitos secundários, tais como os terpenoides. No entanto, um teor elevado de óleo por si só pode não ter interesse agrícola, pois plantas que produzam muito óleo, porém com baixa produção de folhas, resultarão em baixo rendimento de óleo por área (Garlet et al., 2007). Souza et al. (2007) verificaram que menores doses de N resultaram em maior produção de óleo essencial e as plantas sob maiores doses de N apresentaram menor rendimento de óleo essencial e maior ganho de biomassa. Em todos os tratamentos, com exceção da omissão de K e Cu, observou-se a redução na porcentagem de iso-mentona em relação ao controle. Para mentona, verificou-se porcentagens superiores ao controle nos tratamentos com omissão dos nutrientes Cu, Fe, N, K e Zn. As plantas na solução completa apresentaram valores numéricos maiores para 3-octanol e para o α-pineno, a exceção dos tratamentos sem Cu, Fe, Mn e Zn. Em relação ao d-limoneno, porcentagens maiores do que o controle verifica-se nos tratamentos com omissão de Cu, S, Fe, Mg, Mn, N e Zn. Maia (1998) observou que a omissão do nitrogênio, fósforo, potássio e cálcio reduziu significativamente a produção de material verde da planta de hortelã inteira e que as proporções de limoneno, mentona, mentol e mentil acetato no óleo essencial foram alteradas pelas condições de nutrição da planta. De maneira geral, as omissões de Mn e de Cu na solução de cultivo não afetou negativamente o crescimento de M. arvensis. Sintomas de deficiência nutricional mais intensos em hortelã-japonesa foram observados na omissão de N, P, Ca e B. Observouse porcentagem superiores de mentol, em relação ao tratamento controle, na omissão de P, S, Mg, Ca e B da solução de Hoagland & Arnon. AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro e concessão de bolsas de estudo. REFERÊNCIAS BLANK, A.F. et al. Efeitos da adubação química e da calagem na nutrição de melissa e hortelã-pimenta. Horticultura Brasileira, v.24, n.2, p , COELHO, L. et al. Caracterização de sintomas visuais, parâmetros de crescimento e desenvolvimento de Tagetes erecta sob deficiências nutricionais. Revista Agrarian, v.4, n.12, p , DANTAS, A.A.A.; CARVALHO, L.G.; FERREIRA, E. Classificação e tendências climáticas em Lavras, MG. Ciência e Agrotecnologia, v. 31, n. 6, p , EPSTEIN, E.; BLOOM, A.J. Mineral nutrition of plants: principles and perspectives. Sunderland: Sinauer Associates, p. FERREIRA, D.F. Sisvar: a computer statistical analysis. Ciência e Agrotecnologia, v.35, n. 6, p , FREITAS, M.S.M. et al. Produção e qualidade de óleos essenciais de Mentha arvensis em resposta à inoculação de fungos micorrízicos arbusculares. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.39, n.9, p , GARLET, T.M.B.; SANTOS, O.S. Solução nutritiva e composição mineral de três espécies de menta cultivadas no sistema hidropônico. Ciência Rural, v.38, n.5, p , GARLET, T. et al. Produção de folhas, teor e qualidade do óleo essencial de hortelã-japonesa (Mentha arvensis L. forma piperascens Holmes) cultivada em hidroponia. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.9, n.4, p.72-79, GARLET, T.M. et al. Crescimento e teor de óleo essencial de mentas com diferentes concentrações de potássio na solução nutritiva. Horticultura Brasileira, v.25, n.2, p , HOAGLAND, D.R.; ARNON, D.I. The water culture method of growing plants without soil. Califórnia, University of Califórnia, p. KIRKBY, E.A.; RÖMHELD, V. Micronutriente na fisiologia de plantas: funções, absorção e mobilidade. International Plant Nutrition Institute, v.118, p.1-24, LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. São Paulo, Plantarum, p. MAIA, N.B. Efeito da nutrição mineral na qualidade do óleo essencial da menta (Mentha arvensis) cultivada em solução nutritiva. In: MING, L.C. Plantas medicinais aromática e condimentares: avanços na pesquisa agronômica. Botucatu: UNESP, p MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, p. MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. 3.ed London: Elsevier, p. PAULUS, D. et al. Solução nutritiva para produção de menta em hidroponia. Horticultura Brasileira v.26, n.1, p.61-67, PICHI, D.G. et al. Cálcio e fitorreguladores no desenvolvimento e estado nutricional de Mentha spicata x suaveolens cultivada em solução nutritiva. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.14, n.3, p , PULGA, A. et al. Omissão de macronutrientes no Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

56 684 crescimento e no estado nutricional da chicória cultivada em solução nutritiva. Agrarian, v.3, n.7, p.56-62, RODRIGUES, C.R. et al. Nutrição mineral, crescimento e teor de óleo essencial da menta em solução nutritiva sob diferentes concentrações de fósforo e épocas de coleta. Horticultura Brasileira, v.22, n.3, p , SANCHEZ, P.A.; UEHARA, G. Management considerations for acid soils with high phosphorus fixation capacity. In: KHASAWNEH, F.E. et al. (Ed.). The role of phosphorus in agriculture. Madison: ASA, p SILVA, E.B. et al. Limitações nutricionais para crescimento de mudas de umbuzeiro em Latossolo Vermelho distrófico no Norte de Minas. Acta Scientiarum Agronomy, v. 27, n.1, p , SOUZA, M.A.A.D. et al. Produção de biomassa e óleo essencial de hortelã em hidroponia em função de nitrogênio e fósforo. Horticultura Brasileira, v.25, n.1, p.41-48, TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 4.ed. Porto Alegre: Artmed, p. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

57 Crescimento in vitro de Mentha arvensis L. Cultivada com diferentes concentrações de sacarose 685 OLIVEIRA, T. 1,* ; PACHECO, F.V. 1 ; ALVARENGA, I.C.A. 1 ; BERTOLUCCI, S.K.V. 1 ; PINTO, J.E.B.P. 1 1Setor de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais, Departamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brasil; *Autor para correspondência: thaina.agronomia@gmail.com RESUMO: A Mentha arvensis L. é uma planta aromática, perene, de crescimento rápido e fácil, que produz um óleo essencial rico em mentol, muito utilizado em indústrias farmacêuticas e alimentícias. Objetivou-se com este trabalho, verificar o efeito de diferentes concentrações de sacarose no crescimento e acumulo de pigmentos fotossintéticos da espécie. Os explantes foram obtidos de plantas já estabelecidas (MS/2 + 1,5% de sacarose + 0,1 ANA, 40 dias). Segmentos nodais de 1 cm e um par de gemas, foram inoculados em meio MS, com ph 5,7±0,1, solidificado com 0,6% de ágar e diferentes concentrações de sacarose: 0%; 1,5%; 3,0% 4,5% e 6,0%. O crescimento foi avaliado a partir da massa seca da parte aérea, número de brotos, massa seca da raiz, número de raiz, comprimento da raiz, comprimento da parte aérea. Os pigmentos fotossintetizantes foram clorofila a, b e total e carotenoide. As concentrações de sacarose influenciaram significativamente nas variáveis de crescimento, apresentando respostas quadráticas positivas. A maior produção de massa seca foi encontrada na concentração de 3,0% de sacarose adicionada ao meio MS. As clorofilas a e b tiveram seu maior acúmulo na concentração de 3% de sacarose. Os carotenoides não foram influenciados pelos teores de sacarose. A maior concentração da clorofila a e b no tratamento com 3% de sacarose pode ter proporcionado maior eficiência fotossintética promovendo o aumento no crescimento observado nessas condições. Desta forma, a concentração de 3% de sacarose é indicada para o cultivo in vitro de Mentha arvensis. Palavras-chave: Planta medicinal; mentol; meio de cultura ABSTRACT: In vitro grwth of Mentha arvensis L. cultivated in different sucrose concentrations. Mentha arvensis L. is an aromatic plant, perennial, fast and easy growth, which produces an essential oil rich in menthol, widely used in pharmaceutical and food industries. This study aimed to verify the effect of different concentrations of sucrose on growth and accumulation of photosynthetic pigments. The explants were obtained from plants already established (MS / % sucrose ANA, 40 days). Nodal segments 1 cm and a pair of buds were inoculated in MS medium at ph 5.7 ± 0.1, solidified with 0.6% agar and different sucrose concentrations: 0%; 1.5%; 3.0% 4.5% and 6.0%.The growth was estimated from the dry weight of shoot, number of buds, root dry mass, root number, root length, shoot length. The photosynthetic pigments were chlorophyll a, b total and carotenoids. The sucrose concentrations significantly influenced the growth variables, presenting positive quadratic responses. The highest dry matter production was found at a concentration of 3.0% sucrose added to the MS medium. A and b chlorophylls had their highest accumulation in the concentration of 3% sucrose. Carotenoids were not affected by sucrose levels. The higher concentration of chlorophyll a and b on treatment with 3% sucrose can be provided more effectively photosynthetic efficiency promoting largest growth observed under these conditions. Thus, the 3% concentration of sucrose is indicated for the in vitro cultivation of Mentha arvensis. Keywords: medicinal plant, menthol, culture medium INTRODUÇÃO A Mentha arvensis L. (Lamiaceae), conhecida como hortelã do campo, menta japonesa, vick ou menta, é uma planta medicinal aromática de grande interesse econômico, devido ao seu óleo essencial rico em mentol (50 a 70% do óleo essencial) (Martins et al., 1994). O mentol é um composto largamente utilizado na indústria Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/ 0136 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

58 686 alimentícia, farmacêutica e química (Barros et al., 2015). Assim, seu óleo participa na composição de perfumes e aromatizantes de uso oral, tais como cremes dentais, antissépticos bucais, antiácidos, pastilhas refrescantes, gomas de mascar, licores, aditivos para cremes alimentícios e em cigarros. A M.arvensis possui propriedades terapêuticas como descongestionante nasal, contra flatulência, e em casos de náuseas e vômitos (Mosciano, 2005). O cultivo in vitro tem se tornado uma técnica importante para a multiplicação de plantas medicinais, visto que permite a obtenção de genótipos produtores de compostos de interesse e um grande número de plantas geneticamente idênticas, que podem ser levadas a campo ou mesmo ser cultivadas in vitro, e que fornecem altos rendimentos de princípios ativos (Costa et al., 2007; Botrel et al., 2015). No entanto, para sucesso dessa técnica, é necessário determinar quais condições são ideais para cada espécie, visto que cada uma possui necessidades específicas de luz, concentrações de sais e sacarose e reguladores específicos. Em relação às condições de luz, por exemplo, estudos in vitro realizados com diferentes espécies de batatas mostrou que essas espécies apresentam maior crescimento e produção de pigmentos quando se desenvolvem sob espectro de luz vermelho (Rocha et al., 2015). Por outro lado, a Achillea millefolium L. apresenta maior crescimento sob espectro de luz azul (Alvarenga et al., 2015). Outro fator que altera o uso do cultivo in vitro é a concentração de sacarose. A sacarose é a principal fonte de carboidrato fornecido para as plantas no cultivo in vitro, uma vez que os explantes não dispõem de condições adequadas para a realização da fotossíntese (Reis et al., 2008). Assim, a sacarose é importante para o processo de enraizamento in vitro (Adelberg et al., 2007). Além disso, a sacarose influencia a regulação osmótica, crescimento e metabolismo das plantas (Kumar et al., 1984). Observa-se que a ausência da sacarose no meio de cultura promove baixos índices de enraizamento e morte dos explantes (Barrales-Lopez et al., 2015). Contudo altas concentrações de sacarose podem ser prejudiciais para o desenvolvimento de algumas espécies (Pasqual & Lopes, 1991). Schmildt et al. (2015), estudando o limoeiro Citruslimonia osbeck cv. Cravo, verificaram um maior crescimento em altas doses de sacarose (60 g L -1 ). Já um estudo com Billbergia zebrina verificou maior desenvolvimento do sistema radicular dos brotos quando cultivadas em meio com 15 g L -1 de sacarose (Martins et al., 2015). Embora existam estudos verificando o estabelecimento e multiplicação de Mentha arvensis in vitro (Shasany et al., 1998, Phatak et al., 2002, Christi et al., 2006), o efeito de diferentes concentrações de sacarose não foi verificado na literatura. Assim, devido à importância econômica da menta e a influência da sacarose no cultivo in vitro, objetivou-se verificar o efeito de diferentes concentrações de sacarose no crescimento e acúmulo de pigmentos fotossintéticos da espécie. MATERIAL E MÉTODOS As plantas matrizes, já estabelecidas in vitro, foram sendo subcultivadas a cada 40 dias, em meio MS/2 (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com 1,5% sacarose e 0,1 mg.l -1 de ANA (ácido naftalenoacético), e mantidas em sala de crescimento, com lâmpadas brancas frias fluorescentes e intensidade de 32 µmols. m -2.s -1, com fotoperíodo de 16 h, e temperatura de 25 +/- 2,0ºC. Para estabelecimento dos experimentos, os explantes foram excisados com aproximadamente 1,0 cm em capela asséptica de fluxo laminar. Posteriormente, foram inoculados em tubos de ensaio com 10,0 ml meio MS com 0,6% de ágar e ph 5,7+/-1, aferido antes da autoclavagem, e complementados com diferentes doses de sacarose. Os tratamentos foram: 0%-controle; 1,5%; 3,0% 4,5% e 6,0% de sacarose, adicionados ao meio basal MS completo. Aos 45 dias, as plântulas foram avaliadas quanto ao número de brotos (NB), comprimento a parte aérea (CPA), número de folhas (NF), número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR), matéria seca da parte aérea (MSPA), matéria seca da raiz (MSR), O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) com cinco tratamentos, contendo seis repetições com cinco tubos por repetições, totalizando trinta tubos por tratamento, com um explante por tubo. Para a determinação das massas secas, o material vegetal foi seco em estufa de circulação forçada de ar a 40ºC até peso constante. Posteriormente, o material vegetal desidratado foi pesado em balança analítica (precisão de 0,1 mg) e as matérias secas foram expressas em miligramas por planta (mg/planta). A extração e a quantificação das clorofilas a e b e dos carotenoides foram realizadas segundo a metodologia de Lichtenthaler & Buschmann (2001). Amostras de 0,2g da matéria fresca de parte aérea foram homogeneizadas em 40 ml de acetona 80%, seguida da leitura em espectrofotômetro nos comprimentos de onda 663, 645, e 470 nm, respectivamente. Os procedimentos foram realizados na ausência de luz para evitar a degradação dos pigmentos. Os valores foram obtidos em miligrama de pigmento por grama de matéria fresca. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

59 687 Os dados obtidos foram submetidos à ANOVA pelo teste F (p<0,05), utilizando-se o software Sisvar, versão 5.0 (Ferreira, 2004). Os teores de pigmentos foram comparados pelo teste de Scott-Knott, e as variáveis de crescimento foram analisadas por regressão linear. RESULTADOS E DISCUSSÃO A sacarose influenciou o crescimento da Mentha arvensis no cultivo in vitro. De acordo com a Figura 1, pode se observar o aspecto geral da parte aérea e radicular das plantas. Na concentração de 3% de sacarose, as plantas se apresentaram mais desenvolvidas e verdes que as demais e não foi observado qualquer distúrbio fisiológico com a aplicação dos tratamentos. As diferentes concentrações de sacarose promoveram um comportamento quadrático significativo para todas as variaveis de crescimento analisadas (Figura 2). O acúmulo de massa seca da parte aérea, apresentou ponto máximo em 3,76% de sacarose (Figura 2A). Esses resultados corroboram com Riquelme et al. (1991) verificaram que dosagens de 3% à 4,5% foram as mais adequadas durante o pré-acondicionamento in vitro e posterior sobrevivência durante a fase de aclimatização de plantas de morangueiro, batata, menta e videira. As altas concentrações de sacarose podem ter promovido a redução de massa seca devido a geração de um estresse osmótico, o qual proporciona redução no crescimento das plantas in vitro (Jo et al., 2009). Braun et al. (2010) também observaram uma menor produção de massa seca in vitro de Beta vulgaris nas dosagens de 4,5 ou 6% de sacarose. O comprimento da parte aérea teve seu ponto máximo no nível de 2,29% (Figura 2B) e o número de brotações a 1,46% de sacarose (Figura 2C). Por outro lado, Besson et al. (2010) registraram maior comprimento da parte aérea nas concentrações de 3 a 4,5% de sacarose em Miltonia flavescens. Calvete et al. (2002) obtiveram os melhores resultados no desenvolvimento vegetativo na propagação in vitro do morango da cultivar Vila Nova com doses de 3 a 4,5% de sacarose. Esses resultados podem estar relacionados ao fato de que concentrações de sacarose acima de 4% promovem excessivo potencial osmótico, dificultando a divisão celular e gerando um estresse osmótico (Grattapaglia & Machado 1998). Para a produção de massa seca da raíz o ponto maximo foi em 3,47% (Figura 2D). Experimentos com Diuris longifolia (Orchidaceae) mostraram que o enraizamento de mudas é promovido pelo aumento da concentração de sacarose de 2 à 4% (Collins & Dixon, 1992). Nicoloso et al. (2003) observaram que a presença de sacarose nas doses de 3, 4,5 e 6%, proporcionaram maior massa seca de raiz e de parte aérea de P. glomerata cultivada in vitro. Todavia, o aumento da concentração de açúcares pode proporcionar uma diminuição na absorção de sais minerais e água, o que interfere no crescimento da planta (Besson et al., 2010). O comprimento da raiz apresentou ponto FIGURA 1. Aspecto geral de plantas de Mentha arvensis L. cultivada in vitro em meio MS e diferentes concentrações de sacarose (0%, 1,5%, 3,0%, 4,5%, 6,0%) aos 45 dias de cultivo. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

60 688 FIGURA 2. Produção de massa seca da parte aérea (A); comprimento da parte aérea (B) número de brotações (C); massa seca de raiz (D); número de raiz (E); comprimento de raiz (F) de Mentha arvensis cultivada em meio MS com diferentes concentrações de sacarose. máximo em 3,84% (Figura 2F). A sacarose é importante para o processo de enraizamento in vitro, uma vez que é fonte primária de energia que permite o crescimento da planta (Adelberg et al., 2007). Em muitos casos, observa-se que a ausência da sacarose no meio de cultura promove baixos índices de enraizamento e morte dos explantes (Barrales-Lopez et al., 2015). Contudo, altas concentrações de sacarose podem ser prejudiciais para o enraizamento de algumas espécies (Pasqual & Lopes, 1991). Desta forma, observa-se que as plântulas de Mentha arvensis apresentam maior crescimento quando cultivadas em concentrações de 3% de sacarose. Isto pode estar relacionado a sensibilidade da espécie a altas concentrações de sacarose. As maiores concentrações podem ter promovido um estresse osmótico, dificultando a absorção de agua e dos nutrientes minerais disponibilizados no meio de cultura. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

61 TABELA 1.Produção de pigmentos fotossintéticos (clorofila a, b, total, carotenoides e a/b) de M. arvensis cultivada em meio MS com diferentes concentrações de sacarose. Lavras, Sacarose Clorofilaa Clorofila b Carotenoides (mg.g PF -1 ) Razão a/b Clorofila total 0% 1,10 b 0,59 b 0,55 a 0,56 a 1,69 b 1,5% 1,20 b 0,56 b 0,60 a 0,46 a 1,76 b 3,0% 1,61 a 0,81 a 0,72 a 0,52 a 2,37 a 4,5% 1,25 b 0,59 b 0,66 a 0,48 a 1,83 b 6,0% 1,32 b 0,76 a 0,61 a 0,58 a 2,08 a Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si de acordo com o Teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. 689 A produção dos pigmentos fotossintéticos também foi alterada pelas diferentes concentrações de sacarose (Tabela 1). A maior produção de clorofila a foi observada no tratamento com 3% de sacarose, enquanto a maior produção de clorofila b foi verificada nas plantas cultivadas com 6% de sacarose. Os tratamentos com 3 e 6% de sacarose propiciaram a maior produção de clorofila total, enquanto a razão a/b e carotenoides não variou em função dos níveis de sacarose. Resultados semelhantes foram observados para Catlleya walkeriana que também mostrou maior produção de clorofila quando cultivada em meio de cultura com 3% de sacarose (Dignart et al., 2009). O aumento da clorofila nas plantas cultivadas sob 3% de sacarose pode ter resultado numa maior atividade fotossintética (Taiz & Zeiger, 2006). Isso pode ter refletido no maior crescimento observado nessas condições. Por outro lado, a maior produção de clorofila b pode está relacionada a alterações na síntese de clorofila ou mesmo na degradação do PSII proporcionada pela alta concentração de sacarose. Altas concentrações de sacarose promovem a inibição da atividade fotossintética, o que pode ser associada à produção de espécies reativas de oxigênio que promovem a destruição do aparato fotossintético, iniciando pela alteração na síntese de clorofila a. Além disso, a inibição da atividade fotossintética proporcionada pelas altas concentrações de sacarose pode ser atribuída à inibição de algum mecanismo enzimático envolvido na assimilação de carboidratos, em virtude da alta concentração de carboidrato no meio ou do aparato fotossintético ineficiente, característico do hábito heterotrófico das plântulas micropropagadas (Hazarica et al., 2003). CONCLUSÕES O maior crescimento e acúmulo de clorofila a e total foram observados nas plântulas cultivadas com uma concentração de 3% de sacarose, enquanto a produção de carotenoides não foi influenciada pelas concentrações de sacarose. Sendo assim, recomenda-se a dosagem de 3% de sacarose, para o cultivo in vitro de Mentha arversis. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à CAPES, à FAPEMIG e ao CNPq pelo auxilio financeiro e apoio para o desenvolvimento do trabalho. REFERÊNCIAS ADELBERG J, et al. In vitro sugar and water use in diploid and tetraploid genotypes of daylily (Hemerocallis spp.) in liquid medium as affected by density and plant growth regulators. HortScience, v.42, p , ALVARENGA I.C.A. et al. In vitro culture of Achillea millefolium L.: quality and intensity of light on growth and production of volatiles. Pant Cell Tissue and Organ Culture, v.122, n.2, p , BARRALES-LÓPEZ, A. et al. Improved in vitro rooting and acclimatization of Capsicum chinense Jacq. plantlets. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, v.51, p , BARROS, A. S. et al. Chemical composition and functional properties of essential oils from Mentha species. Industrial Crops and Products, v. 76, p , BESSON, J.C.F. et al. Fontes e concentrações de carboidratos no crescimento vegetativo e no enraizamento in vitro de Miltonia flavescens Lindl. Revista Brasileira de Biociências, v.8, n.1, p.9-13, BOTREL, P.P. et al. Factors affecting in vitro propagation and chromatographic analysis of compounds in Hyptis marrubioides EPL., a threatened medicinal plant. Acta Horticulturae, v p , BRAUN, H. et al. Germinação in vitro de sementes de beterraba tratadas com ácido giberélico em diferentes concentrações de sacarose no meio de cultura. Semina: Ciências Agrárias, v.31, p , CALVETE, E.O. et al. Concentração de sacarose no enraizamento in vitro de morangueiro. Horticultura Brasileira, v.20, n.2, p , CHISHTI, N. et al. Clonal propagation of Mentha arvensis L. through nodal explant. Journal of Biological Scienes, v.8, n.9, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

62 690 COLLINS, M.T.; DIXON, K.W. Micropropagation of an Australian terrestrial orchid, Diuris longifolia R.Br. Australian Journal of Experimental Agriculture v.32, p , COSTA, A. S. et al. Estabelecimento de alecrim-pimenta in vitro. Horticultura Brasileira, v.25, n.1, p , DIGNART, S.L. et al. Luz natural e concentrações de sacarose no cultivo in vitro de Cattleya walkeriana. Ciência e Agrotecnologia, v. 33, n. 3, p , FERREIRA, D.F. Sisvar versão 4.6. Lavras: DEX/UFLA, p. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília; ABCTP/EMBRAPA CNPH, p HAZARIKA, B. N. Acclimatization of tissue-cultured plants. Current Science, Bangalore, v.85, n.12, p , JO, W. J. et al. Acetylated H4K16 by MYST1 protects UROtsa cells from arsenic toxicity and is decreased following chronic arsenic exposure. Toxicology Applied Pharmacology, v.241, n.3, p , KUMAR A. et al. Growth regulation,plastid differentiation and the development of a photosynthetic system in cultured carrot root explants as influenced by exogenous sucrose and various phytohormones. Plant Cell, Tissue and Organ Tissue Culture, v.4, p.11-28, LICHTENTHALER, H.K.; BUSCHMANN, C. Chorophylls and carotenoids: measurement and characterization by UV-VIS spectroscopy. In: WROLSTAD R. E. et al. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Davis: John Wiley & Sons,2001. MARTINS, E.R. et al. Plantas medicinais. Viçosa: UFV - Imprensa Universitária, MARTINS, J.P.R. et al. Impacts of photoautotrophic and photomixotrophic conditions on in vitro propagated Billbergia zebrina (Bromeliaceae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 123, n. 1, p , MOSCIANO, G. Organoleptic characteristics of flavor materials. Perfumer & Flavorist, v.30, n.4, p.52-6, 2005 MURASHIGE T.; SKOOG F. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v.15, p , NICOLOSO, F.T. et al. Efeito de concentrações e fontes de carboidratos no crescimento de plantas de ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen) cultivadas in vitro. Ciência e Agrotecnologia, v.27, n.1, p.84-90, PASQUAL, M.; LOPES, P. A. Influência de diversos fatores sobre o enraizamento do porta-enxerto de pereira (Pyrus calleryana) in vitro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 26, n. 3, p , PHATAK, S. V. et al. Organogenesis and terpenoid synthesis in Mentha arvensis. Fitoterapia, v.73, n.1, p.32-39, REIS, É.S. et al. Influência do meio de cultura na germinação de sementes in vitro e taxa de multiplicação de Melissa officinalis L. Ceres, v.55, n.3, p , RIQUELME, C. et al. Pré-acondicionamento y aclimataccion em condicciones de invernáculo de plântulas micropagadas de frutilla, menta, papa y vid. Phyton, v.52, n.1, p.73-82, ROCHA P. S. G. et al. New light sources for in-vitro potato micropropagation. Bioscience Journal, v.31, n.5, p , SCHMILDT O. et al. Sais e sacarose na germinação in vitro de limoeiro cravo. Nucleus,v.12,n.1, p , SHASANY, A. K. et al. High regenerative nature of Mentha arvensis internodes. Journal of Biosciences, v.23, n.5, p TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. Universitat Jaume I, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

63 Desenvolvimento e caracterização de nanopartículas poliméricas contendo óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo geraniol e seu principal composto geraniol 691 FREITAS, D.Z. 1* ; BERTOLDI., F.C.R. 2 ; ROSA, C.G. 1 ; NORONHA, C. 1 ; MACIEL, M.V. 1 ; BARRETO, P.L. M. 1 1Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Ciência dos Alimentos, Florianópolis/SC, Brasil, 2Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina, Estação Experimental de Itajaí, Itajaí/ SC, Brasil. * dani.pel@hotmail.com RESUMO: O presente estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar nanopartículas contendo óleo essencial da planta alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo gerniol e seu composto majoritário, geraniol na forma pura, encapsulados por zeína com e sem revestimento de quitosana. As partículas foram caracterizadas físico-quimicamente por técnicas de diâmetro médio, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de encapsulação e atividade antioxidante, tendo-se monitorado, através destas análises, a estabilidade das mesmas pelo período de 60 dias. As partículas foram analisadas ainda com relação a sua morfologia e distribuição de tamanho por microscopia eletrônica de transmissão. Análises termogravimétricas foram realizadas a fim de verificar a estabilidade térmica das partículas. Espectroscopia no infravermelho foi utilizada a fim de qualificar as interações ocorridas após a formação das partículas. Foi possível observar que as partículas possuem morfologia esférica, lisa e bem definida, apresentando boa estabilidade no período avaliado. Através das análises termogravimétricas, assim como do espectro no infravermelho, foi possível constatar a encapsulação dos compostos ativos. Palavras-chave: Geraniol. Óleo essencial. Alfavaca africana. Nanopartículas. ABSTRACT: Development and characterization of polymeric nanoparticles containing the essential oil of African basil (Ocimum gratissimum L.) geraniol chemotype and its main component geraniol. This study aimed to develop and characterize nanoparticles containing essential oil of the African basil plant (Ocimum gratissimum L.) chemotypegerniol and its major compound, geraniol, in pure form, encapsulated by zein with and without chitosan coating. In total, it was developed five formulations particles: particles of the essential oil of the African basil (Ocimumgratissimum L.) chemotypegeraniol encapsulated in zein with and without chitosan coating; particules containing geraniol in pure form having as wall material zein with and without chitosan coating. The particles were characterized physico-chemically, by techniques of average diameter, polydispersity index, zeta potential, encapsulation efficiency and antioxidant activity, and their stability was monitored through these analyzes for a 60 day period. The particles were also analyzed with respect to their morphology and size distribution by transmission electron microscopy. Thermogravimetric analyzes were performed to verify the thermal stability of the particles. Infrared spectroscopy was used to describe the interactions that take place after formation of the particles. It could be seen that the particles have a spherical morphology, smooth and well defined. They showed good stability during the studied period. Through the thermogravimetric analysis, as well as the infrared spectrum, it was possible to recognize the encapsulation of active compounds. Keywords: Geraniol. Essential oil. African basil. Nanoparticles. INTRODUÇÃO A eficácia dos componentes presentes em óleos essenciais de origem vegetal (OEV) (como, por exemplo, timol, carvacrol, geraniol, limoneno, etc) para inibir o crescimento de agentes patógenos bacterianos de origem alimentar vem sendo cada vez mais estudada (Davidson et al., 2013). Entretanto, sua utilização em matrizes alimentares pode ser limitada por apresentarem baixa solubilidade na fase aquosa de vários alimentos ou por seus impactos Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/ 0139 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

64 692 sobre as propriedades organolépticas dos alimentos em níveis suficientes para inibir o crescimento microbiano (Burt, 2004; Weiss et al., 2009). O geraniol, composto naturalmente presente em diferentes OEV por seu odor e sabor, é empregado como flavorizante na indústria alimentícia, sendo amplamente utilizado também no tratamento de doenças infecciosas (Solórzano-Santos; Miranda-Novales, 2012). Apresenta ainda propriedades como repelente de insetos, antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatório e anticancerígeno (Chen; Viljoen, 2010). Reconhecido como seguro pela Food and Drug Administration (Lapczynski et al., 2008), no entanto, por apresentar-se naturalmente volátil, sua empregabilidade em alimentos torna-se um desafio. Uma solução funcional para estas limitações é o encapsulamento em materiais de encapsulação de grau alimentício, como os polímeros naturais, por exemplo (Yegin et al., 2016 ). A encapsulação pode ser descrita como um procedimento de empacotamento em partículas e consiste no carregamento desses compostos em matrizes, mantendo sua estabilidade química e podendo promover a liberação no momento e taxa desejada (Nedovic et al., 2011). A encapsulação de compostos bioativos melhora a estabilidade desses compostos e sua biodisponibilidade, por reduzir a reatividade dos compostos com o ambiente (água, luz e oxigênio) e por diminuir a evaporação ou a taxa de transferência para o ambiente exterior, proporcionando proteção dos compostos à oxidação, fotólise ou interação com outros componentes de formulação do meio. São denominados de núcleo ou recheio o(s) composto(s) a ser encapsulados, já o material que forma a partícula, pode ser chamado de encapsulante, cobertura ou parede. De acordo com seu tamanho, as partículas encapsuladas podem ser denominadas em macro, micro ou nanopartículas (Nedovic et al., 2011). As nanopartículas resumidamente são partículas individuais com um diâmetro menor que 1000 nm (Reis et al., 2006). Por possuírem tamanho reduzido é possível melhorar as propriedades de liberação dos compostos bioativos, tais como aumento da solubilidade, tempo prolongado de resistência no trato gastrintestinal, entre outras características (Sozer; KokinI, 2009). O material de parede deve possuir características que associadas ao método de produção de nanopartículas e ao núcleo de interesse que permitam a produção de partículas estáveis físico- -quimicamente. Entre os polímeros naturais utilizados atualmente em nanoencapsulações estão a zeína (prolamina proveniente do milho) e a quitosana (polímero policatiônico). Ambas apresentam características como biodegrabilidade, biodisponibilidade, baixa toxicidade, além de apresentarem a possibilidade de liberação controlada de componentes funcionais, como os óleos essenciais (Luo; Wang, 2014). Levando em consideração tais fatores, este estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar nanopartículas contendo óleo essencial de alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo geraniol e seu composto majoritário, o geraniol, na forma isolada, tendo como material de parede zeína e zeína revestida com quitosana. MATERIAL E MÉTODOS Material A zeína, quitosana, Tween 20 e geraniol foram obtidos da Sigma Aldrich. O óleo essencial da alfavaca africana (Ocinum gratissimimuml.) quimiotipo geraniol foi extraído e doado pelo pesquisador da EPAGRI Estação Experimental Itajaí, Fabiano Cléber Bertoldi. Extração do óleo essencial e determinação dos principais constituintes A extração do óleo essencial foi realizada em aparelho tipo Clevenger através de hidrodestilação durante quatro horas. A determinação dos seus principais componentes foi desempenhada por cromatografia gasosa (marca Shimadzu modelo GCMS - QP2010) acoplada à espectrometria de massas. O óleo essencial foi diluído 200x em hexano e injetado no equipamento, utilizando capilar ZB-5MS, 30m x 0,25mm x filme 0,25um. A temperatura inicial do forno de capilar foi de 60 o C (4 min), com rampa de aquecimento de 6 o C/min até atingir a temperatura de 210 o C, permanecendo por 6 min, sendo o tempo total da corrida cromatográfica de 35 min. A temperatura do injetor foi de 250 o C e o fluxo de gás hélio no capilar de 1,0 ml/min. A quantificação e caracterização foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando o equipamento Shimadzu (modelo LC 20AT, Tóquio Japão). O óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimimum L.) quimiotipo geraniol foi quantificado utilizando padrão externo em relação ao seu conteúdo de geraniol, onde a medição quantitativa do teor de geraniol foi efetuada em λ = 275 nm, com fase móvel de metanol: água (75:25) (v / v) a um fluxo de 1,0 ml/min -1, o volume de injeção foi de 20 µl. Obtenção das partículas O preparo das partículas foi realizado seguindo a técnica de nanoprecipitação: na primeira etapa obteve-se a fase orgânica, seguindo a metodologia aludida por Luo e colaboradores (2011) com modificações. A zeína na concentração de 10 mg/ ml foi previamente dissolvida em solução binária de Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

65 693 solventes etanol/água (75:25 v/v). Posteriormente, nesta solução de zeína, sob agitação magnética (600 rpm), foi adicionado por gotejamento o óleo a ser encapsulado (previamente dissolvido em etanol puro) continuando em agitação por 60 min. Depois, o mesmo procedimento foi executado com a quitosana (previamente dissolvida em ácido acético a 1%) e Tween 20 (1% em etanol) permanecendo em agitação magnética por mais 60 min. A segunda etapa consistiu na mistura da fase orgânica à fase aquosa, seguindo método sugerido por Da Rosa e colaboradores (2015) com alterações. Preparada a fase orgânica, esta foi então dispersa sobre a solução aquosa (que corresponde a 1:3 volume fase orgânica/volume fase aquosa) na presença de surfactante Tween 20 (1,5 % da fase aquosa) sob velocidade de rpm em um homogeneizador Ultra Turrax (Modelo T25, IKA-Works, Inc., Cincinnati) por três minutos. Foram preparadas partículas de zeína contendo geraniol (PGE) e óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L) quimiotipo geraniol (ALGE), sendo estas partículas consideradas como controle. Foram desenvolvidas também partículas de zeína revestidas com quitosana com ambos compostos, geraniol (PGE Q) e óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L) quimiotipo geraniol (ALGE Q). Como branco foram preparadas partículas de zeína revestidas com quitosana sem composto bioativo. As diferentes formulações preparadas e suas concentrações na fase orgânica estão apresentadas na Tabela 1. Após o preparo as partículas foram armazenadas em frascos âmbar e mantidas a 7ºC, para posteriores analises. Tamanho da partícula, potencial zeta e índice de polidispersão O potencial zeta (ζ, mv), índice de polidispersão (IP) e tamanho das partículas (Z-ave, nm) foram realizados empregando espalhamento de luz dinâmico (DLS). Para esta analise foi utilizado um Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) disponível no Departameto de Química da Universidade Federal de Santa Catarina. As amostras foram dispostas em célula de eletroforese e as analises realizadas a 25 C e a um ângulo de 173. Eficiência de encapsulação (EE) A EE foi calculada pela diferença entre a quantidade total de agente ativo retido na matriz polimérica (encapsulado) e o agente ativo livre (não encapsulado), conforme a equação 1 abaixo. EE(%) = 100 ( 100 * agente ativo livre / agente ativo total ) Equação 1 A quantificação do geraniol livre foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando comprimento de onda de 275 nm, onde a quantidade de eugenol foi calculada pela curva de calibração apropriada ( R 2 = 0,9996), conforme descrito no item 2.2. Atividade antioxidante Seguindo a metodologia proposta por Brand-Williams e colaboradores (1998), a atividade antioxidante das partículas foi caracterizada pelo poder destas em inibir o radical DPPH (2,2-difenil-1- -picrilhidrazil). Os resultados foram expressos conforme a equação 2, em porcentagem de inibição (PI) do radical DPPH. PI = ( Abs inicial Abs final / Abs inicial ) * 100 Equação 2 Onde Abs inicial e Abs final correspondem, respectivamente, à absorbância inicial e à absorbância final. TABELA 1. Formulações fase orgânica das partículas de geraniol, óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L) quimiotipo geraniol e partículas em branco desenvolvidas neste estudo. Fase orgânica Amostra Zeína (mg/ml) Composto Composto em relação a zeína (%) PGE 10 Geraniol padrão 20 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , Proporção zeína/ quitosana -- PGE Q 10 Geraniol padrão 20 1:100 ALGE 10 Geraniol alfavaca africana ALGE Q 10 Geraniol alfavaca africana 20 1:100 Branco :100 TW 20 = Tween 20; F.O = Fase orgânica; F.A = Fase aquosa

66 694 Avaliação da estabilidade A estabilidade físico-química foi efetuada nos tempos 1, 30 e 60 dias quanto ao tamanho de partícula, ao índice de polidispersão e ao potencial zeta (conforme descrito no item 2.5), à eficiência de encapsulação (seguindo o item 2.6) e atividade antioxidante (item 2.7). As partículas foram armazenadas a uma temperatura 7ºC ao abrigo de luz (em vidros âmbar de 30 ml). Microscopia eletrônica de transmissão (MET) A morfologia das partículas foi obtida por MET utilizando um microscópio JEOL modelo JEM (Tóquio, Japão) operando a 80 kv. As soluções contendo as nanopartículas foram previamente diluídas em água ultrapura Milli-Q (1:5 respectivamente), cerca de 5 µl de cada amostra foi depositada sobre grids de cobre (200 mesh) revestidas sobreuma fina camada de carbono. Após secagem à temperatura ambiente por 24 h, os grids foram observados no microscópio. Analise estatística A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o software STATISTICA (versão 7.0, 2004 StatSoft Inc. EUA). Os dados foram apresentados como a média ± desvio padrão de cada tratamento, sendo aplicada análise de variância e o teste de Tukey para determinar as diferenças significativas. Os valores de p menores que 0.05 foram considerados significativamente diferentes. RESULTADOS E DISCUSSÃO Quantificação dos principais compostos da alfavaca africana (Ocinum gratissimimum L.) quimiotipo geraniol Na quantificação dos principais compostos do óleo essencial de alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo geraniol, o composto majoritário representou um percentual de 84,19% do total dos compostos, valor semelhante aos encontrados na literatura para plantas que em sua maioria possuem o geraniol como composto majoritário, como a palma rosa (Chen; Viljoen, 2012). Os demais constituintes do óleo essencial foram limoneno (1,68%), alfa copaeno (2,23%), beta cariofileno (3,93%) e beta cubebeno (8,59%). Morfologia A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é amplamente empregada para a obtenção de informações relativas à forma e ao tamanho das nanopartículas, podendo permitir também a diferenciação entre nanocápsulas e nanoesferas FIGURA 1. Micrografias obtidas por MET para as partículas. A e B correspondem às partículas Pge, com magnificação de e vezes, respectivamente; C e D correspondem às partículas Pge Q, com magnificação de e vezes, respectivamente; E e F correspondem às partículas Alge, com magnificação de e vezes, respectivamente; G e H correspondem às partículas Alge Q, com magnificação de e vezes, respectivamente. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

67 695 (Schaffazick et al., 2003). Através das micrografias (Figura 1) observou-se que a morfologia apresenta- -se na forma esférica, com borda bem definida, sem rugosidades. Nas diferentes nanopartículas são observadas algumas regiões que apresentam redes de menor contraste que ligam as nanopartículas, estas redes possivelmente indicam algum excesso de surfactante, condição que pode ser melhorada em novas formulações. Distribuição de tamanho As distribuições das partículas determinadas por MET e DLS demonstraram que em ambas técnicas as partículas se encontram em escala nanométrica (Tabela 2). Comparando as médias obtidas pelas diferentes técnicas pode-se verificar que as médias do diâmetro médio das partículas por MET apresentam tamanhos inferiores para todas as formulações, quando comparadas às obtidas por DLS. O mesmo pode ser verificado no estudo realizado por Bootz e colaboradores (2003) que obtiveram diâmetro médio de 190nm pela técnica de DLS e 167 nm quando analisadas por MEV, em nanopartículas de poli (cianoacrilato de butila). Essa diferença de tamanho é atribuída ao fato de a microscopia eletrônica de transmissão ou varredura fornecem uma imagem da partícula isolada do meio, enquanto a espectroscopia de correlação de fótons possibilita a determinação do raio hidrodinâmico das partículas em suspensão. TABELA 2. Diâmetro médio das partículas no tempo 1 por DLS e MET Amostra Diâmetro Diâmetro médio médio (nm) DLS (nm) MET Pge 188,3± 19,15 112,8 ± 93,6 Pge Q 174,3±3,2 101,7±150,4 Alge 173 ± 14,7 117,31±142 Alge Q 177 ±16 95,07±115,75 Avaliação da estabilidade Diferentes fatores interferem na estabilidade das suspensões coloidais. Por isso, é de importante que se tenha conhecimento de características como tamanho da partícula, potencial zeta, índice de polidispersão, eficiência de encapsulação e outros parâmetros físico- químicos que podem ser utilizados para monitorar a estabilidade das suspensões coloidais poliméricas (Schaffazick et al., 2003). A estabilidade das partículas foi alcançada verificando tamanho das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de encapsulação e a atividade antioxidante pelo período de 60 dias (Tabela 3). As partículas foram armazenadas a uma temperatura de 7ºC em frascos de cor âmbar. Diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão O diâmetro médio das partículas foi monitorado no transcorrer de 60 dias de armazenamento, através da técnica de DLS, onde obteve-se valores entre 173 a 229,9 nm (tabela 3). Partículas sem revestimento de quitosana contendo geraniol (Pge) apresentaram ligeiro aumento de tamanho no decorrer dos 60 dias, no entanto, sem diferença significativa ao fim dos 60 dias (p < 0,05). As partículas contendo geraniol e possuindo revestimento de quitosana (PGE Q) não evidenciaram aumento de tamanho (p < 0,05) no tempo de armazenamento. Comportamento análogo foi observado nas partículas contendo óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo geraniol (Alge e Alge Q) que não demonstraram uma diferença de tamanho (p < 0,05) ao longo do armazenamento. Englobando as diferentes formulações, verificou-se que em cada tempo de armazenamento (1, 30 e 60 dias) não houve diferença significativa (p < 0,05) no diâmetro médio entre as mesmas. Isso confirma que tanto o revestimento com quitosana como a utilização do óleo essencial não altera de forma significativa (p < 0,05) o tamanho das partículas. Yegin e colaboradores (2016) desenvolveram nanopartículas de geraniol, pelo método de nanoprecipitação, usando o copolímero tribloco Pluronic F-127. No estudo apresentado por eles, diferentes quantidades de geraniol foram avaliadas, onde obtiveram diâmetros variando de 25 a 412 nm, tendo formulações com diâmetro médio das partículas entre nm, valores semelhantes ao do presente estudo. Essa variação de tamanho pode ser explicada pelo fato de que no método de nanoprecipitação vários fatores, como a natureza e concentração do polímero na fase orgânica, da polaridade do solvente, da natureza e proporção de fases interna/externa, serem relevantes na determinação do tamanho das nanopartículas (Zilli; Sfar; Fessi, 2005). Para os resultados de IP das nanopartículas (tabela 3) obteve-se em geral valores variando 0,131 a 0,224, o que demonstra uma dispersão estreita. Segundo Calvo e colaboradores (1997), o índice de polidispersão é um parâmetro empregado com a finalidade de conferir a homogeneidade na distribuição do tamanho das partículas, valores de IP inferiores a 0,200 indicam dispersões colidais sem formação de aglomerados ou precipitados, garantindo assim a estabilidade das partículas. Através dos valores obtidos pode-se verificar que as partículas vazias apresentaram valores mais altos de IP, diferindo (p < 0,05) das demais formulações durante os 30 dias de armazenamento, ratificando que a presença tanto do composto puro, geraniol, como o óleo essencial colaboraram para uma melhor polidispersão das partículas. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

68 696 TABELA 3. Estudo da estabilidade das nanopartículas de zeína com e sem revestimento de quitosana carregadas com óleos essenciais, compostos puro e partículas em branco. Z-ave (nm) 1 dia 30 dias 60 dias Pge 188,3± 19,15 b,a 218,6±26,6 a,a 228,8±8,08 a,b,a Pge Q 174,3±3,2 a,a 197,8±3,45 a,a 193,8± 19,23 a,a Alge 173 ± 14,7 b,a 225,9± 18,3 a,a 229,9± 13,15 a,a Alge Q 177 ±16 a,a 198,6± 0,91 a,a 197,0 ± 24,7 a,a Branco 208,93±5,44 a,a 187,23±3,4 a,a 186,35±8,89 a,a IP 1 dia 30 dias 60 dias Pge 0,138± 19,15 a,a,b 0,157±26,6 a,a,b 0,162±8,08 a,a,b Pge Q 0,183±3,2 a,a 0,192±3,45 a,a 0,202± 19,23 a,c Alge 0,131 ± 14,7 a,b 0,150± 18,3 a,b 0,160± 13,15 a,a,b Alge Q 0,184 ±16 a,a 0,197± 0,91 a,a 0,194± 24,7 a,b,c Branco 0,210±0,0014 a,c 0,220±0,012 a,c 0,225±0,01 a,c ζ (mv) 1 dia 30 dias 60 dias Pge +28,2± 19,15 a,a,b +28,5±26,6 a,a,b +23,63±8,08 b,a Pge Q +36,2 ±3,2 a,c +32,3±3,4 a,a,b +36,10± 19,23 a,b Alge +26,43 ± 14,7 a,a +22,6± 18,3 b,a 28,3± 13,15 a,a Alge Q +35,26±16 a,b,c +31,6± 0,9 a,b 36,13± 24,7 a,b,c Branco +36,2 ± 5,4 a,c 36,8± 8,9 a,c +37,2± 8,9 a,c EE (%) 1 dia 30 dias 60 dias Pge 98,61 ± 0,36 a,a 98,11±2,54 a,c 99,34±0,35 a,a Pge Q 97,21 ± 2,03 b,a 95,05±0,4 a,a,b 99,72±0,26 b,a Alge 98,07 ± 1,14 a,a 97,7±0,24 a,a 99,54± 0,7 a,a Alge Q 99,8 ± 0,23 a,a 97,15±0,10 b,a,b 99,81± 0,34 a,a AA (%) 1 dia 30 dias 60 dias Pge 48,6 ± 3,13 b,b,c 10,8 ± 0,58 a,a 10 ± 0,48 a,a Pge Q 50,19 ± 4,20 b,c 12,11 ± 0,97 a,a 11,8 ± 1,22 a,a Alge 31,59 ± 5,93 b,a,b 12,50 ± 0,72 a,a 10,7 ± 0,95 a,a Alge Q 23,13 ± 9,05 b,a 12,98 ± 0,55 a,a 11,55 ± 1,73 a,a Branco 4,02 ± 1,22 c,d 2,51 ± 0,33 c,b 2,30 ± 0,89 c,b a Letras diferentes na mesma linha são estatisticamente diferentes (p <0,05). A Letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (p <0,05). Os resultados são expressos como médias de três determinações ± desvio padrão. Potencial zeta Com relação ao potencial zeta, as partículas apresentaram valores positivos em uma faixa entre +22 e +37 mv. Partículas contendo geraniol na forma pura sem revestimento de quitosana (Pge) apresentaram uma diminuição (p < 0,05) no potencial zeta a partir dos 60 dias de armazenamento. As partículas Pge Q e Alge Q não apresentaram diferença significativa (p<0,05) durante os dias de armazenamento. As partículas contendo revestimento de quitosana apresentaram valores superiores (p < 0,05) as sem revestimento nos tempos 1 dia e 60 dias. Pode-se observar ainda que estas partículas obtiveram valores para o potencial zeta superiores a +30mV, demonstrando maior estabilidade, uma vez que potenciais entre ±25 e ±30 mv certificam uma boa estabilidade coloidal de suspensões nanoparticuladas devido à barreira de alta energia entre as partículas (Mora-Huertas; Fessi; Elaissari, 2010). Com relação aos valores apresentarem cargas positivas, desempenho singular foi encontrado por Luo e colaboradores (2011) que obtiveram valores positivos após revestimento de quitosana em partículas de zeína contendo α-tocoferol. Segundo os mesmos autores esse aumento no potencial zeta após revestimento por quitosana confirmam o revestimento do mesmo. Eficiência de encapsulação Os resultados para eficiência de encapsulação estão expressos na tabela 12, apresentando valores superiores a 95%, o que demonstrando forte afinidade entre o material de parede e o material encapsulado. Se comparados os valores iniciais e finais ao longo do armazenamento, as partículas não demonstraram diferença, quando comparadas Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

69 697 entre si. Quando comparadas as formulações ao longo do armazenamento, pode-se verificar que ocorreram diferenças no tempo de 30 dias de armazenamento entre as partículas com revestimento de quitosana, que demonstraram uma diminuição em sua eficiência. Entretanto, nos tempos 1 e 60 dias as partículas não demonstraram diferenças significativas (p < 0,05). Algumas propriedades físico-químicas dos compostos envolvidos na nanoencapsulação podem afetar de forma direta a eficiência de encapsulação. Características como polaridade e lipofilicidade (composto a ser encapsulado) seriam exemplos de fatores interferentes (Stella et al., 2007; Ameller et al, 2003). Levando em consideração tais aspectos e que os resultados obtidos para a EE no presente estudo não diferiram (p < 0,05) entre as formulações, nos tempos 1 dia e 60 dias, pode-se pressupor que as diferenças estruturais existentes entre as formulações não afetaram de forma significativa (p < 0,05) a EE das partículas. Atividade antioxidante Na Tabela 3 estão dispostos os valores obtidos para a atividade antioxidante das nanopartículas vazias e carregadas do óleo essencial e seu composto majoritário, tendo-se os valores expressos em porcentagem de inibição do radical DPPH. Os valores obtidos para atividade antioxidante nas partículas cheias, no tempo 1 dia foram superiores (p < 0,05) as mesmas partículas nos tempos 30 e 60 dias. Pode-se observar que no tempo inicial, onde as partículas apresentam maior atividade antioxidante, as partículas contendo geraniol na forma isolada possuem maior capacidade em reduzir os radicais livres (p < 0,05). Apesar de serem obtidos valores inferiores na capacidade de inibir o radical DPPH, estes são superiores aos encontrados por Scherer e colaboradores (2009), que verificaram a ausência na capacidade de inibição do radical DPPH em óleo essencial de palma rosa (tendo o geraniol como composto majoritário), mesmo na maior concentração final avaliada (800 g ml -1 ). CONCLUSÃO Com o presente trabalho pode-se concluir que morfologicamente as partículas de zeína com ou sem revestimento de quitosana, carregadas com óleo essencial da alfavaca africana (Ocimum gratissimum L.) quimiotipo geraniol e geraniol na sua forma pura, obtidas pelo método de nanoprecipitação, apresentaram formato esférico e regular. As partículas apresentaram boa eficiência de encapsulação, demonstrando forte interação entre o material de parede e recheio. Apresentaram ainda boa capacidade em reduzir o radical DPPH no tempo inicial. Pode-se apontar também que tanto as partículas contendo óleo essencial da alfavaca africana quimiotipo geraniol, como as partículas contendo revestimento de quitosana, não diferiram de forma significativa das partículas controle (Pge e Alge), demonstrando que o revestimento com quitosana, como a substituição do geraniol pelos óleos essenciais são medidas viáveis. REFERÊNCIAS BOOTZ, A.; VOGEL, V.; SCHUBERT, D.; KREUTER, J. Comparison of scanning electron microscopy, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation for the sizing of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, v.57, p , BURT, S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foodsda review. Int. J. Food Microbiol. v.94, p , CALVO P.; VILA-JATO, J.L.; ALONSO, M.J. Chitosan and chitosan/ethylene oxide-propylene oxide block copolymer nanoparticles as novel carriers for proteins and vaccines. Pharm Res. v. 14, p , DA ROSA, C. G.; MACIEL, M. V. O. B.; CARVALHO, S. M.; MELO, A. P. Z.; JUMMES, B.; SILVA, T.; MARTELL, S. M.; VILLETTI, M. A.; BERTOLDI, F. C.; BARRETO, P. L. M. Characterization and evaluation of physicochemical and antimicrobial properties of zein nanoparticles loaded with phenolics monoterpenes. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. v 481 pg CHEN,W., & VILJOEN, A. Geraniol A review of a commercially important fragrance material. South African Journal of Botany, v. 76, p , DAVIDSON, P.M., CRITZER, F.J., TAYLOR, T.M. Naturally occurring antimicrobials for minimally processed foods. Annu. Rev. Food Sci. Technol. V. 4, pg DA ROSA, C. G.; MACIEL, M. V. O. B.; CARVALHO, S. M.; MELO, A. P. Z.; JUMMES, B.; SILVA, T.; MARTELL, S. M.; VILLETTI, M. A.; BERTOLDI, F. C.; BARRETO, P. L. M. Characterization and evaluation of physicochemical and antimicrobial properties of zein nanoparticles loaded with phenolics monoterpenes. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. v 481 pg GUINEBRETIÈRE, S.; BRIANON, S.; FESSI, H.; TEODORESCU, V.S.; BLANCHIN, M. G. Nanocapsules of biodegradable polymers: preparation and characterization by direct high resolution electron microscopy. Mterials Science and Engineering C, v. 21, p , LAPCZYNSKI, A., BHATIA, S., FOXENBERG, R., LETIZIA, C., & API, A. (2008). Fragrancematerial review on geraniol. Food and Chemical Toxicology, 46(11), S160 S170. LUO, Y.; WANG, Q. Zein-based micro- and nano-particles for drug and nutrient delivery: a review. Journal of Apllied Polymer Science LUO, Y.; ZHANG, B.; WHENT, M.; YU, L.; WANG, Q. Preparation and characterization of zein/ chitosan complex for encapsulation of α-tocopherol, and its Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

70 698 in vitro controlled release study. Colloids Surf B Biointerfaces, v.85:,p , MAGENHEIM, B.; BENITA, S. Nanoparticles characterization: a comprehensive physicochemical approach. STP Pharma Sciences, v. 1, n. 4, p , NEDOVIC, V.; KALUSEVIC, A.; MANOJLOVIV, V. et al. An overview of encapsulation technologies for food applications. Procedia Food Science, v. 1, p , REIS, C.P.; NEUFELD, R.J.; RIBEIRO, A.J; VEIGA, F. Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v. 2, n. 1, p. 8-21, SCHAFFAZICK, S. R.; GUTERRES, S. S.; FREITAS L. L.; POHLMANN, A. R. Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova, Vol. 26, No. 5, , SOLÓRZANO-SANTOS, F., & MIRANDA-NOVALES, M. G. Essential oils from aromatic herbs as antimicrobial agents. Current Opinion in Biotechnology, v. 23, p , SOZER, N.; KOKINI, J. L. Nanotechnology and its applications in the food sector. Trends in Biotechnology, v. 27, n. 2, p , WEISS, J., GAYSINSKY, S., DAVIDSON, M., MCCLEMENTS, J. Nanostructured encapsulation systems: food antimicrobials. Global Issues in Food Science and Technology. p , YEGIN, Y.; PEREZ-LEWIS, K. L.; ZHANG, M.; AKBULUT, M.; TAYLOR, T. M. Development and characterization of geraniol-loaded polymeric nanoparticles with antimicrobial activity against foodborne bacterial pathogens. Journal of Food Engineering. V Pg 64-71, ZILI, Z.; SFAR, S.; FESSI, H. Preparation and characterization of poly- ε-caprolactone nanoparticles containing griseofulvin. International Journal of Pharmaceutics, v. 294, p , ZHONG, Q.; JIN, M. Zein nanoparticles produced by liquid liquid dispersion. Food Hydrocolloids, v. 23, n. 8, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

71 Efeito da época de coleta e concentração de auxina no enraizamento de estacas de Lippia gracilis Schauer 699 SOUZA, A.V.V. 1 *; SANTOS, U.S. 1 ; SOUZA, M.D. 1 ; SOUZA, D.D. 2 ; BASTOS, D.C. 1 1 Embrapa Semiárido, Petrolina, PE, Brasil2 Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE, Brasil* ana.souza@embrapa.br RESUMO: A Lippia gracilis, conhecida popularmente como alecrim da chapada, alecrim de tabuleiro, apresenta potencial relevante para a produção de medicamentos fitoterápicos, além de outros produtos, como biocidas para utilização na agropecuária. Entretanto, poucos são os estudos relacionados à propagação dessa espécie. O desenvolvimento de pesquisas nesse contexto é relevante a fim de obter informações que subsidiem estudos futuros voltados a produção comercial de mudas. Dessa forma, desenvolveu-se este trabalho com o objetivo de avaliar a influência da época de coleta das estacas e diferentes concentrações de AIB no enraizamento de estacas de L. gracilis. O estudo foi realizado no viveiro de mudas da Embrapa Semiárido. Estacas apicais e medianas de Lippia gracilis com 20 cm de comprimento e um par de folhas foram coletadas em duas épocas: seca (junho de 2010) e chuvosa (março de 2011). Após imersão na auxina foram transplantadas para tubetes de polietileno contendo como substrato a vermiculita e mantidas em casa de vegetação durante 40 dias. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 2 x 5 (dois tipos de estacas x cinco concentrações de AIB), totalizando 10 tratamentos, com três repetições e oito estacas/ parcela, para cada época de coleta. A avaliação foi realizada aos 40 dias após a instalação do experimento, em relação ao número de brotações por estaca (NBE), número de folhas por brotações (NFB), número de raízes por estaca (NRE), peso da biomassa fresca (PBF) e peso da biomasa seca (PBS) da estaca e porcentagem de enraizamento (%EN). Os resultados mostraram que é possível a produção de mudas de Lippia gracilis utilizando-se estacas medianas sem a aplicação de AIB, com as estacas coletadas na época chuvosa. Portanto, não há necessidade de se utilizar auxina sintética para a propagação vegetativa dessa espécie. Palavras-chave: Verbenaceae, ácido indol butírico, alecrim do mato, plantas medicinais. ABSTRACT: Effect of collection time and auxin concentration on rooting of Lippia gracilis Schauer cuttings. Lippia gracilis, popularly known as the plateau rosemary, rosemary board, has potential relevance for the production of herbal medicines, and other products such as biocides for use in agriculture. However, there are few studies related to the spread of this species. The development of research in this context is relevant in order to obtain information that will help future studies aimed at the commercial production of seedlings. Thus, it developed this work was to evaluate the influence of time for collecting the cuttings and different concentrations of IBA on rooting of L. gracilis cuttings. The study was conducted in the seedling nursery at Embrapa Semi-Arid. Apical cuttings and medians of Lippia gracilis with 20 cm long and 1 pair of leaves were collected in two seasons: dry (June 2010) and rainy (March 2011). After immersion in auxin were transplanted into polyethylene tubes containing vermiculite as substrate and maintained in a greenhouse for 40 days. The experimental design was completely randomized (DIC) in a factorial 2 x 5 (two types of cuttings x five concentrations of IBA), totaling 10 treatments with three replicates and eight stakes / share for each collection time. The evaluation was performed 40 days after the beginning of the experiment, balanced by the number of shoots per cutting (NBE), number of leaves per shoot (NFB), number of roots per cutting (NRE), weight of the fresh weight (PBF) and weight of the dry biomass (PBS) cutting and rooting percentage (% DE). Our results showed that it is possible to produce Lippia gracilis seedlings using medians stakes without the application of AIB, with the cuttings collected during the rainy season. So there is no need to use synthetic auxin for vegetative propagation of the species. Keywords: Verbenaceae, indole butyric acid, alecrim do mato, medicinal plants. Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0142 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

72 700 INTRODUÇÃO A Lippia gracilis (Verbenaceae), conhecida popularmente como alecrim da chapada, alecrim de tabuleiro, alecrim do mato e alecrim de vaqueiro, é um pequeno arbusto caducifólio, ramificado, com caule quebradiço de até 2 m de altura. Apresenta folhas aromáticas e picantes e as flores são pequenas, esbranquiçadas, reunidas em espigas de eixo curto. Os frutos são do tipo aquênio extremamente pequenos, cujas sementes raramente germinam (Lorenzi & Matos, 2002). Considerada própria da vegetação do Semiárido nordestino, a L. gracilis apresenta potencial relevante para a produção de medicamentos fitoterápicos, além de outros produtos, com ação biopesticida para utilização na agropecuária. Estudos já realizados comprovaram cientificamente a atividade antifúngica e antibacteriana do alecrim do mato frente a diversos microrganismos (Lemos et al., 1990; Pascual et al., 2001; Albuquerque et al., 2006; Oliveira et al., 2008b; Mendes et al., 2010). O óleo essencial dessa espécie é composto por teores elevados de timol e carvacrol, os quais apresentam importantes atividades antimicrobianas. Esses dois terpenos fenólicos, têm ação comprovada para Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, Streptococcus Salivarius, Candica albicans, Tricophytum rubrum, Microsporum canis, Aspergillus niger, Penicillum sp. dentre outros (Kounle et al., 2003; Agnaniet et al., 2005; Oliveira et al., 2008b). Outras pesquisas reportaram atividade do óleo essencial da L. gracilis no controle da larva do mosquito da dengue (Aedes aegypti) (Bispo & Santos, 2008; Silva et al., 2008). Contudo, mesmo que essa espécie apresente potencial relevante para uso e exploração comercial, não existem relatos de pesquisas relacionadas à propagação, a partir de estacas coletadas em populações naturais nas condições semiáridas do sertão de Pernambuco. De acordo com Oliveira et al. (2011), a necessidade da obtenção de informações sobre a propagação da L. gracilis, aliada ao seu potencial para o aproveitamento econômico, contraposto por sua dificuldade de propagação via seminal, apontam a estaquia como possível alternativa viável para a produção de mudas desta espécie. Porém, todo o processo se dá via assexuada por meio de ramos mais finos (Lorenzi & Matos, 2002). A propagação assexuada via estaquia, tem sido o método mais utilizado para a produção de mudas de espécies lenhosas de interesse comercial. No entanto, considerando os inúmeros fatores que influenciam o processo, Ono e Rodrigues (1996), relataram que para acelerar e promover o enraizamento de estacas, habitualmente são empregados reguladores vegetais do grupo das auxinas. Essas substâncias podem proporcionar maior porcentagem de formação das raízes, melhor qualidade das mesmas e uniformidades no enraizamento. O ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftalenacético (ANA) e o ácido indolacético (AIA), são os reguladores vegetais da classe das auxinas mais utilizados no tratamento de estacas, quando o objetivo é a precocidade e o maior número de emissão de raízes. Todavia, o AIB pode ser considerado a auxina sintética mais eficiente devido a sua atoxicidade, estabilidade à ação da luz, maior aderência à estaca e maior resistência ao ataque por ação biológica (Hartmann et al., 2002). Considerando a importância da espécie em estudo, como fonte potencial de matéria prima para fabricação de medicamentos fitoterápicos e produtos com ação biopesticida, objetivou-se com este trabalho avaliar a influência da época de coleta e concentração de auxina no enraizamento de estacas de L. gracilis. MATERIAL E MÉTODOS Os trabalhos foram realizados nas dependências do Laboratório de Biotecnologia e viveiro de mudas da Embrapa Semiárido. Para a realização do experimento, foram utilizadas estacas apicais e medianas, coletadas, aleatoriamente, em plantas de uma população natural, localizada na comunidade Caiçara, município de Petrolina-PE (376 m de altitude e coordenadas geográficas de de latitude sul e de longitude oeste). As estacas foram coletadas no período da manhã do mês de junho de 2010 (época seca) e março de 2011(época chuvosa) e separadas em partes apicais e medianas, com aproximadamente 20 cm de comprimento e um par de meia folhas. Após o preparo, as estacas foram imersas em solução de AIB nas concentrações de 200, 500, 700 e 1000 mg L -1, por um período de 24 h. A ausência de auxina (0 mg L -1 ), foi tomada como tratamento controle. Após este período, as estacas foram transferidas para tubetes de polietileno rígido com capacidade volumétrica de 50 ml, que possui forma cônica, seis estrias internas, 2,7 cm de diâmetro interno superior, 1,0 cm de diâmetro interno inferior e altura de 12,2 cm, contendo vermiculita como substrato. Os tubetes foram mantidos em viveiro de mudas e, as estacas foram irrigadas diariamente, por um período de 40 dias. A irrigação foi realizada via microaspersão pelo tempo de um minuto a cada hora. O experimento foi instalado em delineamento Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

73 701 experimental inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 2 x 5 (dois tipos de estacas x cinco concentrações de AIB), totalizando 10 tratamentos, com três repetições e oito estacas/parcela, para cada época de coleta. A avaliação foi realizada aos 40 dias após a instalação do experimento, em relação ao número de brotações por estaca (NBE), número de folhas por brotações (NFB), número de raízes por estaca (NRE), peso da biomassa fresca (PBF) e peso da biomasa seca (PBS) da estaca e porcentagem de enraizamento (%EN). O peso do material fresco, foi obtido em balança analítica e, posteriormente, foi colocado em estufa com circulação de ar forçado (40ºC) até obtenção do peso constante, para avaliação do peso médio da biomassa seca. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística utilizando-se o software SISVAR, pelo teste de média de Scott-Knott (α5%) para tipo de estaca e análise de regressão para concentração de AIB (α5%). Os dados de todas as variáveis analisadas foram transformados pela equação raiz quadrada de Y SQRT (Y + 1.0), exceto para a variável porcentagem de enraizamento (% EN), para estacas coletadas na época chuvosa. Para as estacas coletadas na época seca, somente os dados do número de raízes por estaca (NRE) e da porcentagem de enraizamento (%EN) foram transformados pela mesma equação. RESULTADOS E DISCUSSÃO Não houve diferença estatística significativa entre as estacas apicais e medianas, para o número de brotações por estaca (época seca e chuvosa), o número de folhas por brotação (época seca), o número de raízes por estaca (época seca e chuvosa) e a porcentagem de enraizamento (época seca e chuvosa). Entretanto, verificou-se uma tendência de superioridade das estacas medianas em relação às apicais, pois os valores médios avaliados foram maiores do que os observados nas estacas apicais. Contudo, esse resultado foi diferente para o número de folhas por brotação para estacas apicais (1,67) e estacas medianas (3,15) coletadas na época chuvosa e peso da biomassa fresca e biomassa seca para estacas coletadas nas duas épocas avaliadas. Para essas duas variáveis os valores médios foram 0,75 e 1,00 e 0,43 e 0,77 para estacas apicais e medianas coletadas na época seca e época chuvosa, respectivamente. Quando se avaliou as diferentes concentrações e a interação concentração x tipo estaca, observou-se que houve diferença significativa entre as variáveis e os resultados são apresentados nas Figuras 1, 2 e 3. Houve interação significativa entre as concentrações de AIB e os tipos de estacas, para o número de brotações por estaca (época seca), número de folhas por brotações (época seca e chuvosa), peso da biomassa fresca e da biomassa seca (época seca), além da porcentagem de enraizamento (época chuvosa). Para todas as variáveis estudadas, o comportamento foi semelhante e ocorreu a diminuição dos valores médios à medida que se aumentou a concentração de AIB (Figuras 1, 2 e 3). Para o número de brotações por estaca (Figura 1A) verificou-se que a estaca mediana apresentou maiores valores (6,5) quando comparada à estaca apical (4,17) e esse foi obtido ausência de AIB. Houve um decréscimo com o aumento das concentrações de AIB na época seca, até a concentração de 1,100 mg L -1. Na época chuvosa (Figura 1B), não teve diferença estatística entre as estacas, mas somente entre as concentrações e, os maiores valores médios também foram observados quando não se aplicou o AIB (5,8). Na concentração de 983,33 mg L -1 de AIB o número de brotos por estaca foi 0,02. Esses resultados corroboram com aqueles encontrados por Silva et al. (2012), quando estudaram a propagação da L. gracilis e concluíram que essa espécie pode ser propagada sem a adição de reguladores vegetais, no caso, auxinas. O número de folhas por brotação das estacas apicais coletadas na época seca diminuiu diretamente com o aumento da concentração de AIB. Na ausência desse regulador, foi possível registrar 3,8 folhas e esse valor diminuiu para 1,1 na presença de 1000 mg L -1 de AIB. Para as estacas medianas coletadas na mesma época, obteve-se 4,3 folhas por broto na ausência da auxina e observouse um declínio até a concentração de 503,33 de mg L -1 de AIB, quando foi registrado o valor médio de 0,51 (Figura 1C). A partir dessa concentração ocorreu novo aumento no número de folhas por brotações e registrou-se 4,8 na presença de mg L -1 de AIB. Embora tenha ocorrido esse comportamento, os valores registrados para essa variável foram bem próximos, o que demonstra o potencial da espécie em emitir brotos com folhas mesmo sem a imersão em auxina sintética. Na época chuvosa (Figura 1D), a estaca mediana apresentou um aumento no número de folhas por estaca (4,69) até a concentração de 233,33 mg L -1 de AIB. A partir dessa concentração, registrou-se a diminuição do número de folhas por brotação. Para as estacas apicais coletadas na mesma época, o maior número de folhas obtido foi no tratamento controle, ou seja, ausência da auxina (4,30). À medida que se aumentou a concentração desse regulador, houve uma redução no número de folhas até a concentração de 1,000 mg L -1. Esses resultados são relevantes porque Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

74 702 A B B C FIGURA 1. A. Número de brotos por estaca apical (NBEA) e número de brotos por estaca mediana (NBEM) na época seca; B. Número de brotos por estaca (NBE) na época chuvosa; C. Número de folhas por broto na estaca apical (NFBA) e número de folhas por broto na estaca mediana (NFBM) na época seca; D. Número de folhas por broto na estaca apical (NFBA) e número de folhas por broto na estaca mediana (NFBM) na época chuvosa, em Lippia gracilis imersas. em diferentes concentrações de ácido indol butírico. Embrapa Semiárido, Petrolina-PE, demonstraram que mesmo na época seca, o nível de auxina endógena da espécie não foi afetado negativamente, o que pode ter possibilitado a emissão de brotos com folhas tanto nas estacas apicais e medianas, sem a necessidade da imersão em auxina sintética. A presença de brotações axilares ou folhas em estacas submetidas a tratamentos de propagação assexuada é importante porque servem como fonte de auxina endógena e de nutrientes necessários para a formação de raízes. Oliveira et al. (2008a) constataram que a presença de um par de folhas expandidas foi essencial para a formação de raízes em estacas apicais de Lippia sidoides. A presença de dois pares de folhas diminuiu o índice de mortalidade das estacas quando comparado às estacas sem folhas. De acordo com Gaspar & Hofinger (1988), o alto nível de auxinas endógenas pode ser necessário para a iniciação de raízes adventícias primordiais, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

75 703 considerando que existe uma relação intrínseca entre os níveis de auxina endógena e a habilidade para iniciar raízes. Na fase de indução e iniciação da emissão das raízes adventícias, o processo é regulado pela relação quantitativa entre os níveis de auxina e citocinina, como também pela participação de outras substâncias. O AIA endógeno age como um ativador de gene alavancando a formação precoce do primórdio radicular favorecendo a conjugação entre o AIA endógeno e aminoácidos que promovem a síntese de proteínas específicas necessárias para A a formação de raízes iniciais (Gaspar & Hofinger, 1988; Ono & Rodrigues, 1996). Não houve diferença estatística significativa entre as concentrações para o peso da biomassa fresca da estaca apical coletada na época seca e os maiores valores foram observados para a estaca mediana na ausência da auxina (1,8g). Esse valor diminuiu até o peso de 0,28g à medida que se aumentou a concentração de AIB até 464,3 mg L -1 (Figura 2A). A partir dessa concentração, houve um aumento no valor médio para essa variável e, foi B B C FIGURA 2. A. Peso da biomassa fresca da estaca mediana (PBFM) na época seca; B. Peso da biomassa fresca (PBF) na época chuvosa; C. Peso da biomassa seca da estaca mediana (PBSM) na época seca; D. Peso da biomassa seca (PBS) na época chuvosa, em Lippia gracilis imersas em diferentes concentrações de ácido indol butírico. Embrapa Semiárido, Petrolina-PE, Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

76 704 possível registrar 2,3g, sem diferença estatística para o valor médio obtido na ausência da auxina. Na época chuvosa, houve diferença somente entre as concentrações testadas (Figura 2B), como comentado anteriormente e os melhores resultados (0,99g) foram observados na concentração de 200 mg L -1 de AIB. À medida que as concentrações aumentaram, houve um decréscimo nos valores do peso da biomassa fresca. Para o peso da biomassa seca (Figura 2C), na época seca, também não houve diferença estatística significativa entre as concentrações para as estacas apicais e verificou-se que na concentração de 517 mg L -1 de AIB, obtevese o menor valor para essa variável (0,061g) nas estacas medianas. Na ausência da auxina, o peso da biomassa seca foi de 0,86 g. Na época chuvosa (Figura 2D), os resultados foram semelhantes aos observados para o peso da biomassa fresca e ocorreu um descréscimo direto dos valores à medida que se aumentou a concentração do AIB até 1000 mg L -1. O maior peso para a biomassa seca (0,47g) também foi obtido na ausência do regulador. Esses resultados corroboram aqueles apresentados anteriormente para as outras variáveis estudadas, haja vista que foram obtidos os maiores valores médios para número de brotos por estaca e número de folhas por broto no tratamento controle (sem imersão em auxina). Para o número de raízes por estaca, o comportamento foi semelhante, ou seja, os valores médios obtidos também foram maiores na ausência da auxina e diminuíram à medida que se aumentou a concentração do AIB. Houve diferença estatística somente entre as concentrações testadas. (Figuras 3A e 3B) Na época seca (Figura 3A), os melhores resultados foram observados quando não se utilizou o tratamento com AIB (7,1). À medida que se aumentou a concentração, houve um decréscimo no número de raízes por estaca (0,54) até a concentração de 810 mg L -1. Na época chuvosa (Figura 3B), os melhores resultados (15,74) foram observados na concentração de 292,2 mg L -1 de AIB. Esse resultado confirma o que foi discutido anteriormente para a variável número de folhas por brotação, no que se refere à presença de folhas estar diretamente relacionada a fonte de auxina endógena e emissão de raízes adventícias. Esses resultados foram diferentes daqueles observados por Pimenta et al. (2007) quando estudaram a propagação vegetativa de algumas espécies de Lippia spp, endêmicas da Cadeia do Espinhaço, MG, coletadas em diferentes épocas. A propagação via estaquia mostrou-se pouco eficiente, devido à baixa porcentagem de enraizamento e formação de raízes, mesmo com a aplicação de reguladores vegetais. Para a porcentagem de enraizamento (Figuras 3C e 3D), os resultados foram semelhantes aos observados para o número de raízes por estaca, em relação à diminuição dos valores obtidos com o aumento da concentração do AIB. Para a época seca, houve diferença estatística somente entre as concentrações testadas. Na ausência da auxina, 47,21% das estacas enraizaram e esse valor diminuiu (0,52) à medida que se aumentou a concentração de AIB até 883,40 mg L -1. Na época chuvosa, ocorreu diferença estatística significativa na interação estaca x concentração, com superioridade para as estacas medianas (Figura 3D). Observou-se também que 72% das estacas apicais enraizaram na ausência da auxina e para as estacas medianas, a porcentagem foi de 90%. Resultados semelhantes foram observados por Figueiredo et al. (2009), no enraizamento de estacas de L. sidoides, quando constataram não haver necessidade do uso do AIB para aumentar a porcentagem de enraizamento, sendo que tal regulador vegetal apenas melhorou a qualidade das estacas enraizadas (número e comprimento das raízes). A estaquia é a técnica de propagação mais utilizada na produção de mudas, por ser de fácil execução e mais rápida, além de produzir plantas idênticas as de origem. É utilizada de modo significativo para espécies que apresentam maior facilidade para a formação de raízes adventícias. Pode ser influenciada por vários fatores como: tipos de estacas, aplicação de reguladores vegetais, época de coleta das estacas, tipo de substrato, balanço hormonal entre inibidores, promotores e cofatores de enraizamento, nutrição mineral, dentre outros (Ono & Rodriques, 1996; Hartmann et al., 2002; Wendling, 2004). Entre os diversos aspectos relacionados à propagação vegetativa, a época de coleta dos ramos foi citada por Ono & Rodrigues (1996) entre os principais fatores que influenciam no processo, o que pode estar relacionado às fases de crescimento da planta, bem como ao estado bioquímico das estacas. Hartmann et al. (2002) e Gaspar & Hofinger (1988), ainda comentam que a época de coleta das estacas também pode estar relacionada com maior ou menor presença de lignina. Estacas coletadas no período de crescimento vegetativo intenso, como nesse estudo na época chuvosa (verão) são menos lignificadas e podem apresentar maior capacidade de enraizamento, enquanto estacas coletadas no inverno possuem maior grau de lignificação e tendem a enraizar menos. Os resultados apresentados nesse trabalho são bem interessantes porque mostraram que mesmo na época seca (inverno), foi possível obter, aproximadamente, 50% de estacas enraizadas Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

77 705 A B B C FIGURA 3. A. Número de raiz por estaca (NRE) na época seca; B. Número de raiz por estaca (NRE) na época chuvosa; C. Porcentagem de enraizamento (%ENRZ) na época seca; D. Porcentagem de enraizamento de estacas apicais (%ENRAP) e estacas medianas (% ENRME) na época chuvosa, em Lippia gracilis imersas em diferentes concentrações de ácido indol butírico. Embrapa Semiárido, Petrolina-PE, sem a necessidade da imersão em auxina sintética. Como comentado anteriormente, o teor de auxina endógena presente nas estacas de L. gracilis foi suficiente para induzir o enraizamento sem a necessidade do uso de reguladores vegetais. De acordo com Hartmann et al. (2002) e Goulart et al. (2008), esse fato pode ser comum para algumas espécies e a aplicação do regulador vegetal pode causar toxidez nas estacas; o que pode ter ocorrido para a espécie em estudo. A toxidez está diretamente relacionada à concentração x tempo de imersão. Ono & Rodrigues (1996) relataram que períodos de 24 h são considerados prolongados e, nesse caso, devese utilizar a concentração máxima de 500 mg L -1. Para concentrações maiores, o tempo de imersão das estacas deve ser por períodos de segundos ou minutos. Porém, deve-se considerar o tipo de estaca se lenhosas ou semilenhosas. Os resultados apresentados nesse trabalho estão de acordo com os dados da literatura, pois foram utilizadas concentrações elevadas (1.000 mg L-1) e imersão em tempo considerado prolongado (24h), além de se considerar o balanço hormonal favorável para os promotores e cofatores de enraizamento, como discutido anteriormente. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

78 706 As estacas coletadas na época chuvosa (verão) apresentaram 90% de enraizamento e maior formação de raízes em relação às estacas coletadas na época seca (inverno). Nessa época do ano (época seca ou inverno) a redução na capacidade de enraizamento das estacas sugere a necessidade da aplicação de outros reguladores vegetais sintéticos, além de estudos para a identificação de uma época mais adequada para a coleta (Hartmann et al. 2002; Sarma, 2003). Resultados semelhantes foram observados por Silva et al. (2015), em estudos com L. origanoides, em que verificaram maior porcentagem de enraizamento na ausência do regulador e Oliveira et al. (2011), obtiveram 100% de enraizamento em estacas de L. gracilis sem o tratamento com auxina, independente do tipo de substrato utilizado. Silva et al. (2012), também verificaram que a L. gracilis pode ser propagada com sucesso utilizando-se estacas apicais ou medianas, sem a adição de reguladores vegetais. Contudo, Herrera-Moreno et al. (2013) constataram a emissão de maior número de raízes em estacas de L. origanoides e L. alba quando essas permaneceram durante 5 min na presença de mg L -1 de AIB. Esses resultados corroboram com aqueles apresentados nesse trabalho e permitem inferir que a espécie em estudo, realmente, deve apresentar níveis satisfatórios de auxina endógena para a emissão de raízes adventícias, independente da época de coleta. Esse pode ser um dos fatores fundamentais quando o objetivo é a produção comercial de mudas, haja vista a necessidade de se considerar os custos de produção durante o processo. Em relação aos resultados obtidos para estacas apicais e medianas da L. gracilis, Duarte et al. (2002) concluíram que as estacas medianas de L. alba também apresentaram maior capacidade de brotação e tendência de melhor enraizamento quando comparadas à estacas apicais. Esse fato pode estar relacionado a alguns fatores que possivelmente influenciaram no comportamento das estacas, uma vez que estacas apicais enraízam mais facilmente do que as estacas medianas, pelo fato de serem menos lignificadas. Entretanto, as estacas apicais necessitam de um sistema de nebulização intermitente para se manterem vivas, pois são bem sensíveis à desidratação (Hartmann et al., 2002; Biasi & Costa, 2003). Neste estudo, o sistema de irrigação utilizado foi via microaspersão pelo tempo de um minuto a cada hora, o que deve ter afetado a emissão das raízes adventícias nas estacas apicais, sendo, portanto, as estacas medianas as que se comportaram melhor no sistema de irrigação utilizado. Biasi & Costa (2003) também observaram a maior resistência à desidratação das estacas medianas de erva cidreira (L. alba), sem a irrigação por nebulização intermitente. CONCLUSÃO A produção de mudas de Lippia gracilis sem a aplicação de AIB é economicamente viável quando se utiliza estacas medianas coletadas na época chuvosa. Todavia, esses resultados são relacionados ao tempo de 24 h de imersão. Outros estudos devem ser realizados com a imersão das estacas em concentrações maiores e menor tempo de exposição. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FACEPE (Fundação de amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco), pela concessão do Auxílio à Pesquisa. REFERÊNCIAS AGNANIET, H.; MAKANI, T.; AKAGAH, A.; MENUT, C.; BESSIÈRE, J.M. Volatile constituents and antioxidant activity of essential oils from Lippia multiflora Mold. growing in Gabon. Flavour Fragr. J., v. 20, p , ALBUQUERQUE, C.C.; CAMARA, T.R. MARIANO, R.L.R. Et al. Antimicrobial Action of the Essential Oil of Lippia gracilis Schauer. Brazilian Archives of Biology and Technology v.49, n.4, p , BIASI, L. A.; COSTA, G. Propagação vegetativa de Lippia alba. Ciência Rural, v. 33, n. 3, p , BISPO, C.P.V.; SANTOS, R.L.C. Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do bairro Porto Dantas - Aracaju Sergipe. Revista da Fapese, v.4, n. 2, p , DUARTE, E. F.; OLIVEIRA JÚNIOR, E. D.; BIGARELLI, L. F. G.; ALMEIDA, C. S.; SILVA, L. C.; ASSIS, S. R. F. Enraizamento de estacas de produção de biomassa de Lippia alba (Mill) N. E. Brow (Verbenaceae). Revista Científica Eletrônica de Agronomia, v. 1, n. 2, 2. sem FIGUEIREDO, L.S.; BONFIM, F.P.G.; FERRAZ, E.O.; CASTRO, C.E.; SOUZA, M. F.; MARTINS, E. R. Influência do ácido indolbutírico no enraizamento de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) em leito com umidade controlada. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 11, n. 1, p , GASPAR, T.; HOFINGER, M. Auxin metabolism during adventitious rooting. In: DAVIS, T.D.; HAISSIG, B.E.; SANKHLA, N. (Eds.). Adventitious root formation in cuttings. Portland: Dioscorides Press, v.2, p GOULART, P. B.; XAVIER, A.; CARDOSO, N. Z. Efeito dos reguladores de crescimento AIB e ANA no enraizamento de miniestacas de clones de Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla. Revista Árvore, v. 32, n. 6, p , nov./dez Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

79 707 HARTMANN, H.T. et al. Plant propagation: principles and practices. 7.ed. New Jersey: Prentice Hall, p. HERRERA-MORENO,A.M.; CARRANZA, C.E.; CHACÓN- SÁNCHEZ, M.I. Establishment of propagation methods for growing promising aromatic plant species of the Lippia (Verbenaceae) and Tagetes (Asteraceae) genera in Colombia. Agronomía Colombiana v.31, p.27-37, KOUNLE, O.; OKOGUN, J.; EGAMANA, E.; EMOJEVWE, E.; SHOK, M. Antimicrobial activity of various extracts and carvacrol fro Lippia multiflora leaf extract. Phytomedicine, v.10, p , LEMOS, T.L.G.; MATOS, F.J.A.; ALENCAR, J.W. Antimicrobial activity of essential oils of Brazilian plants. Phytotherapy Research, v.4, 1990, p LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais do Brasil: Nativas e Exóticas. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2002, 512 p. MENDES, S.S.; BOMFIM, R.R.; JESUS, H.C.R.; et al. Evaluation of the analgesic and anti-inflammatory effects of the essential oil of Lippia gracilis leaves. Journal of Ethnopharmacology. v.129, p , OLIVEIRA, A.C.L; ARRIGONI-BLANK, M.F; BLANK, A.F.; BIANCHINI, F.G. Produção de mudas de dois genótipos de alecrim-de-tabuleiro (Lippia gracilis Schauer) em função de fertilizante mineral, calcário, substratos e recipientes. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.13, n. 1, p , OLIVEIRA, G.L.; FIGUEIREDO, L.S.; MARTINS, E.R.; COSTA, C.A. Enraizamento de estacas de Lippia sidoides utilizando diferentes tipos de estacas, substratos e concentrações do ácido indolbutírico. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.10, n.4, p.12-17, 2008a. OLIVEIRA, O.R.; TERAO, D.; CARVALHO, A.C.P.P. Efeito de óleos essenciais de plantas do gênero Lippia sobre fungos contaminantes encontrados na micropropagação de plantas. Revista Ciência Agronômica, v.39, n.01, p , 2008b. ONO, E.O.; RODRIGUES, J.D. Aspectos da fisiologia do enraizamento de estacas caulinares. Jaboticabal: FUNEP, p. PASCUAL. M.E.; SLOWING, K.; CARRETERO, E. et al. Lippia: traditional uses, chemistry and pharmacology: a review. Journal of Ethnopharmacology. v.76, p , 2001.PIMENTA, M.R.; FERNANDES, L.S.; PEREIRA, U.J.; GARCIA, L.S.; LEAL, S.R.; LEITÃO, S.G.; SALIMENA, F.R.G.; VICCINI, L.F.; PEIXOTO, P.H.P. Flowering, germination and rooting of cuttings of Lippia L. (Verbenaceae). Revista Brasileira de Botânica, v.30, n.2, p , SARMA, T.C. Effect of growth regulators on vegetative propagation of Amoora wallichii, Callicarpa arborea and Ficus fistulosa. Indian Journal of Plant Physiology, v. 7, p , SILVA, G.C.; OLIVEIRA, L.M.; LUCCHESE, A.M.; SILVA, T.R.S.; NASCIMENTO, M.N. Propagação vegetativa e crescimento inicial de Lippia origanoides (alecrim-detabuleiro). Horticultura Brasileira, v.33, n.2, p , SILVA, N.G.B.; SOUZA, A.V.V.; SOUZA, D.D.; OLIVEIRA, F.J.V Tipo de estaca e concentração de ácido indol butírico no enraizamento de alecrim da chapada. Horticultura Brasileira, v.30, n.2, p , SILVA, W.J.; DÓRIA, G.A.A.; MAIA, R.T. et al. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: Alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresource Technology, v.99, p , WENDLING, I. Propagação vegetativa de erva-mate (Ilex paraguariensis Saint Hilaire): estado da arte e tendências futuras. (Série Documentos, 91). Colombo - PR: Embrapa Florestas, p. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

80 708 Enraizamento de estacas de estolões aéreos de Mentha piperita L. de diferentes tamanhos em diferentes substratos MARTINEZ, C.A.G. 1 ; MATTOS, J.K.A. 1 * 1Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília. Brasília DF, Brasil; *Autor para correspondência: jkamattos@gmail.com RESUMO: Mentha piperita é uma das mentas mais importantes no universo das plantas medicinais e aromáticas. A planta é propagada preferencialmente via estacas da parte aérea e de estolões aéreos e subterrâneos. As estacas enraízam facilmente permitindo que se especule sobre modos de aumentar a eficiência da produção de mudas variando tipos e tamanhos de estacas e os substratos de enraizamento. Foram realizados dois ensaios que estudaram a possibilidade de otimização do método, reduzindo o tamanho do propágulo e ampliando as opções para meios de enraizamento. No ensaio número 1 foram testados em casa de vegetação, quatro tipos de estacas de estolão aéreo de M. piperita quanto ao número de nós (0,5; 1; 2 e 3). O enraizamento das estacas foi feito com dois meios de enraizamento: água em placas de Petri e substrato artesanal confeccionado na própria estação experimental, em vasos. Os melhores resultados foram obtidos com estacas de três nós, enraizadas previamente em substrato artesanal, embora mudas de todos os tratamentos tenham-se apresentado como viáveis. O ensaio número 2 testou cinco meios de enraizamento em estacas de três nós: substrato artesanal; substrato comercial; areia adubada; areia comum e câmara úmida. As massas secas das mudas enraizadas no substrato artesanal e na areia adubada não diferiram estatisticamente entre si, tendo sido superiores às dos demais tratamentos. Palavras-chave: menta, propagação vegetativa, estaquia, estolões, substratos ABSTRACT: Rooting of cuttings of aerial stolons of Mentha piperita L. of different sizes in different substrates. Mentha piperita is one of the most important mints in the universe of the medicinal and aromatic plants. This plant species is propagated preferential by cuts of the aerial part and underground stolons. The cuts take root easily allowing people to speculate on ways to increase the efficiency of the method asking for types and sizes of cuts and rooting media. Two assays had been carried out in order to study the possibility of improving the method, having reduced the size of the cut and extending the options for rooting media. In the first assay they had been tested in vegetation house, four types of cuts of aerial stolons of M. piperita varying the number of nodes (0.5; 1; 2 and 3). The rooting of the cuts was made with two media of rooting: water in plates of Petri and the homemade substratum confectioned in the proper experimental station, in vases. The best results had been gotten with cuts of three nodes, previously taken root in the homemade substratum, even all the treatments have been presented as viable. The second assay we tested five rooting media in three nodes cuts: homemade substratum; commercial substratum; fertilized sand; common sand and humid chamber. The dry masses of the cuts taken root in the homemade substratum and in the fertilized sand had not differed statistically between themselves, having been superior to the remaining treatments. Keywords: mint, vegetative propagation, cuts, stolons, substrata INTRODUÇÃO A Mentha x piperita (hortelã-pimenta) é uma das mentas mais importantes no universo das plantas medicinais e aromáticas. Trata-se de um hibrido que se deriva do cruzamento entre M. aquatica e M. spicata (Harley & Brighton, 1977). A Mentha x piperita é valorizada pelo buquet de seu óleo essencial e pela produção de mentol, componente de seu óleo essencial largamente utilizado na indústria de alimentos, bebidas e cigarros Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0145 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

81 709 como aromatizante, e na farmacologia por suas propriedades medicinais. O Brasil já foi o maior exportador mundial de óleo essencial de menta (Mentha piperita L.), entretanto, passou à grande importador, devido ao baixo nível tecnológico de produção empregado na região sul do país onde era cultivada em larga escala (Matos et al., 2003). As mentas podem ser multiplicadas por sementes ou por estaquia. No caso de híbridos estéreis resta apenas a multiplicação por estacas que pode ser de haste ou de estolão. Entretanto, as características da raiz e peso fresco são dependentes no tipo de estacas utilizadas, com os rizomas estiolados apresentando por vezes valores máximos e os valores mais baixos tendo sido das estacas da haste que diminuem na ordem: meio da haste > basal > apical (El-Keltawi & Croteau,1986). Podem se tornar invasoras, estendendo seus estolões tanto à flor da terra quanto subterrâneos, estes últimos também chamados de estiolados. Em presença de sol, toda a planta desenvolve a cor púrpura (Page & Stearn, 1985). Via de regra recomenda-se utilizar como material de multiplicação de Mentha spp, os rizomas (estolões) de plantas adultas cortados, com duas a três gemas (Duarte et al., 1998). Artefatos têm sido testados no sentido de agilizar o enraizamento de explants na ausência de solo com sucesso, incluindo a publicação de patentes (Thomas, 2009; Sangwan et al., 2009). O presente trabalho estudou a otimização do método de propagação vegetativa, variando o tamanho do propágulo e ampliando as opções para meios de enraizamento. Objetivou-se estabelecer a relação entre o enraizamento de estacas de estolões de Mentha piperita de vários tamanhos em diferentes meios de enraizamento e estudar o desenvolvimento posterior de mudas de um acesso em casa de vegetação. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Duarte et al. (1998) ao escrever instruções para o plantio a cultivar: IAC 701 de M. arvensis em São Paulo, recomenda utilizar como material de multiplicação rizomas de plantas adultas cortados, com duas a três gemas, sendo necessários 100 a 160 kg de rizomas em 100 a 120m 2 de canteiro, para produção de mudas para 1 ha. El-Keltawi & Croteau (1986) não encontraram diferenças significativas entre várias espécies de Mentha testadas em estaquia uninodal da haste, de estolões verdes e de rizomas estiolados para porcentagem de enraizamento, comprimento de raízes produzidas e massa fresca de tecido desenvolvido. Observaram ainda que o comprimento da raiz e a massa fresca eram altamente dependentes no tipo de estaca, sendo que os rizomas estiolados apresentaram valores máximos. Os valores mais baixos foram apresentados pelas estacas da haste. O posicionamento das estacas na planta também influenciou no desempenho na seguinte sequência decrescente: meio da haste>basal>apical. Várias substâncias de crescimento (ácido indol-3-butirico e ácido α-naftilacetico também foram testadas no ensaio. Azevedo & Chagas (2011) encontraram que em cinco semanas pós-transplante para em ensaio semelhante, a massa fresca de estacas de Mentha x villosa apresentou resultados de 60, 30 e 20g, respectivamente para estacas de 3 nós, 1 nó e ½ nó. Em outro ensaio, Bandeira (2013) estudou a produção de massa fresca da parte aérea de estacas uninodais de um acesso de Mentha piperita, sendo a média da massa fresca da parte aérea (MFPA) de 45g em média por planta. Chagas et al. (2008) avaliaram quatro diferentes tipos de estacas Mentha arvensis em substrato comercial Plantmax : estacas apicais retiradas da parte aérea; estacas retiradas da parte aérea mediana; estacas retiradas da ponteira do estolão e estacas retiradas da parte mediana dos estolões. Os autores observaram que, aos 25 e 40 dias após o plantio, as estacas apicais da parte aérea apresentaram maior enraizamento, melhor crescimento, desenvolvimento e precocidade Amaro et al. (2013) verificaram que a interação entre os fatores estacas e substratos não foi significativa, tendo-se decidido a estudar o efeito isolado de cada fator. Verificaram que a propagação de Mentha arvensis pode ser realizada tanto por estacas apicais como medianas, utilizando o substrato solo + areia + esterco bovino (2:1:1) para a obtenção de mudas de qualidade. Rech & Pires (1986) utilizaram segmentos nodais de plantas de um ano de idade de Mentha sp. em meio de Murashige e de Skoog (BMS), suplementado com o BAP (1.0; 2.0 mg/l) e KIN (1.0 mg/l) e mantido à 28 ± 1 C sob a luz fluorescente por 30 dias, visando obtenção de brotos. Após este período, diversos brotos com raízes foram produzidos, (15-20 brotos por explant). Posteriormente, os brotos obtidos foram colocados no solo para desenvolverem. Zheljazkov et al. (1996) observaram que os rendimentos em óleo essencial e o índice do mentol de seleções clonais de M. piperita e M. arvensis variaram de acordo método da propagação. Observaram também que todas as seleções clonais testadas excetuando-se uma, produziram os mais elevados rendimentos de biomassa fresca quando propagadas por estacas enraizadas e não por rizomas de verão e outono. Shasany et al. (1998) demonstraram que o tecido internodal de acessos das cvs Himalaya e Kalka de M. arvensis pode ser induzido para se obter brotos regenerantes diretos com elevada eficiência. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

82 710 Silva et al. (2003) avaliaram o método de propagação vegetativa por estaquia de Mentha arvensis em bandejas multicelulares e verificaram que a melhor estaca para propagação de Mentha arvensis é o rizoma em bandejas de poliestireno de 72 ou 128 células. Oliveira et al. (2011) experimentaram para produção de mudas de Mentha arvensis L, quatro tipos de substratos: T1 (solo+areia+ esterco na proporção 2:1:1); T2 (solo e areia na proporção 1:1), T3 (solo) e T4 (substrato comercial Plantmax ). Foram analisadas em estacas apicais e medianas, as variáveis comprimento de parte aérea e de raízes (cm), massa seca de parte aérea e raízes (g). Os autores concluíram que o substrato solo+areia+ esterco é o mais recomendado para o enraizamento de mudas de menta, utilizando estacas apicais e medianas nas condições do norte de Minas Gerais. Paulus et al. (2003) avaliando o efeito de diferentes tipos de substrato para cultivo hidropônico através do método de propagação vegetativa por estaquia de Mentha x villosa, verificaram que o substrato espuma fenólica apresentou os melhores resultados na produção de fitomassa fresca e seca total. Mattos et al. (2003) verificaram que acessos de diferentes espécies de Mentha podem apresentar resultados díspares ao serem propagados por miniestaquia, e que o vigor da matriz fornecedora das estacas é fundamental para o sucesso do método. Em ensaio realizado por Modak et al. (1989), talos apicais foram cortados e colocados durante 24 h em soluções de seis diferentes vitaminas em diferentes concentrações, e depois de plantados resultou em que a maior biomassa foi obtida com a aplicação 100 ppm de ácido ascórbico, seguida de 25 ppm de tiamina. Benvenido (2012) verificou que soluções homeopáticas de ácido salicílico em potências ímpares permitem a formação e o crescimento de raízes em estacas de caules aéreos de Mentha spicata, em magnitude semelhante ou superior aos controles. MATERIAL E MÉTODOS Ensaio 1 O primeiro ensaio foi realizado em condições de casa de vegetação do tipo glasshouse localizada na Estação Experimental de Biologia da Universidade de Brasília (UnB), em Brasília- -DF, à margem do Lago Paranoá, de a A temperatura média da casa de vegetação durante ao ensaio foi em média de 27 C, com média das mínimas de 16,2 C e das máximas de 38 C. O índice de sombreamento foi de aproximadamente 50%. Foram testados quatro tipos de estacas de estolão aéreo de M. piperita quanto ao número de nós (0,5; 1; 2 e 3). O tratamento estaca seminodal é obtido a partir da estaca uninodal. Os nós de Mentha apresentam cada um duas gemas que podem brotar e enraizar de forma independente. Secciona- -se então a estaca uninodal ao meio, separando-se as duas gemas botadas e enraizadas que serão as estacas semi-nodais. O enraizamento das estacas foi feito em 2 substratos: água em placas de Petri e substrato composto (Mistura EEB) em vasos de 2,5 L de capacidade. Na fase de enraizamento os vasos foram cobertos com campânulas de plástico transparente para manter a umidade e o calor. As estacas de 0,5 nó foram obtidas mediante divisão ao meio das estacas de 1 nó, após o seu enraizamento. A mistura EEB constou de latossolo vermelho de cerrado mais areia, vermiculita e composto orgânico respectivamente na proporção 3:1:1:1, mais a formulação , na dose de 100g para cada 40 L da mistura. A mistura EEB em análise por amostragem apresentou a seguinte composição média: matéria orgânica, 8,2%; nitrogênio, 0,52%; fósforo total 0,21%; potássio 0,46%; carbono orgânico 4,8%; relação C/N, 9,2; ph= 6,2. Após enraizadas, as mudas de 21 dias de idade foram transplantadas individualmente para vasos de 2,5 L de capacidade, preenchidos com a mistura EEB. Na terceira semana as plantas foram adubadas em cobertura mediante o fornecimento de 1 g da formulação NPK por vaso. O ensaio teve a duração de sete semanas, sendo a fase de enraizamento de três semanas e a fase de desenvolvimento sobre a mistura, de quatro semanas, quando então foi avaliada a biomassa fresca e seca das plantas e o numero e o comprimento das ramas. Análise dos dados Os dados foram processados estatisticamente com a Análise da Variância e o teste de Scott-Knott para separação das médias. Ensaio 2 O segundo ensaio foi realizado na Estação Experimental de Biologia da Universidade de Brasília em condições de casa de vegetação tipo glasshouse com 50% de sombra, medida por fotômetro Asahi Pentax SP-500. A temperatura média do ambiente no período do ensaio (15/06/2015 a 15/08/2015), com termômetro de máxima e mínima com a média das temperaturas máximas de 36,72ºC e média das temperaturas mínimas 12,72 ºC. Média geral, 24,72 ºC. Estacas de estolões aéreos de um acesso de Mentha piperita com três nós foram colocadas Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

83 711 em vasos de 2,5 L sobre 4 substratos sólidos, na posição horizontal, levemente pressionadas sobre a superfície dos substratos visando melhor contato. Algumas estacas foram colocadas numa câmara úmida de saco plástico transparente que foi colocada ao lado dos demais vasos. Os tratamentos foram: M= mistura EEB; S= substrato comercial; AA= areia adubada; A = areia; SP= saco plástico (câmara úmida) A mistura EEB constou de latossolo vermelho de cerrado mais areia, vermiculita e composto orgânico, respectivamente, na proporção 3:1:1:1, mais a formulação , na dose de 100g para cada 40 L da mistura. A Mistura EEB em análise por amostragem apresentou a seguinte composição média: matéria orgânica, 8,2%; nitrogênio, 0,52%; fósforo total 0,21%; potássio 0,46%; carbono orgânico 4,8%; relação C/N, 9,2; ph= 6,2. O substrato comercial é uma mistura de casca de Pinus bio-estabilizada, vermiculita, moinha de carvão vegetal, água e espuma fenólica. Foi utilizado o substrato Vivatto Slim (para composição, ver Tabela 1). A areia adubada recebeu suspensão homogênea fluida (fertilizante líquido) do tipo raiz da marca Vitaplan Slim, formulação (N; P 2 O 5; K 2 O). Conforme instruções do fabricante, diluíram- -se 5 ml do formulado em 1 litro de água destilada. Quinze mililitros (15 ml) da diluição foram colocados nos vasos com areia para criar o tratamento Areia Adubada. Os vasos com os substratos sólidos foram cobertos com campânulas de plástico rígido transparente com três furos de 1 cm de diâmetro na parte de cima, para facilitar a circulação do ar. As estacas do tratamento 5 (câmara úmida), foram colocadas no saco plástico transparente e dispostas na mesma bancada. Decorridos 28 dias a partir da implantação as estacas enraizadas e brotadas foram transplantadas para vasos de 2,5 L de capacidade preenchidos com a mistura EEB, estes sem a campânula, onde cresceram por mais 35 dias, quando então foi processada a avaliação da massa fresca e seca de cada planta. Análise dos dados Os dados foram submetidos à análise da variância e as médias distinguidas pelo teste de Scott-Knott. RESULTADOS E DISCUSSÃO Analisando-se os resultados, observa-se que houve interação entre tamanho de estaca e meio de enraizamento para numero de ramos, sempre com vantagem para mistura EEB e maiores tamanhos de estaca. Para numero de ramos, na presença de água, o melhor tamanho de estacas foi de dois nós. Na presença da mistura EEB o melhor resultado foi para estaca de três nós, seguido dos resultados para dois nós e um nó, restando o resultado para meio nó como o menor (Tabela 2). Estacas de dois nós e meio nó, não diferiram se enraizadas em água ou na Mistura EEB. Para tamanho da ramagem, os resultados foram semelhantes aos de número de ramos, diferindo apenas no referente à estaca de dois nós enraizadas em água, que produziram ramagem inferior às plantas cultivadas na mistura EEB (Tabela 3). Para a massa fresca da planta, os resultados das estacas de três e dois nós enraizadas em água diferiram estatisticamente entre si. Os resultados para estacas de dois, um e meio nós enraizados em água não diferiram daqueles de dois, um e meio nós enraizados na mistura EEB. As estacas de três nós enraizadas na mistura EEB, foram superiores às mesmas estacas enraizadas em água. As estacas de três nós enraizadas na mistura EEB foram estatisticamente semelhantes às estacas de dois nós e superiores às estacas de um e meio nó enraizadas a mesma mistura (Tabela 4). TABELA 1. Características gerais do Substrato Comercial Vivatto Slim, conforme fabricante. Diluição 1:5 v/v Massa/massa Densidade (base seca) Aditivos (massa/massa) ph C.E.(mS/cm) C.R.A. Umidade Fertilizante Corretivo 5 ± 0,5 1,2 ± 0,3 200% 48% 260 kg/m 3 1,50 % 0,20% C.E.=Condutividade elétrica em milisiemens/cm.; C.R.A.=Capacidade de Retenção de Água. TABELA 2. Médias do número de ramos de Mentha piperita aos 50 dias de cultivo referentes a dois meios de enraizamento e quatro tamanhos de estacas de rizoma aéreo. Meio de Tamanho da estaca- número de nós enraizamento ,5 Água 3,00 bb 5,00 aa 1,60 bb 1,00 Ab Mistura 8,40 aa 6,60 ab 5,40 ab 2,80 ac Nota: as médias seguidas das mesmas letras minúsculas na coluna e pelas mesmas letras maiúsculas na linha, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5%. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

84 712 TABELA 3. Médias do tamanho da ramagem (cm) de Mentha piperita aos 50 dias de cultivo referentes a dois meios de enraizamento e quatro tamanhos de estacas de rizoma aéreo. Meio de enraizamento Tamanho da estaca- número de nós ,5 Água 34,70 ba 56,20 ba 17,80 bb 10,60 ab Mistura 113,40 aa 87,80 aa 58,80 ab 29,30 ac Nota: as médias seguidas das mesmas letras minúsculas na coluna e pelas mesmas letras maiúsculas na linha, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5%. TABELA 4. Médias de massa fresca(g) de plantas de Mentha piperita aos 50 dias de cultivo referentes a dois meios de enraizamento e quatro tamanhos de estacas de rizoma aéreo. Meio de enraizamento Tamanho da estaca- número de nós ,5 Água 6,00 bb 10,00 aa 3,20 ab 2,40 ab Mistura 14,40 aa 12,00 aa 6,80 ab 5,60 ab Nota: as médias seguidas das mesmas letras minúsculas na coluna e pelas mesmas letras maiúsculas na linha, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5%. Para a massa seca de plantas, estacas de três nós enraizadas em água não diferiram das estacas de dois nós, o mesmo ocorrendo com as estacas enraizadas na mistura EEB. Estacas de três, um e meio nós enraizadas na mistura EEB foram superiores às mesmas estacas enraizadas em água. As estacas de dois nós. As estacas de dois nós não diferiram estatisticamente se enraizadas em água ou na mistura EEB (Tabela 5). Os resultados indicam que, de um modo geral, o enraizamento prévio de estacas maiores de dois e três nós na mistura EEB garantiu a melhor qualidade da muda em relação ao enraizamento prévio em água destilada, confirmando resultados anteriores (Duarte,1998; Oliveira et al.,2011; Amaro et al., 2013). No entanto, mudas viáveis foram produzidas em todos os tratamentos, incluindo o pré-enraizamento em água confirmando dados de Benvenido (2012), que enraizou estacas de Mentha spicata em soluções homeopáticas e em água destilada. Ensaio 2 Os resultados do Ensaio 2 encontram-se representados na Tabela 6 que apresenta as médias das massas fresca e seca de estacas de Mentha piperita aos 35 dias pós-transplante, previamente enraizadas por 28 dias em cinco meios de enraizamento. O tratamento câmara úmida teve o desempenho mais fraco para percentagem de estacas brotadas e massa seca. Para massa seca, foi seguido TABELA 5. Médias de massa seca(g) de plantas de Mentha piperita aos 50 dias de cultivo referentes a dois meios de enraizamento e quatro tamanhos de estacas de rizoma aéreo. Meio de enraizamento Tamanho da estaca- número de nós ,5 Água 0,53 ba 0,75 aa 0,21 bb 0,22 ab Mistura 1,22 aa 0,99 aa 0,54 ab 0,42 ab Nota: as médias seguidas das mesmas letras minúsculas na coluna e pelas mesmas letras maiúsculas na linha, não diferem estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5%. TABELA 6. Médias das massas fresca e seca de estacas de Mentha piperita aos 35 dias pós-transplante, previamente enraizadas por 28 dias em cinco meios de enraizamento. Tratamentos % de estacas brotadas Massa fresca (g) Massa seca (g) aos 63 dias aos 63 dias 1. Mistura EEB 90 54,20 a1 7,72 a1 2. Areia Adubada 90 60,20 a1 7,37 a1 3. Substrato Comercial 90 43,00 a1 5,75 a2 4. Areia 80 40,40 a1 3,25 a2 5. Câmara Úmida 56 16,00 a2 2,14 a2 CV - 18,89% 17,71% Obs.: as médias seguidas das mesmas letras não diferem na coluna pelo Teste Scott-Knott (1974) a 5%. Para efeito de análise os dados originais foram transformados em x 0,5 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

85 713 por areia e substrato comercial, no mesmo grupo de médias, todas inferiores às dos tratamentos areia adubada e mistura EEB. Para massa fresca, apenas o tratamento câmara úmida diferiu estatisticamente dos demais como mais fraco. A massa seca é mais adequada para a comparação de tratamentos pois não está sujeita ao efeito da umidade dos tecidos somada a alguma umidade residual, uma vez que as plantas são lavadas dos resíduos de solo e mesmo que se efetue seu enxugamento com tecido de algodão seco antes da pesagem, alguma umidade residual pode restar e aumentar o erro experimental para peso fresco. O enraizamento prévio ao transplante em meios mais férteis obviamente garante melhor desenvolvimento da estaca que tão logo emita as raízes já começa a absorver os nutrientes e a fabricar matéria seca. Daí o fraco desempenho do tratamento câmara úmida no qual a brotação e o enraizamento da estaca ocorrem às expensas apenas da reserva energética da estaca. A mistura EEB e a areia adubada com solução NPK possibilitaram, conforme esperado, os melhores resultados. O resultado modesto referente ao substrato comercial não surpreendeu, uma vez que a característica principal do produto é a facilitação do enraizamento sendo frequentemente suplementado com fertilizantes nos viveiros desta região visando melhor desenvolvimento das mudas (Villela, 2011) Apenas nos vasos do tratamento areia adubada, observou-se uma evidente proliferação de algas, certamente clorofíceas, na forma de uma mancha esverdeada na superfície do meio de enraizamento. A proliferação de tais algas em coleções d água, por exemplo, é um indicativo do fenômeno da eutrofização que se dá pelo aporte de nitrogênio e fósforo indicando a riqueza nutritiva do ambiente (Baptista & Araújo Neto, 1994) O sucesso da estaquia depende fatores intrínsecos à planta tais como a turgência, a reserva energética e as substâncias de crescimento, bem como de fatores externos relacionados à composição do meio de enraizamento que deve prover umidade e oxigênio, além de uma temperatura adequada em ambiente iluminado (Mattos, 1996). Os trabalhos de pesquisa tomam, em geral, a areia como referência de melhor meio de enraizamento criando misturas que visam corrigir a sua principal desvantagem qual seja a baixa retenção de umidade, não esquecendo a sua pobreza em nutrientes (Amaro et al., 2013; Oliveira et al., 2011). Alguns autores preferem investir na multiplicação e alongamento celular dos tecidos da estaca, tratando o material propagativo com substâncias de crescimento, tais como o ácido indol-3-butirico e o ácido α-naftilacetico (El-Keltawi & Croteau, 1986). Resultados interessantes também têm sido relatados, mediante o tratando das estacas com soluções de vitaminas (MODAK et al.,1989) e enraizamento de estacas em soluções homeopáticas de ácido salicílico (Benvenido, 2012). Mais recentemente tem-se observado que os substratos comerciais formulados contendo espuma fenólica, conforme utilizado no presente ensaio, têm apresentado resultados promissores, porém frequentemente seus resultados são secundários em relação a alguns substratos elaborados artesanalmente, encontrando-se nossos resultados em consonância com os obtidos por Chagas et al. (2008) e Oliveira et al. (2011). Alguns trabalhos com hidroponia, também relativamente recentes, têm contemplado o gênero Mentha pela facilidade com que as espécies do gênero se adaptam ao cultivo sem solo. As pesquisas de enraizamento de estacas de Mentha spp em meio líquido não são muito populares. No entanto, algumas propostas obtiveram resultados positivos, na esteira dos cultivos hidropônicos (Paulus et al., 2003) Minimizar o tamanho do propágulo para enraizamento em meio líquido sem investir na dispendiosa micropropagação laboratorial tem um apelo bastante acadêmico ainda. No entanto, a técnica é útil para aumentar o número de mudas produzidas, notadamente quando a disponibilidade do material propagativo é pequena (Rech & Pires, 1986; El-Keltawi & Croteau, 1986; Azevedo & Chagas, 2011). Neste campo, artefatos têm sido criados para incrementar o método com projetos patenteados (Thomas, 2009; Sangwan et al., 2009) Os resultados do presente trabalho ampliam as opções de propagação de mentas mediante a seleção dos meios de enraizamento, incluindo a inovação da câmara úmida, a eleição da parte da planta a ser trabalhada e a redução do tamanho do propágulo, enfoques que têm gerado resultados diversos entre os pesquisadores da matéria. CONCLUSÕES - O enraizamento de estacas de estolões aéreos de Mentha piperita de diferentes tamanhos em água destilada e em substrato artesanal mostrou-se viável. - Estacas de três nós enraizadas em areia suplementada com adubo líquido e em substrato artesanal orgânico-mineral apresentaram resultados superiores produzindo mudas de melhor qualidade. - Todos os tratamentos produziram mudas viáveis. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

86 714 REFERÊNCIAS AMARO, H.T.R; SILVEIRA, J.R; DAVID, A.M.S DE S; RESENDE, M.A.V DE; ANDRADE, J.A.S. Tipos de estacas e substratos na propagação vegetativa da menta (Mentha arvensis L.). Rev. Bras. Plantas Med.vol.15, n.3, pp AZEVEDO, G.R. Curva de produção de biomassa fresca de três tipos de mudas de Mentha x villosa Huds. em condições de estufa Trabalho de Conclusão de Curso de Graduação em Agronomia - Universidade de Brasília. BAPTISTA, G.M.M.; ARAÚJO NETO, M.D. O processo de eutrofização artificial do Lago Paranoá, Geonomos, v.2 n.2: BENVENIDO, R. P. L. Enraizamento de estacas de hortelã (Mentha spicata L.) em função de soluções homeopáticas centesimais ímpares derivadas de ácido salicílico. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. TCC da Faculdade de Ciências Farmacêuticas p. CHAGAS J.H., PINTO J.B.P., BERTOLUCCI, S.K.V. & NALON, F.H. Produção de mudas de hortelã-japonesa em função da idade e de diferentes tipos de estaca. Ciência Rural, Santa Maria, v.38, n.8, p DUARTE, F.R., MAIA, N.B., CALHEIROS, M. B. P., BOVI, O. A. Menta ou Hortelã. Mentha arvensis L. Boletim IAC - 200, p EL-KELTAWI, N E., CROTEAU, R. Single-node cuttings as a new method of mint propagation. Scientia Horticulturae. v. 29: HARLEY R. M.; BRIGHTON C. A. Chromosome numbers in the genus Mentha L. Botanical Journal of the Linnean Society v. 74 n.1 p MATTOS, J.K.A. ; MACHADO, R.M. ; SILVA, W.E.R.R. Propagação rápida de cinco espécies de hortelã mediante dois tipos de propágulo. In: Resumos 43º Congresso de Olericultura. Brasilia DF: Horticultura Brasileira, v. 21. p MODAK, S.B.; HATI, A.P.; DUTTA, P.K.; BASU, P.K. Effect of vitamins on cuttings of Mentha arvensis var. piperascens Holmes with emphasis on biomass production. Environment and Ecology 7(2): OLIVEIRA, M.B., AMARO, H.T.R., SILVA NETA, I.C., AS- SIS, M.O., DAVID, A.M.S.S., CUNHA, L.M.V. Qualidade de mudas de menta (Mentha arvensis L.) enraizadas em diferentes substratos, no norte de Minas Gerais. In: Resumos do VII Congresso Brasileiro de Agroecologia Fortaleza/CE 12 a 16/12/2011 pp 1 a 6 PAULUS, D.; SEGATTO F.B.; BORCIONE, E.; PUNTEL, RM; SANTOS,O. Efeito de diferentes substratos na produção de mudas de hortelã para cultivo hidropônico. Congresso Brasileiro de Olericultura Resumo expandido. RECH, E.L. PIRES, M.J. Tissue culture propagation of Mentha spp. by the use of axillary buds. Plant Cell Rep v.5(1): SANGWAN, R.S., SANGWAN, N.S., KUMAR, S. Process for the induction of normal roots on nodes and internodes of stem segments without using hormone and/ or chemical treatments in Mentha species. US B2. Council of Scientific & Industrial Research Patente. SHASANY, A.K.; KHANUJA, S.P.S.; DHAWAN, S.; YADAV, U.; SHARMA, S.; KUMAR, S. High regenerative nature of Mentha arvensis internodes. Indian Academy of Sciences, v.5, p ,1998. SILVA R. et al. Propagação vegetativa de estacas de hortelã-rasteira (Mentha villosa Huds) em bandejas multicelulares. In: Congresso Brasileiro de Olericultura, 41., 2001, Brasília, DF. Anais... Brasília: Sociedade de Olericultura do Brasil, v.19, n.2, Suplemento. THOMAS, P.E.L. A rhizome germinating technique for glasshouse propagation. pest articles & news summaries. Section C. Weed Control v.13, n VILLELA, J.G.A. Resistência de cultivares comerciais de maracujazeiro azedo a isolados de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae em condições de casa de vegetação. Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília; p. Monografia. ZHELJAZKOV, V., YANKOV, B., TOPALOV, V. Comparison of three methods of mint propagation and their effect on the yield of fresh material and essential oil, Journal of Essential Oil Research, v.8(1): Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

87 Erosion-inhibitions potential of Euclea natalensis-containing iron or fluoride gel in dentin: an in vitro study 715 SALES-PERES, S.H.C. 1 *; MAPENGO, M.A.A. 1 ; MARSICANO, J.A. 1 ; IONTA, F.Q. 1 ; FORIM, M.R. 2 ; SILVA, M.F.F.G. 2 ; SALES-PERES, A.C. 1 1Department of Pediatric Dentistry, Orthodontics and Public Health, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo (USP). Bauru-SP, Brazil. 2 Department of Chemistry, Laboratory of Natural Products, Federal University of São Carlos, São Carlos-SP, Brazil. *Corresponding author: * shcperes@usp.br ABSTRACT: The aim of the present study was to analyze the erosion-inhibiting potential of Euclea natalensis-containing iron or fluoride gel in dentin under acid challenge in vitro. A hundred and twenty dentin specimens were randomly allocated into six groups (n=10/gp): C (negative control, base gel); E (E. natalensis gel); Ir (FeSO4 gel); F (Fluoride gel); E+Ir (E. natalensis+ FeSO4 gel); E+F (E. natalensis+fluoride gel). The bovine dentin specimens were protected by a thin layer of gel and then subjected to four ph cycles, alternating the de- and remineralization in one day. For each cycle, samples were immersed in cola drink (10 min, 30 ml per block) and in artificial saliva (60 min, 30 ml per block) at 37 C, under agitation. Dentin alterations were determined by profilometry (μm). One-way ANOVA and Tukey s test were used (p <0.05). A significant reduction in dentin erosion was found for all tested gels, when they were compared to placebo group (p=0.00). However, iron gel, fluoride gel and E. natalensis+iron gel showed great protection against the dentin erosion (p<0.05). The preventive effects of the E. natalensis gels tested against dentin erosion may decrease demineralization. However, the inhibitory effect of demineralization was higher when the gel was associated with iron. Keywords: Ebenaceae; Tooth Erosion; Dentin; Iron; Fluoride RESUMO: Potencial inibidor de erosões na dentina do gel de Euclea natalensis contendo ferro ou fluor: um estudo in vitro. O objetivo do presente estudo foi analisar o potencial do gel de ferro ou fluoreto contendo Euclea natalensis na inibição da dentina erodida sob desafio ácido, in vitro. Cento e vinte amostras de dentina foram alocadas aleatoriamente em seis grupos (n=10/gp): C (controle negativo, gel base); E (gel E. natalensis); Ir (FeSO4 gel); F (Fluoride gel); E + Ir (gel de E. natalensis + FeSO4); E + F (E. natalensis + gel de flúor). Os espécimes de dentina bovina foram protegidos por uma fina camada de gel e depois submetidos a quatro ciclagens em um dia, alternando desmineralização e remineralização. Para cada ciclo, as amostras foram imersas em bebida de cola (10 min, 30 ml por bloco) e em saliva artificial (60 min, 30 ml por bloco) a 37 C, sob agitação. As alterações da dentina foram determinadas pela profilometria (μm). Foram utilizados ANOVA unidirecional e teste de Tukey (p<0,05). Foi encontrada redução significativa na erosão dentinária para todos os géis testados, quando comparados ao grupo placebo (p=0,00). No entanto, gel de ferro, gel de fluoreto e E. natalensis + gel de ferro mostraram maior proteção contra ao desafio erosivo em dentina (p<0,05). Os dos géis de E. natalensis testados apresentaram efeitos preventivos contra a erosão dentinária, podendo diminuir a desmineralização. No entanto, o efeito inibitório da desmineralização foi maior quando o gel esteve associado ao ferro. Palavras-chave: Ebenaceae; Erosões dentárias; Dentina; Ferro; Fluoreto INTRODUCTION The high consumption of acidic beverages and foodstuffs has drawn more attention to the risk for the occurrence of dental erosion (Swinburn et al., 2004). The resulting dental surface wear is irreversible and, if excessive, may reach pathological levels, affecting the dental pulp and modifying the form, function and esthetics of the teeth (Engle et al., 2010). The efficacy of fluoride application in preventing dental erosion has been investigated, and many studies have shown a protective effect Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0148 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

88 716 of fluoride agents against dentin erosion (Ganss et al., 2004; Schlueter et al., 2007; Wiegand et al., 2008). Several researches have demonstrated that the preparations containing ferrous sulphate have promoted protective effects against cyclic erosive attacks on enamel and dentin (Sales-Peres et al., 2007; Kato et al., 2010). It has been shown that a ferrous sulphate (FeSO4) solution applied after an erosive attack was able to significantly reduce dentin wear and reduce weakness in enamel (Sales-Peres et al., 2007). Dentin erosion has been defined as a complex process, initially characterized by mineral dissolution, which in turn exposes the organic matrix to breakdown by both bacteria- and hostderived enzymes, such as matrix metalloproteinases (Buzalaf et al., 2012). Preservation of the collagen layer has been reported to slow down the rate of progression of erosion (Ganss et al., 2001). Considering that the enamel does not contain an organic matrix, the preservation of dentine matrix by MMP inhibition seems to involve some action of ferrous sulphate (Kato et al., 2010). The organic layer seems be responsible for all further diffusion-controlled de- and remineralization processes. The effectiveness of fluoride in preventing erosive mineral loss in dentin essentially depends on the presence of a surface layer of demineralized organic matrix (Ganss et al., 2004). Although the effect of fluoride on enamel has been limited, it could be capable of inhibiting the progression of erosion in dentin completely after an initial period of demineralization (Ganss et al., 2001). The erosionprocess mechanism on exposed dentin surfaces is not fully understood. In several investigations about the contribution of natural products for the treatment of different oral diseases, experimental formulations have been used, and findings have shown that they did not cause significant side effects (Sales-Peres et al., 2011, 2012; Barbora et al., 2011; Subramaniam et al., 2012). On the east coast of Africa there is a plant species that belongs to the Ebenaceae family known as Euclea natalensis (McGaw et al., 2008). The roots of this plant have been used for oral care. It is known that E. natalensis has cytostatic properties (Evans, 2002), low toxicity in healthy tissues and anti-inflammatory action (Filipe et al., 2008), sufficient antibacterial inhibitory action to interfere in the virulence and growth of periodontopathic bacteria (Homer et al., 1990). In addition it reduced dentin permeability even under post-treatment citric acid challenge (Sales-Peres et al., 2012). Previous studies have investigated the erosion-inhibiting potential of several products by cyclic de- and remineralization models (Sales- Peres et al., 2007; Kato et al., 2010; Schlueter et al., 2010). In general, the solutions were applied frequently between erosive attacks, probably leading to the formation of a relatively thick protective layer. Considering that the E. natalenis is a natural plant and no data have yet been found on dentin erosion in the scientific literature, it would be important to analyze the possibility of using E. natalensis for the prevention and/or control of non-carious lesions. In this scenario, it would be important to know about the protective effect of a single application of E. natalensis containing iron or fluoride solution against dental erosion. Therefore, the aim of the present study was to investigate the erosion-inhibiting efficacy of a single application of E. natalensis gel containing iron or fluoride on dentin erosion. The null hypothesis was that the erosive loss of dentin surface was not significantly different between the experimentally-treated and control samples. MATERIAL AND METHODS Dentin specimen preparation Initially, 122 dentin specimens (4x4x3 mm) were prepared from extracted sound bovine incisors (Sales-Peres et al., 2007). Fragments were cut from each crown using an ISOMET Low Speed Saw cutting machine (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL, USA) and two diamond discs (Extec Corp., Enfield, CT, USA/ Ref: ), which were separated by a 4 mm diameter spacer. A diamond bur (KG Sorensen 4054, São Paulo, SP, Brazil) was used to remove the enamel surface and then the dentin surface of the blocks was ground flat with water-cooled carborundum discs (600 and 1200 grit Al2O3 papers; Buehler, Lake Bluff, IL, USA) and polished with felt paper wet with diamond spray (1 µm; Buehler, Lake Buff, IL, USA). In order to standardize the blocks for selection and randomized distribution, the surface hardness of the samples was determined by making five indentations (Knoop diamond, 25 g, 5 s, HMV- 2000; Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan). Blocks that presented 10% below and 10% above the mean micro-hardness value were excluded from the sample. Dentin samples with a mean micro-hardness of 55.25±6.43 KHN were randomly distributed into six groups (n=20 per group), which differed according to the type of gels tested. After allocation to the groups, two layers of nail varnish were applied on two-thirds of the surface of the dentin specimens in order to maintain reference surfaces for determining lesion depth. The samples were stored in artificial saliva at 37ºC for 24 h, to allow superficial hydration. The composition of the artificial saliva was: calcium 1.5 mmol L-1, phosphate 0.9 mmol L-1, KCl 150 mmol Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

89 717 L-1 in TRIS buffer 0.1 mol L-1, ph 7.0, containing 0.03 µg/ml fluoride (Vieira et al., 2005). Erosive ph-cycling Before erosive ph-cycling, a thin layer of the gels was applied with a microbrush for 1 min and then carefully removed with a cotton swab. All the gel formulations presented essentially the same base composition, except for the active agent: E (E. natalensis extract); Ir (10mmol/L FeSO4-positive control); F (1.23% NaF-positive control); E+Ir (E. natalensis+iron); E+F (E. natalensis+fluoride). The placebo gel (C) had no active agent (negative control). The specimens were submitted to four ph cycles under agitation in only one day. Each cycle consisted of demineralization by immersion in regular Coca-cola (ph 2.6) for 10 min (30 ml per sample) at room temperature, followed by a rinse in deionized water and remineralization in artificial saliva (30 ml) for 60 min at 37ºC. After each treatment, the specimens were rinsed with deionized water (Sales- Peres et al., 2007). Surface loss analysis After the ph cycles, the nail varnish over the reference surfaces was carefully removed with a scalpel blade, with care to avoid touching the dentin surface. The dentine loss was determined in relation to the reference surfaces (controlerosion) by using a contact profilometer ((Hommel Tester T 1000, Hommelwerke, VS, Schwenningen, Germany), as described by Sales-Peres et al. (2007). These profilometric traces were taken from the reference surface, across the exposed surface. The differences in height between the reference and exposed areas were quantified in microns. Five profile measurements were performed in the each specimen and averaged. Statistical analysis The assumptions of equality of variances and normal distribution of errors were analyzed by Kolmogorov-Smirnov s test. Since the assumptions were satisfied, data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA). For individual comparisons among the groups, Tukey s test was used. The level of significance was set at 5%. RESULTS Table 1 shows surface loss values found for all gels evaluated. In this study, the tissue loss was highest in the negative placebo group. The three gels containing E. natalensis significantly reduced dentin loss (p=0.000). The E. natalensis+iron gel presented a significantly lower mean wear than that observed TABLE 1. Wear (μm) and standard deviation (± SD) of dentin, with different treatments. Treatments n Mean±SD Iron gel (Positive Control) ±1.76 a Fluoride gel (Positive Control) ±1.68 a E. natalenis + Iron ±2.44 a E. natalenis + Fluoride gel ±1.21 b E. natalensis gel ±1.07 b Base gel (Negative Control) ±1.46 c * Distinct superscript letters indicate significant differences among the treatments (p<0.05). for the E. natalensis+fluoride group (p<0.05), which in turn did not significantly differ from E. natalensis (p>0.05). DISCUSSION This in vitro study investigated the protective effect of E. natalensis, iron, fluoride and combined compounds on the erosion of bovine dentin. Several studies assessing dentin erosion have used bovine tooth samples, because it might be easier to obtain a sufficient number of sound bovine teeth, in order to use the bovine dentin as substrate for these studies, than to obtain human teeth (Barbora et al., 2011; Yassen et al., 2011; Hariri et al., 2012). Previous studies using cyclic de- and remineralization procedures have used one or more applications of the experimental agents (Kato et al., 2009; Barbora et al., 2011; Sales-Peres et al., 2012). It is important to highlight that, in the present work, each gel was applied only once to analyze the efficacy of the protective effect of a single application against erosion. In this study, the data on erosion depth exhibited a similar trend as regards the relative efficacy of the different gels to inhibit dentin erosion when compared with the negative control (no active agent). Thus, the null hypothesis was rejected. All gels containing E. natalensis were able to significantly reduce dentin erosion, however the effect was particularly marked in the case of E+Ir gel group, in which the bulk tissue loss was greatly reduced. The pretreatment of specimens with E. natalensis+iron gel before the erosive challenge resulted in a mean lesion depth that was statistically significantly lower than the result obtained with E.natalensis+fluoride gel. It is reasonable to extrapolate that this observation is linked to the presence of protease inhibitors present in the former and that are absent in the latter gel. Another study indicated that protease inhibitors may reduce the degradation of the demineralized organic matrix against dentin erosion (Kato et al., 2012). The general characteristics of proteins with Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

90 718 high affinity for tannins are their large size, open loose structure, high proportion of hydrophobic amino acids, and high proline content (Hagerman & Butler, 1981). The proteins with lower affinity for tannins are generally small, compact, and crosslinked with disulfide bonds. Further studies should be conducted to investigate the action of tannins on salivary proteins and the action mechanism between iron and tannins. The progression of the dentin loss may be reduced by the preservation of the demineralized organic matrix. The demineralization process is increased by the enzymatic removal of the organic matrix by proteases. MMPs may play an important role in the progression of dentin erosion, and are present in both the dentin and saliva (Buzalaf et al., 2012). Some studies evaluated the inhibitory effect mechanisms of ferrous sulphate regarding the demineralization eroded dentin (Kato et al., 2012). The findings of present study indicate that perhaps the impermeability effect of E. natalensis could offer a mechanical protective effect against dentin erosion. The benefit of iron in dentin erosion is clearly explained by the inhibition of the organic matrix (Kato et al., 2012). On the other hand, it has been suggested that the preventive effect of fluoride against dentin erosion is mainly due to the mechanical protection of CaF2 precipitates, and to its remineralization capacity, reducing the demineralization (Ganss et al., 2010). Fluorhydroxyapatite, calcium fluoride and/or calcium fluoride-like minerals may form, depending on the treatment conditions, including ph and the concentrations of calcium and fluoride ions (Rosin-Grget & Lincir, 2001). The F gel group had the potential for formation of mixed mineral deposits containing calcium, fluoride and phosphate. However, the interaction between the components of E. natalensis+fluoride gel might reduce the action of fluoride on eroded dentin (p=0.034). The E. natalensis+f gel has tannins and fluoride in its composition. Tannins are acidic compounds that inhibit calcium absorption (Mehansho et al., 1987). The tannins+fluoride deposits showed very strong resistance to acid decalcification. These columnar deposits might contain CaF2-like substances and have unique morphological and qualitative features which are quite different from the deposits found after APF or NaF treatment in enamel (Yu et al., 1993). The same hypothesis can be used in the present study, to justify the differences between fluoride agents in dentin. In this scenario, the action mechanism simultaneously of E. natalensis and fluoride is still unclear. Further research could investigate whether the relative erosion-inhibiting effect may be connected with the presence of organic dentin matrix. A limitation of the in vitro de-remineralization methodology described in the present study is that it does not model the effect of gels that would occur in vivo. Tissue loss is rarely attributed to acidic action alone; rather the process of erosive wear is multifactorial in nature and involves varying degrees of interplay among the individual processes of erosion, abrasion, abfraction and attrition. Nevertheless, in seeking to better understand each contributing element, and the effects of a specific intervention, it is often useful to isolate one or more of these elements through control of the clinical design, as was done in this case. In conclusion, the results of the present study suggests that the preventive effects of the E. natalensis gel tested against dentin erosion may be explained due to their ability to block the dentinal tubules (Sales-Peres et al., 2012) and decrease demineralization, however, the effect of E. natalensis+iron gel on inhibiting the erosive demineralization of dentin was partly attributed to tubules. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank FAPESP for the concession of a grant to the first author (2010/ and 2015/ ) and CNPq for a scholarship to the fourth author. REFERENCES Barbosa CS, Kato MT, Buzalaf MA. Effect of supplementation of soft drinks with green tea extract on their erosive potential against dentine. Australian Dental Journal, v.56, p , Buzalaf MA, Kato MT, Hannas AR. The role of matrix metalloproteinases in dental erosion. Advances in Dent Research, v.24, p.72-6, Evans WC. Pharmocognosy: Saunders, p. Engle K, Hara AT, Matis B, Eckert GJ, Zero DT. Erosion and abrasion of enamel and dentin associated with at-home bleaching: an in vitro study. Journal of the American Dental Association, v.141, p , Filipe M, Gomes ET, Serrano R, Silva O. Characterization pharmacognostic of Euclea natalensis root. Workshop herbal and medicinal plants in the Tropics IICT / CCCM. 2008;11p. (In portuguese). Ganss C, Klimek J, Schaffer U, Spall T. Effectiveness of two fluoridation measures on erosion progression in human enamel in vitro. Caries Research, v.35, p , Ganss C, Klimek J, Starck C.Quantitative analysis of the impact of theorganic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography. Archives of Oral Biology, v. 49, p , Ganss C, Lussi A, Sommer N, Klimek J, Schlueter N. Efficacy of fluoride compounds and stannous chloride Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

91 719 as erosion inhibitors in dentine. Caries Research, v.44, p , Hagerman, AE, Butler, LG. The specificity of proanthocyanidin-protein interactions. Journal of Biological Chemistry, v.256, p , Hariri I, Sadr A, Nakashima S, Shimada Y, Tagami J, Sumi Y. Estimation of the Enamel and Dentin Mineral Content from the Refractive Index. Caries Research, v.47, p.18-26, Homer KA, Manji F, Beighton D. Inhibition of protease activities of periodontopathic bacteria by extracts of plants used in Kenya as chewing sticks (mswaki). Archives of Oral Biology, v.35, p , Kato MT, Magalhães AC, Rios D, Hannas AR, Attin T, Buzalaf MA. Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion. Journal of Applied Oral Science, v.17, p;560-4, Kato MT, Leite AL, Hannas AR, Oliveira RC, Pereira JC, Tjäderhane L, Buzalaf MA. Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion. Caries Research, v.44, p , Kato MT, Leite AL, Hannas AR, Calabria MP, Magalhães AC, Pereira JC, Buzalaf MA. Impact of Protease Inhibitors on Dentin Matrix Degradation by Collagenase. Journal of Dental Research, v.9, p , McGaw LJ, Lall N, Hlokwe TM, Michel AL, Meyer JJ, Eloff JN. Purified compounds and extracts from Euclea species with antimycobacterial activity against Mycobacterium bovis and fast-growing mycobacteria. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v.31, p , Mehansho H, Butler LG, Carlson DM. Dietary tannins and salivary proline-rich proteins: interactions, induction and defense mechanisms. Annual Review of Nutrition, v.7, p , Sales-Peres SH, Pessan JP, Buzalaf MA. Effect of an iron mouthrinse on enamel and dentine erosion subjected or not to abrasion: an in situ/ex vivo study. Archives of Oral Biology, v.52, p , Sales-Peres SH, Magalhães AC, de Andrade Moreira Machado MA, Buzalaf MA. Evaluation of the erosive potential of soft drinks. European Journal of Dentistry, v.1, p.10-3, Sales Peres SHC, Carvalho FLNd, Marsicano J, Mattos MC, Pereira JC, Forim MR, Silva MFGF. Effect of propolis gel on the in vitro reduction of dentin permeability. Journal of Applied Oral Science, v.19, p , Sales-Peres Ade C, Marsicano JA, Garcia RP, Forim MR, Silva MF, Sales-Peres SH. Effect of natural gel product on bovine dentin erosion in vitro. Journal of Applied Oral Science, v.21, n.6, p , Sales-Peres SHC, Brianezzi LFF, Marsicano JA, Forim MR, Silva MFGF, Sales-Peres A. Evaluation of an experimental gel containing Euclea Natalensis: an in vitro study. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, ID , Schlueter N, Ganss C, Mueller U, Klimek J. Effect of titanium tetrafluoride and sodium fluoride on erosion progression in enamel and dentine in vitro. Caries Research, v.41, p.141-5, Schlueter N, Neutard L, von Hinckeldey J, Klimek J, Ganss C. Tin and fluoride as anti-erosive agents in enamel and dentine in vitro. Acta Odontologica Scandinavica, v.68, p.180-4, Subramaniam P, Eswara U, Maheshwar Reddy KR. Effect of different types of tea on Streptococcus mutans: an in vitro study. Indian Journal of Dental Research, v.23, p.43-8, Swinburn BA, Caterson I, Seidell JC, James WPT Diet, nutrition and the prevention of excess weight gain and obesity. Public Health Nutrition, v.7, p , Vieira AE, Delbem AC, Sassaki KT, Rodrigues E, Cury JA, Cunha RF. Fluoride dose response in ph-cycling models using bovine enamel. Caries Research, v.39, p , Yassen GH, Platt JA, Hara AT. Bovine teeth as substitute for human teeth in dental research: a review of literature. Journal of Oral Science, v.53, p , Review. Wiegand A, Meier W, Sutter E, Magalhães AC, Becker K, Roos M, et al. Protective effect of different tetrafluorides on erosion of pellicle-free and pellicle-covered enamel and dentine. Caries Research, v.42, p , Rosin-Grget K, Lincir I. Current concept on the anticaries fluoride mechanism of the action. Collegium Antropologicum, v.25, p , Review. Yu H, Xu LX, Morioka T. The effect of a tannin-fluoride mixture on human dental enamel. Caries Research, v.27, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

92 720 Etnoconhecimento de espécies nativas utilizadas para uso terapêutico em uma área de cerrado na chapada do Araripe, Crato, CE, Brasil MACÊDO, D.G. 1* ; ALMEIDA, B.V. 1 ; SOUSA, F.F.S. 1 ; MACEDO, J.G.F. 1 ; SANTOS, M.O. 1 ; MACÊDO, FERREIRA, M.J. 1 ; SOUZA, M.M.A. 2 1 Universidade Regional do Cariri, Laboratório de Botânica, Crato, CE, Brasil; 2 Universidade Regional do Cariri, Departamento de Ciências Biológicas, Crato, CE, Brasil. * delmaciamacedo@yahoo.com.br RESUMO: Este trabalho visou registrar a diversidade local de plantas medicinais utilizadas pela comunidade, verificando a versatilidade das espécies utilizadas e/ou consenso de uso e conhecimento entre os informantes da comunidade Barreiro Grande, no Município de Crato, CE. Foram registradas 27 espécies com fins medicinais, pertencentes a 27 gêneros e 15 famílias com destaque para Fabaceae. Dez espécimes apresentaram grande versatilidade de uso, no entanto, o Croton heliotropiifolius e a Caryocar coriaceum apresentaram os maiores valores de IR (2,0 e 1,87). As indicações terapêuticas foram agrupadas em 12 categorias de sistemas corporais, com maior fator de consenso entre os informantes para afecções ou dores não definidas (0,72) e transtornos do sistema respiratório (0,70). Apesar do uso popular destas espécies no combate a várias enfermidades, há necessidade de estudos fitoquímicos e farmacológicos que comprovem estas atividades, com vista ao desenvolvimento de novos fitoterápicos. Palavras-chave: Etnobotânica, potencial terapêutico, semiárido ABSTRACT: Etnoconhecimento of native species used for therapeutic use in an area of cerrado in chapada do Araripe, Crato, CE, Brazil. This work aimed to record the local diversity of medicinal plants used by the community, checking the versatility of the species and consensus of use and the knowledge among the informants of community Barreiro Grande, Crato, CE, Brazil. Twenty seven species were registered for medicinal purposes, 27 genera and 15 families, especially Fabaceae. Eleven specimens showed great versatility of use, however, Croton heliotropiifolius and Caryocar coriaceum showed the highest values of IR (1.87 and 2.0). The indications were grouped into 12 categories of bodily systems, with higher factor consensus among informants for pain disorders (0.72) and disorders of the respiratory system (0,70). Despite the popular use of these species in treating various diseases, there is a need of phytochemical and pharmacological studies in order to prove these activities, aiming the development of new herbal medicines. Keywords: ethnobotany, therapeutic potential, semi-arid INTRODUÇÃO Diversos campos da ciência têm-se dedicado à pesquisa das plantas medicinais. Dentre estes, a etnobotânica desponta como um campo interdisciplinar, compreendendo o estudo e a interpretação do conhecimento, significação cultural, manejo e usos tradicionais dos elementos da flora (Caballero, 1979). A medicina tradicional vem oferecendo uma contribuição cada vez maior, devido a uma gama de conhecimentos e práticas médicas de caráter empírico, influenciadas pelo contexto sócio-cultural, econômico e físico, no qual se encontram inseridos (Camargo, 1976). Com isso, a busca por princípios ativos mais eficazes, e menos agressivos ao homem, tem colocado a pesquisa sobre plantas medicinais num importante patamar científico e tem criado novas perspectivas em relação à área. O Brasil possui biomas de grande diversidade genética, entre eles o cerrado, abrigando 30% da diversidade do país (Pagotto et al., 2006) e cerca de 23% do território brasileiro. Um complexo vegetacional rico em heterogeneidade de habitat e diversidade vegetal. Levantamentos etnobotânicos realizados em áreas de cerrado são instrumentos promissores na descoberta de novas drogas, uma vez que o Brasil possui altos índices de biodiversidade e endemismo. Algumas publicações Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0151 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

93 721 ilustram a rica flora deste bioma e suas variadas finalidades medicamentosas (Cunha & Bortolotto, 2011; Oliveira et al., 2010; Saraiva et al. 2011),. No entanto, a maioria destes estudos concentramse nos estados de Mato Grosso, Goiás e Minas Gerais (Botrel et al., 2006; Alves et al., 2008; Silva & Proença, 2008) e poucas áreas em cerrados disjuntos (Macêdo et al.,2015; Ribeiro et al., 2014; Saraiva et al., 2015). Apesar de 90% da população economicamente carente do Nordeste utilizar a medicina tradicional, para cura de seus problemas de saúde (Matos, 2002), para os cerrados nordestinos ainda existe uma visível carência de estudos, principalmente no que se refere a levantamentos etnobotânicos e etnofarmacológicos. O incremento de estudos nestas áreas pode contribuir para a descoberta de princípios ativos mais eficazes e menos agressivos ao homem, possibilitando o desenvolvimento de novos fármacos. Portanto, esse trabalho relata a utilização de plantas medicinais em uma área de cerrado na Chapada do Araripe, Crato, CE, através da investigação da diversidade de plantas medicinais na comunidade; verificando a versatilidade das espécies utilizadas e o consenso de uso e/ou conhecimento entre os informantes e apontando qual grupo de espécies merecem estudo mais aprofundado, por serem potencialmente ativas como fitoterápicos. MATERIAL E MÉTODOS Área de estudo As entrevistas foram realizadas no Sítio/Fazenda Barreiro Grande ( ,7 S e ,4 W, altitude de 909 m acima do nível do mar) situado no município de Crato CE a 65,9 FIGURA 1. Área de estudo no Ceará, Brasil. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

94 722 km de proximidade com o município de Serrita-PE, estabelecida em uma área de cerrado na Floresta Nacional do Araripe (FLONA- Araripe Apodi) ao sul do Estado do Ceará (Figura 1). A FLONA-Araripe está localizada na Chapada do Araripe, possuindo uma área de ,32 ha, abrangendo parte dos municípios de Santana do Cariri, Crato, Barbalha e Jardim. Apresenta uma superfície tabular, conservada em um nível de 800m a 1000m de altitude (CAVALCANTI, 1994). Está sob influência do clima tropical quente e úmido com estação chuvosa de janeiro a maio. A temperatura anual e de 24º a 26ºC com precipitação média anual de 1090,9mm (IPECE, 2012). Barreiro Grande possui em torno de oito famílias com residência fixa na localidade, com faixa etária que varia de 0 a 89 anos, sendo a maioria católica. Dentre as principais atividades econômicas, praticam agricultura de subsistência e obtém renda complementar da venda de frutos de espécies nativas, principalmente o pequi. A comunidade dispõe de luz elétrica, sendo a água acumulada em cisternas por ocasião das chuvas, não existindo canalização para as residências. Não dispõe de posto de saúde, e seus moradores são acompanhados por uma agente de saúde que os encaminha para o município de Crato para serem atendidos. Levantamento Etnobotânico As informações sobre o conhecimento dos sitiantes a respeito das espécies medicinais foram obtidas após solicitação da permissão formal aos entrevistados e o consentimento destes. Foram realizadas entrevistas no período de fevereiro a março no ano de 2014 através da técnica bola de neve, totalizando 15 informantes, considerados informantes chaves na área de estudo. As espécies tiveram sua condição classificada como espécies nativas ocorrentes em área de cerrado. Foram realizadas entrevistas semi-estruturadas guiadas por um roteiro com perguntas relacionadas ao conhecimento e uso das espécies, aplicando-se adicionalmente a observação direta (Albuquerque & Lucena 2004). Levantamento florístico O material botânico foi coletado e a identificação do material herborizado foi realizada por especialistas, através de comparações com exsicatas de herbário e/ou através de bibliografia especializada. As espécies foram incorporadas ao Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade Regional do Cariri (HCDAL-URCA). O sistema de classificação de espécies adotado foi Angiosperm Phylogeny Group (APG III). Para revisão dos nomes científicos das espécies foi consultado o banco de dados do Missouri Botanical Garden (Mobot), disponível em org, e a Lista de Espécies da Flora do Brasil, disponível em Salientamos que essa pesquisa se encontra em conformidade com as normas e diretrizes bioéticas que vigoram para estudos envolvendo seres humanos (Resolução Nº 196/1996 do Conselho Nacional de Saúde CNS) (Brasil, 1996), cujo projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Regional do Cariri e aprovado com parecer n /2013. Análise dos dados O índice de importância relativa (IR) das plantas medicinais identificadas foi calculado de acordo com a metodologia proposta por Bennett e Prance (2000). A importância relativa é um método quantitativo que mostra a importância de uma espécie com base em sua versatilidade, sendo 2 o valor máximo obtido por uma espécie. O cálculo é feito de acordo com a fórmula: IR= NSC+NP, onde IR corresponde a Importância Relativa, NSC é o número de sistemas corporais, determinado por um determinada espécie (NSCE), dividido pelo número total de sistemas corporais tratados pela espécie mais versátil (NSCEV); NP corresponde ao número de propriedades atribuídas a uma determinada espécie (NPE), dividido pelo número total de propriedades atribuídas a espécie mais versátil (NPEV) (Silva et al a); Almeida & Albuquerque 2002). O cálculo deste índice foi baseado na distribuição das indicações de uso das etnoespécies em sistemas corporais, relacionados a 12 categorias da Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde- CID- 10 (OMS, 2000). Para analisar a concordância de uso das espécies pelos citantes, foi calculado o Fator Consenso de Informante (FCI), de acordo com a técnica de Trotter e Logan (1986). Para o cálculo do FCI foi utilizada a seguinte fórmula: FCI = nur na/ nur 1, onde FCI refere-se ao Fator de Consenso dos Informantes, (nur) é o número de citações de usos em cada categoria e (na) corresponde ao número de espécies indicadas em cada categoria. Os valores de FCI variam de 0 a 1. RESULTADOS E DISCUSSÃO Diversidade das espécies medicinais Foram registradas 27 espécies de plantas medicinais nativas, pertencentes a 15 famílias e 27 gêneros (Tabela 1). Em outros levantamentos etnobotânicos em áreas de cerrado estes resultados encontram-se na faixa inferior da variação de espécies medicinais para o cerrado que é de 20 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

95 723 a 143 espécies (Souza & Felfilli 2006; Botrel et al. 2006; Silva & Proença 2008; Cunha & Bortolloto, 2011; Pasa, 2011). Entretanto, apesar do número reduzido, existem espécies exclusivas desta área, como Myracrodruon urundeuva A., Hancornia speciosa Gomes., Hymenaea courbaril L., e Copaifera langsdorffii Desf. A família Fabaceae apresentou o maior número (9) de espécies (Tabela 1), e é bem representada em diversas pesquisas etnobotânicas, como a de Oliveira et al. (2010) com 28 espécies de uso medicinal em uma área de transição vegetacional caatinga/cerrado no município de Oeiras, Piauí. No assentamento Monjolinho, município de Anastácio, Mato Grosso do Sul, foram encontradas 23 espécies para esta família, sendo 20 nativas, usadas no tratamento de tosse, garganta, bronquite e cicatrizante (Cunha & Bortolotto 2011). Algumas espécies de Fabaceae apresentam células secretoras contendo taninos, os quais possuem atividades, antisséptica, antidiarreica e antioxidante (Bruneton, 2001). TABELA 1. Lista de espécies medicinais indicadas pelos informantes da comunidade Barreiro Grande no município de Crato, Ceará, Brasil. Família e nome científico Anacardiaceae Myracrodruon urundeuva A. Astronium fraxinifolium Schott ex Spreng. Apocynaceae Ditassa R.Br. Himatanthus drasticus Nome popular HB Parte utilizada Preparo Aroeira Ar Cc Infusão, decocção, Gonçalo- banho Utilização/ Indicação popular IR NH Cólica, cicatrizante 0,75 Ar Ec Lambedor, Infusão Bronquite, gripe, tosse 0, Alves Caninana Tp Fo Infusão Reumatismo 0, Janaguba Ar La Látex com água Gastrite, dor no (Mart.) Plumel estômago, úlcera, câncer Hancornia speciosa Gomes. Mangaba Ar La Látex com água Gastrite, estômago, Secondatia floribunda A.DC Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand Caryocaraceae Caryocar coriaceum Wittm. Celastraceae Maytenus rigida Mart. Euphorbiaceae Croton heliotropiifolius Kunth Erythroxylaceae Erytroxylum sp. Fabaceae Bowdichia virgiloides Kunth. Catuaba de rama Tp Cc Decocçã, infusão na colesterol, hérnia, pressão alta Reumatismo, nervos, impotência sexual 1, , ,12 cachaça Amescla Ab Rs Inalação Dor de cabeça 0, Piqui Ar Fr Óleo com água, lambedor Tosse, gripe, garganta, pneumonia, inchaço, inflamação em geral, inflamação na pele. Bom-nome Ar Cc Decocção, banho Inflamação no útero, Velame branco inflamação em geral, cicatrizante Hb Ra, Fo Infusão, decocção Reumatismo, dor de dente, depurativo, dor de barriga, febre, dor no corpo, problemas estomacais, furúnculo 1, ,12 Murta Ab Fo Decocção Câncer 0,37 Sucupira Ar Ec Decocção Coluna, artrose, tosse, gripe, rins, reumatismo 2, , continua... Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

96 724 TABELA 1. Continuação Centrosema sp. Alcançu Ab Ra Infusão, lambedor Gripe, crise de garganta 0, Copaifera langsdorffi Desf. Pau d óleo Ar Ec Óleo com água Reumatismo, dores 1, em geral, pancadas, cicatrizante Dimorphandra gardneriana Faveira Ar Se Maceração Coração 0, Tull. Hymenaea courbaril L. Jatobá Ar Cc Lambedor Bronquite, tosse, gripe 0, Senna occidentalis (L.)Link Manjirioba Hb Ra Decocção Dor de cabeça, trombose, tosse, gripe 1, Stryphnodendron Barbatimão Ar Cc Torra a casca faz Ferimento, dor na barriga, 1, rotundifolium Mart. decocção cicatrizante, inflamação em geral Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. Jurema preta Ar Cc Lambedor,decocção Cicatrizante, dor de dente 0, Acosmium dasycarpum Benth. Myrtaceae Psidium sp. Olacaceae Ximenia americana L. Passifloraceae Passiflora cincinnata Mast. Pau pratudo Ab Cc Lambedor Tosse, hérnia 0,75 Araçá de Ab Fo Infusão Pressão alta 0, veado Ameixa Ab Cc Infusão, banho Ferimento, cicatrizante, 1, inflamação, tosse, gripe Maracujá Tp Fo, Fr Decocção, suco Pressão alta, nervos 0, do mato Phyllanthaceae Phyllanthus niruri L. Rubiaceae Tocoyena formosa (Cham. & Schltdl.) Schum. Rutaceae Zanthoxylum gardineri Engl. Violaceae Hybanthus ipecacuanha L. Quebra pedra Jenipapo brabo Hb Ra Infusão Rins 0,37 Ar Cc Infusão Picada de animal, Torção 0, Laranjinha Ar Fo e Fr Decocção Dor de cabeça 0,37 Papaconha Hb Ra Infusão Gripe, dor de dente 0, LEGENDA: Ar: arbóreo; Ab: Arbustivo; Hb: Herbáceo; Tp:Trepadeira; Fo: folhas; Ra: raiz; Se: semente; Cc: casca do caule; Ec: entrecasca do caule; Fr: fruto;la: látex; Rs: Resina; IR: Importância Relativa, HB: Hábito da planta; NH: Número de Herbário. No componente arbóreo foram identificadas 16 espécies em oito famílias, predominando a Fabaceae pela sua maior riqueza. No arbustivo, seis espécies e cinco famílias, e no herbáceo, quatro espécies distribuídas em quatro famílias e as trepadeiras, três espécies. Em outros estudos o hábito arbóreo também prevalece em outras áreas de cerrado (Guarim Neto & Morais 2003; Botrel et al. 2006; Tunholi, 2011), seguido de arbustivo e herbáceo. Do total de preparações caseiras, a casca do caule foi empregada em 32%, seguidas de folhas (25%), raízes (17,85%), entrecasca e frutos com 10,71% cada; resinas, látex e sementes juntos somam 14,28%. Segundo Martins et al. (1995), o uso recorrente das folhas decorre provavelmente da presença de princípios ativos nesses órgãos ou fragmentos. Foram registradas 10 formas de preparo, sendo que decocção e a infusão foram os mais Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

97 725 frequentes com 30,76% e 28,20%, respectivamente. As demais preparações foram; lambedor, banho, mistura de óleo e látex com água, suco, maceração, inalação e na cachaça, totalizando 41,04%. Estas formas de preparo também foram encontradas por diversos autores (Alves & Povh 2013; Amorozo, 2002; Oliveira et al. 2010), entretanto, a maior predominância verificada foi o chá por decocção e infusão. Versatilidade em relação aos usos das espécies medicinais Das 27 espécies, 10 apresentaram grande versatilidade em relação a seus usos, sendo indicadas para 28 indicações terapêuticas, mostrando alta importância relativa (IR>1). As espécies mais versáteis estão apresentadas na tabela 1 com seus respectivos sistemas corporais e propriedades medicinais. Estas espécies também se destacaram em outros trabalhos envolvendo a etnobotânica de espécies de cerrado (Franco & Barros, 2006; Moreira & Guarim Neto 2009; Roque, 2009; Balcazar, 2012). Entretanto, algumas delas, não são expressas por sua importância relativa e sim pelo seu valor de uso, que consiste no número de usos e de pessoas que citaram determinadas espécies consideradas mais importantes em uma dada população (Galeano, 2000). A espécie mais versátil foi o Croton heliotropiifolius (sinônimo C. rhamnifolius) é endêmica do Nordeste do Brasil. Abrangeu quatro sistemas corporais e oito propriedades medicinais, dentre elas reumatismo, dor de dente, depurativo, febre e dor de barriga. No semiárido pernambucano, esta espécie se encontrava entre as dez espécies com maiores índices de importância relativa (IR= 1,20), confirmando, assim, a sua versatilidade também em outras áreas (Albuquerque et al., 2006). A seu respeito, já se sabe que estudos realizados com extrato da raiz de C. heliotropiifolius revelaram atividade antiespasmódica (Maciel et al., 2000), antitumoral (Torrance et al., 1977) e antimicrobiana (Peres et al., 1997). A Caryocar coriaceum, apresentou quatro sistemas corporais e sete propriedades medicinais, sendo indicada para problemas respiratórios, inchaço, inflamações em geral e inflamação na pele. Esta espécie foi citada no Piauí (Franco & Barros 2006) e no Ceará (Balcazar, 2012) com valor de uso de 1,00 e 0,8, respectivamente, sendo utilizada no tratamento de gripe e tosse, sob forma de lambedor. Foi comprovado que o óleo fixo das sementes de C. coriaceum inibe a inflamação tópica e acelera o processo de cicatrização cutânea, comprovando o seu uso popular como agente anti-inflamatório e cicatrizante (Saraiva et al., 2011). A Hancornia speciosa, com quatro sistemas corporais e oito citações de uso, é utilizada para gastrite, dor no estomago, colesterol, hérnia e pressão alta. Em Nova Xavantina-MT, a H. speciosa estava entre as dez espécies medicinais mais indicadas, usadas como anti-hiperlipidêmicas e anorexígenas (Silva et al., 2010b). Em outros estudos se destaca pelo seu valor de uso na categoria medicinal e alimentícia (Lima, 2008; Moreira & Guarin Neto, 2009). Estudos farmacológicos apontam que o extrato etanólico das folhas de H. speciosa apresenta atividade antihipertensiva (Serra et al., 2005) e antiinflamatória (Endringer et al., 2006). A Bowdichia virgiloides foi indicada para tratar problemas respiratórios, de coluna, artrose, problemas renais e reumatismo. No entanto, foram verificadas outras propriedades para esta espécie, sendo estas, afecções nas vias urinárias e antiinflamatória (Silva et al., 2010b). Em Esperantina, PI, esta espécie obteve VU= 1,00, sendo utilizada para gripe, dor de cabeça e inflamação (Franco & Barros 2006). As cascas da B. virgiloides foram testadas e foi verificado potencial antiinflamatório, confirmando assim o seu uso tradicional (Barros et al., 2010). A Ximenia americana é utilizada para ferimentos, cicatrizante, inflamações em geral e problemas respiratórios. Esta espécie também é citada nos estudos de Franco & Barros (2006) e Gomes et al. (2008) para o mesmo uso medicinal. No estudo de Oliveira et al. (2010) a X. americana obteve um valor superior ao deste estudo (IR = 1,79) com indicações para gastrite, fratura, queimadura e coceira. Já se sabe que, tanto o extrato da casca, como das folhas, da X. americana possuem atividade antifúngica comprovada (Omer & Elnima 2003). O Stryphnodendron rotundifolium, a Copaifera langsdorffii e a Senna occidentalis obtiveram o mesmo valor de importância dentro da comunidade. S. rotundifolium foi referido neste estudo para ferimentos, dor na barriga, cicatrizante e inflamações em geral, além destas indicações. Souza et al. (2014) cita esta espécie para câncer, inflamação no útero, cansaço respiratório e hemorragia, tendo apresentado IR superior ao deste estudo (1,75), sendo considerado versátil na comunidade. Mesmo com poucos estudos sobre o S. rotundifolium, o extrato etanólico, a partir da casca do caule, exibiu atividade antimicrobiana, anti-úlcera e gastroprotetora (Rodrigues et al., 2008). A Copaifera langsdorffii obteve indicações para reumatismo, dores em geral, para pancadas e como cicatrizante. Em outros estudos esta espécie recebeu indicações para bronquite, coluna, gripe (Cunha & Bortoloto, 2011), antiinflamatório, cicatrizante (Pasa, 2011) e para afecções das vias Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

98 726 urinárias (Rodrigues & Carvalho, 2001). Estudos revelam que o ácido caurenóico isolado a partir do óleo da C. langsdorffii apresentou potencial antiinflamatório e citotóxico, inibindo o crescimento de células cancerosas (Costa-Lofuto et al., 2002; Paiva et al., 2003). Para a Senna occidentalis as indicações foram dor de cabeça, trombose, tosse e gripe. Já no estudo de Agra et al. (2008) esta espécie é citada para problemas intestinais, sendo utilizada como laxante. No Quilombo maranhense, a S. occidentalis esteve presente entre as plantas medicinais mais citadas pelos informantes (Monteles & Pinheiro 2007). Desta espécie foi relatado tanto sua atividade antibacteriana como antimalária através do extrato da folha, da casca e raiz desta planta (Samy, 2000). A Secondatia floribunda foi indicada para reumatismo, nervos e impotência sexual. Na medicina popular, além de impotência, é utilizada para fraqueza (Matos, 1999; Quinet & Andreata, 2005). Esta espécie apresentou valor de IR= 0,24, inferior ao deste estudo, exibindo propriedades semelhantes (Souza et al., 2014). Não foram encontrados trabalhos disponíveis que comprovem a sua eficácia terapêutica. No entanto, no estudo de Santos (2011) o extrato etanólico de S. floribunda revelou a presença de taninos, flavonoides e alcaloides. A Maytenus rigida recebeu indicações para, inflamação no útero, inflamações em geral e cicatrizante. Dados semelhantes podem ser encontrados nos trabalhos de Mota & Albuquerque (2002) sendo empregada também nos casos de dores em geral e infecções. No Nordeste do Brasil, em uma área de caatinga, a M. rígida obteve valor de IR 0,57, inferior ao deste estudo, sendo indicada para impotência sexual e reumatismo (Almeida et al., 2005). Ensaios farmacológicos com extratos desta espécie comprovaram atividade antinociceptiva (Dias et al., 2007), antioxidante (Estevam et al., 2009), anti-inflamatória, antiulcerogênica e antiespasmódica (Santos, 2008). O Himatanthus drasticus obteve indicações de uso para gastrite, dor no estômago, úlcera e câncer. Esta espécie é muito utilizada na medicina popular como antitumoral antifúngico e antiinflamatório (Larrosa & Duarte 2005). Em um estudo sobre a dinâmica do uso de plantas medicinais na Floresta Nacional do Araripe, CE, o H. drasticus apresentou valor comercial de 88% e foi citado por 99 informantes que utilizavam tanto o látex como a casca da planta (Balcazar, 2012). Para esta espécie foi verificado efeito antiinflamatório, gastroprotetor e antinociceptiva (Lucetti et al., 2010; Colares et al., 2008). Das espécies mais versáteis, nota-se que algumas indicações terapêuticas já foram comprovadas, entretanto, algumas delas ainda precisam de estudos mais aprofundados, como no caso de C. heliotropiifolius, B. virgiloides, C. langsdorffii e S. floribunda para reumatismo, X. americana, S. rotundifolium, C. langsdorffii e M. rígida como cicatrizante e C. coriaceum, X. americana, S. rotundifolium e M. rígida para inflamação. Concordância de uso e conhecimento das espécies medicinais As plantas medicinais foram indicadas para 37 finalidades terapêuticas e agrupadas em 12 categorias de sistemas corporais (Tabela 2). No geral, as categorias apresentaram concordância entre os informantes com valor variando de 0,05 a 0,72 sendo que para três categorias não houve consenso entre os informantes. No entanto, estes valores podem ser considerados baixos quando comparados a trabalhos realizados em áreas de caatinga por Oliveira et al.(2010) e Cartaxo et al.(2010) que possuem valores de consenso que chegam a 1, o valor máximo que uma categoria pode obter. A categoria afecções e dores não definidas agruparam sete espécies (11,86%) e 23 usos relatados, servindo para sanar todos os problemas de saúde que não tem causa definida. Sobressaíramse nesta categoria, a Caryocar coriaceum com sete citações indicadas para inflamações em geral, febre e dor no corpo, e O Croton heliotropiifolius e A Roupala Montana, ambas com cinco citações. Em um levantamento etnobotânico realizado no Ceará em área carrasco, este sistema recebeu 61 indicações de uso e 43 espécies foram relatadas, entre elas o C. coriaceum também foi citado para inflamações em geral (Souza et al., 2014). E em Itacaré, BA, a doença mais citada dentro desta categoria foi febre com 40% das citações (Pinto et al., 2006). Com 28 citações, a categoria transtorno do sistema respiratório (TSR) abrangeu nove espécies, dentre elas Centrosema sp., Hymenaea courbaril, Astronium fraxinifolium e Hybanthus ipecacuanha foram as mais citadas para gripe, crise de garganta, bronquite e tosse, administradas através da infusão de suas raízes e cascas ou como lambedor. Nos trabalhos de Silva & Proença (2008) e Moreira & Guarim Neto (2009), este sistema também aparece com frequência entre os valores de maiores consensos. É comum em áreas de cerrado o uso de um amplo repertório de plantas empregadas para tal finalidade, já que parece ser uma resposta aos longos períodos de estiagem, à baixa umidade relativa do ar e às queimadas no cerrado, os quais favorecem o aparecimento de doenças relativas ao aparelho respiratório. Lesões, envenenamento e outras Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

99 TABELA 2. Fator de Consenso do Informante (FCI) e sistemas corporais mediante indicações de uso das espécies medicinais pelos informantes da comunidade Barreiro Grande no município de Crato, Ceará, Brasil. Categorias ADND: Inflamações em geral, dores em geral, febre. TSR: Tosse, gripe, garganta inflamada, pneumonia, bronquite. LEOCCE: Ferimento, cicatrizante, machucado, torção. TSD: Gastrite, dor no estomago, úlcera, dor na barriga, dor de dente, problemas estomacais. N de usos reportados N e espécies de plantas FCI Piqui, barbatimão, ameixa, Bom-nome, congonha, pau d óleo, velame branco Piqui, alcançu, ameixa, jatobá, papaconha, Gonçalo-alves, sucupira, pau pra tudo, manguirioba 23 8-Barbatimão, ameixa, Bom-nome, aroeira, pau d óleo, jurema preta, jenipapo brabo, velame branco 20 7-Mangaba, janaguba, barbatimão, congonha, papaconha, jurema preta, velame branco N: Câncer 4 2- Janaguba, murta 0,66 TSC: Inchaço, pressão alta, males do coração, trombose. DSOTC: Hérnia, reumatismo, artrose Piqui, faveira, araçá de veado, mangaba, maracujá do mato, manguirioba 9 7- Mangaba, catuaba de rama, caninana, pau d óleo, velame branco, pau pra tudo, sucupira TSN: Nervos, dor de cabeça Catuaba de rama, louro cheiroso, laranjinha, maracujá do mato, manguirioba, amescla TSG: Inflamação no útero, cólica menstrual, rins. 7 4-Bom-nome, aroeira, sucupira, quebrapedra DPTCS: inflamação na pele 3 1- Piqui 0 DGENM: Colesterol 2 1- Mangaba 0 Legenda TSD: Transtornos do sistema digestório; DGENM: Doenças das glândulas endócrinas, da nutrição e do metabolismo; TSG: Transtornos do sistema genitourinário; TSR: Transtornos do sistema respiratório; ADND: Afecções ou dores não definidas; TSN: Transtornos do sistema nervoso; DSOTC: Doenças do sistema osteomuscular e tecido conjuntivo; N: Neoplasias; LEOCCE: Lesões, envenenamentos e outras conseqüências de causas externas; TSC: Transtornos do sistema circulatório; DPTCS: Doenças de pele e tecido celular subcutâneo; IS: Impotência sexual 0,72 0,70 0,68 0,68 0,33 0,25 0,01 0, consequências de causas externas (LEOCCE) agruparam oito espécies relacionadas a 23 citações de uso, indicadas para ferimentos, cicatrizante, machucados e torção. A Stryphnodendron rotundifolium, a Ximenia americana, amaytenus rígida e a Myracrodruon urundeuva foram as mais citadas para a finalidade cicatrizante, com a manipulação da casca do caule para infusão, decocção e banho. No estudo de Cartaxo et al. (2010). Resultados análogos foram encontrados, pois das 27 espécies citadas para cicatrização, X. americana e M. urundeuva receberam 24 citações cada e foram as espécies com maior concordância de uso para tal finalidade. As enfermidades mais frequentes inerentes a transtornos do sistema digestivo (TSD) foram relacionadas aos distúrbios gastrintestinais e dentes, com 20 usos relatados, e sete espécies. A doença mais citada dentro desta categoria foi gastrite, com maiores indicações para as espécies Hancornia speciosa e Himatanthus drasticus. A manipulação de ambas as espécies se dá através da ingestão do látex dissolvido em água. No Maranhão outra espécie do gênero Himatanthus também assume relativa importância no tratamento de doenças gastrintestinais, onde o látex é ingerido ao natural (Monteles & Pinheiiro 2007). Doenças relacionadas ao aparelho digestivo também se destacam em outros trabalhos (Gazzaneo et al., 2005; Medeiros et al., 2004; Pilla et al., 2006). Para a categoria de neoplasias (N) o câncer é a enfermidade que acomete este sistema, com quatro citações, relacionada a duas espécies, Himatanthus drasticus, com a ingestão do látex dissolvido em água, e o Erytroxylum sp., pela decocção de suas folhas. Esta categoria também Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

100 728 foi citada em uma área de carrasco no Ceará, no entanto, não houve concordância de uso entre os informantes (Souza et al., 2014). Já no estudo de Pinto et al. (2006), na Mata Atlântica, o câncer foi a doença mais citada dentro desta categoria. Foram agrupadas para transtornos do sistema circulatório (TSC) seis espécies e 10 citações de usos. As espécies Caryocar coriaceum, Dimorphandra gardneriana e Passiflora cincinnata foram indicadas para inchaço, pressão alta e coração. Em Minas Gerais, esta categoria estava entre as mais citadas, no entanto, a afecção mais freqüente dentro deste sistema foi para depurativo do sangue (Botrel et al., 2006). Doenças do sistema osteomuscular e tecido conjuntivo (DSOTC) receberam nove indicações para sete espécies. Destas, cinco foram indicadas para reumatismo: Ditassa sp., Bowdichia virgiloides, Copaifera langsdorffi, Croton heliotropiifolius e Secondatia floribunda. Não houve consenso entre os informantes em área de caatinga para esta categoria (Cartaxo et al., 2010). Para transtornos do sistema nervoso (TSN) e transtornos do sistema geniturinário (TSG), os valores de FCI foram baixos com 0,8 e 0,5, respectivamente, o que significa que o número de citações foram quase iguais ao número de espécies indicadas, dentre estas Secondatia floribunda, Maytenus rigida, Senna occidentalis. Três categorias apresentaram consenso de informantes igual a zero: doenças de pele e tecido celular subcutâneo (DPTCS), impotência sexual (IS) e doenças das glândulas endócrinas, da nutrição e do metabolismo (DGENM), significando que não houve concordância quanto ao uso de nenhuma espécie na localidade, devido a categoria apresentar uma única indicação de uso referente à espécie indicada. Diante desses resultados, fica evidente que muitas espécies destacam-se em algumas categorias pelas suas aplicabilidades terapêuticas, obtendo maior fator de consenso entre os informantes. Pode se observar que as espécies mais procuradas são aquelas que a população acredita possuir ação antiinflamatórias, como a espécie Caryocar coriaceum, expectorante, como as espécies Centrosema sp, Hymenaea courbaril, Astronium fraxinifolium e Hybanthus ipecacuanha, e até mesmo atividade anticancerígena, como a Himatanthus drasticus. AGRADECIMENTOS Os autores gostariam de agradecer aos moradores da comunidade de Barreiro Grande pelo acolhimento e receptividade e à FUNCAP pelo auxílio financeiro. REFERÊNCIAS AGRA, M.F.; SILVA, N.K.; BASÍLIO, I.J.L.D.; FREITAS, P.F.; BARBOSA-FILHO, J.M. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.18, n. 3, p , ALBUQUERQUE,U.P..; ANDRADE,L.H.C. Uso de recursos vegetais da caatinga: o caso do agreste do estado de Pernambuco (nordeste do Brasil). Interciencia, v. 27, p , ALBUQUERQUE, U.P.; LUCENA, R.F.P. Métodos e técnicas para a coleta de dados. In: ALBUQUERQUE, U.P.; LUCENA, R.F.P. Métodos e técnicas na pesquisa etnobotânica. Recife: Editora LivroRápido/ Nupeea, p , ALBUQUERQUE, U.P.; LUCENA, R.F.P.; MONTEIRO, J.M; FLORENTINO, A.T.N.; ALMEIDA, C.F.C.B.R. Evaluating Two Quantitative Ethnobotanical Techniques. Ethnobotany Research & Applications, v. 4, p , ALMEIDA, C.F.C.B.R..; ALBUQUERQUE, U.P. Uso e conservação de plantas e animais medicinais no estado de Pernambuco (Nordeste do Brasil): um estudo de caso. Interciência, v.26, p , ALMEIDA, C.F.C.B.R.; SILVA,T.C.L.; AMORIM, E.L.C.; MAIA, M.B.S.; ALBUQUERQUE, U. P. Life strategy and chemical composition as predictors of the selection of medicinal plants from the caatinga (Northeast Brazil). Journal of Arid Environments, v. 62, p , ALVES, E.O; MOTA, J.H..; SOARES, T.S; VIEIRA, M.C.; SILVA, C.B. Levantamento etnobotânico e caracterização de plantas medicinais em fragmentos florestais de Dourados-MS. Ciências agrotecnica, Lavras, v. 32, p , ALVES, G.S.P.; POVH, J. A. Estudo etnobotânico de plantas medicinais na comunidade de Santa Rita, Ituiutaba MG. Biotemas, v. 26 (3), p , AMOROZO, M.C.M. Uso e diversidade de plantas medicinais em Santo Antonio do Leverger, MT, Brasil. Acta Botanica Brasilica.v. 16, n. 2, p , ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean Society, [S.l.], v. 141, p , BALCAZAR, A.L. Hipótese da aparência na dinâmica do uso de plantas medicinais na Floresta Nacional do Araripe (Ceará, nordeste do Brasil) p. Dissertação (Mestrado em Botânica) Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. BARROS, W.M.; RAO, V.S.N.; SILVA, R. M.; LIMA, J. C.S.; MARTINS, D. T.O. Anti-inflammatory effect of the ethanolic extract from Bowdichia virgilioides H.B.K stem bark. Biological Sciences. Anais Academia Brasileira de Ciências. vol. 82 n 3, Rio de Janeiro BENNETT, B.C.; PRANCE, G.T. Introduced plants in the indigenous pharmacopoeia of Northern South America. Economic Botany, v.54, n.1, p BOTREL, R.T.; RODRIGUES L.A.; GOMES L. J.; CARVALHO, D. A.; FONTES M.A.L. Uso da vegetação nativa pela população local no município de Ingaí, MG, Brasil. Acta botanica brasilica. v. 20, n. 1, p , Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

101 729 BRASIL. Resolução nº 196/96 sobre pesquisa envolvendo seres humanos. Bioética, v. 4, n. 2, p , BRUNETON, J. Farmacognosia. 2.ed. Zaragosa: Acribia.1099p, CABALLERO, J. La Etnobotânica. In: A. Barrera (ed.) La Etnobotânica: três puntos de vista y uma perspectiva. Xalapa, INIREB. Pp CAMARGO, M.T.L. A medicina popular. Rio de Janeiro: Campanha de Defesa do Folclore Brasileiro, 46p, CARTAXO, S.L.; SOUZA, M.M.A.; ALBUQUERQUE, U.P. Medicinal plants with bioprospecting potential used in semi-arid northeastern Brazil. Journal of Ethnopharmacology. v.131, p , CAVALCANTI, F.S. Estudo agronômico exploratório do candeeiro (Vanillosmopsis arborea Baker) p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará. Fortaleza. COLARES, A.V.; CORDEIRO, L.N.; COSTA, J.G.M..; CARDOSO, A.H.; CAMPOS, A.R. Efeito gastroprotetor do latex de Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel (Janaguba). INFARMA, v.20, n 11/12, COSTA, I.R.; ARAÚJO, F.S.; LIMA-VERDE, L.W. Flora e aspectos autoecológicos de um encrave de cerrado na Chapada do Araripe, Nordeste do Brasil. Acta Botanica Brasilica, v.18, n , COSTA-LOTUFO, L.V.; CUNHA, G.M.A.;FARIAS, P.A.M.; VIANA, G.S.B.; CUNHA, K.M.A.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; GRAMOSA, N.V.; RAO, V.S.N.The cytotoxic and embrytoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated from Copaifera langsdorffi óleo-resin. Toxicon.v.40, p , CUNHA, A.S.; BORTOLOTTO, M.I. Etnobotânica de plantas medicinais no assentamento Monjolinho, município de Anastácio, Mato Grosso do Sul, Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 25, n.3, p DIAS, K.S.; MARQUES, S.M.; MENEZES.C.C.I.; SANTOS, C.T.; SILVA, L.B.A.; ESTEVAM, S.C.; SANT ANA, G.E.A.; PIZZA, C.; ANTONIOLLI, R.A.; MARÇAL, M.R. Antinociceptive activity of Maytenus rigida stem bark. Fitoterapia, v.78, p.7-8, ENDRIGER, D.C.; KONDRATYUK, T.; BRAGA, F.C.; PEZZUTO, J.M. Phytochemical study of Hancornia speciosa guided by in vitro cancer chemiopreventive assays. In 47 th Annual Meeting of the American Society of Pharmacognosy, Washington. Abstract Book of the 47 th Annual Meeting of the American Society of pharmacognosy, ESTEVAM C.S.; CAVALCANTI, A.M.; CAMBUI, E.V.F.; NETO, V.A.; LEOPOLDO, P.T.G.; FERNANDES, R.P.M.; ARAUJO, B.S; PORFÍRIO, Z.; SANT ANA, A.E.G. Perfil fitoquímico e ensaio microbiológico dos extratos da entrecasca de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia. v.19, n.1b, FRANCO, E.A.P.; BARROS, R.F.M. Uso e diversidade de plantas medicinais no Quilombo Olho D água dos Pires, Esperantina, Piauí. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.8, n.3, p.78-88, GALEANO, G. Forest use at the Pacific Coast of Chocó, Colômbia: a quantitative approach. Economic Botany, v.54, p , GAZZANEO, L.R.S.R.; LUCENA, F.P.; ALBUQUERQUE, U.P. Knowledge and use of medicinal plants by local specialists in an region of Atlantic Forest in the state of Pernambuco (Northeastern Brazil). Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, v.1, p.1-9, GOMES, E.C.S.; B.J..; VILAR, F.C.R.; PEREZ, J.O.; VILAR, C.R.; FREIRE, J. L. O.; LIMA, A.N.; DIAS, T.J. Plantas da caatinga de uso terapêutico: Levantamento etnobotânico. Engenharia Ambiental. v.5, n2. p , GUARIM NETO, G.; MORAIS, R.G. Recursos medicinais de espécies do Cerrado de Mato Grosso: Um estudo Bibliografico. Acta Botanica Brasilica, v.17, n.4, p , IPECE, Perfil básico municipal. Disponível em: publicacoes/perfil_basico/ perfil- basico-municipal Acesso em: 10 Maio LARROSA, C.R.R.; DUARTE, M.R. Morfoanatomia de folhas de Himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson, Apocynaceae. Acta Farm. Bonaerense, v.24, p , LIMA, P.L.I. Etnobotanica Quantitativa de plantas do cerrado e extrativismo de mangaba (Hancornia speciosa Gomes) no Norte de Minas Gerais: Implicações para o manejo sustentável p. Dissertação de Mestrado aprovada junto ao programa de pós-graduação em Ecologia da Universidade de Brasilia. LUCETTI, D.L.; LUCETTI, E.C.P.; BANDEIRA, M.A.M.; VERAS, H.N.H.; SILVA, A.H.; LEAL, L.K.A.M.; LOPES, A.A; ALVES, V.C.C.; SILVA, G.S. BRITO, G.A.; VIANA, G.B. Anti-inflammatory effects and possible mechanism of action of lupeol acetate isolated from Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel. Journal of Inflammation v.17;7:60. doi: / , MACEDO, D.G.; RIBEIRO, D.A.; COUTINHO, H.D.M., MENEZES, I.R.A.; SOUZA, M.M.A. Práticas terapêuticas tradicionais:uso e conhecimento de plantas do cerrado no estado de Pernambuco (Nordeste do Brasil). Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas, v.14, p , MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; ARRUDA, A.C. Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology: a successful combination in the study of Croton cajucara. Journal of Ethnopharmacy, v.70, p MARTINS, E.R.; CASTRO, D.M.; CASTELLANI, D.C.; DIAS, J.E. Plantas medicinais, Viçosa, MG: UFV, Imprensa Universitária, 220p,1995. MATOS, F.J.A. Plantas da medicina popular do Nordeste. Fortaleza: EUFC, 80p MATOS, F.J.A. Farmácias vivas. 4. ed. rev. Fortaleza, UFC/SEBRAE MATOS, F.J.A. Plantas medicinais: guia de seleção e emprego de plantas usadas em fitoterapia no Nordeste do Brasil. Imprensa Universitária. 3ª edição, Fortaleza, Brazil, 394p MEDEIROS, M.F.T.; FONSECA, V.T.; ANDREATA, R.H.P. Plantas medicinais e seus usos pelos sitiantes da Reserva Rio das Pedras, Mangaratiba, RJ, Brasil. Acta Botanica Brasilica, v.18, n.2, p , MISSOURI BOTANICAL GARDEN (MOBOT) TROPICOS. Disponível em Acesso em 15 Novembro MONTELES, R.; PINHEIRO C.U.B. Plantas medicinais em um quilombo maranhense: uma perspectiva Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

102 730 etnobotânica. Revista de Biologia e Ciências da Terra, v.7, n. 2, p , MOREIRA, D.L.; GUARIM-NETO, G. Usos múltiplos de plantas do cerrado: um estudo etnobotânico na comunidade sitio Pindura, Rosário Oeste, Mato Grosso, Brasil. Polibotânica,v. 27, p , MOTA, C.N.; ALBUQUERQUE, U.P. As muitas fases da Jurema: De espécie botânica à divindade afroindígena. Rio de Janeiro. Recife: Edições Bagaço OLIVEIRA, F.C.S.; BARROS, R.F.M.; MOITA-NETO, J.M. Plantas medicinais utilizadas em comunidades rurais de Oeiras, semiárido piauiense. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 12, n. 3, p , OMER, M. E.F.A.; ELNIMA, E.I. Antimicrobial activity of Ximenia americana. Fitoterapia v. 74, p , ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Classificação Estatística Internacional de Doenças e problemas relacionados à Saúde, 10ª revisão, São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo, v. 1, 1197p PAGOTTO, T.C.S.; CAMILOTTI, D.C.; LONGO, J.M.; SOUZA, P.R. Bioma Cerrado e area estudada. Pp In: Pagotto, T.C.P., Souza, P.R (Eds.). Biodiversidade do Complexo Aporé-Sucuriú Subsídios à conservação e manejo do bioma Cerrado. Campo Grande, Ed.UFMS PERES, M.T.L.P.; MONACHE, F.D.; CRUZ, A.B.; PIZZOLATTI, M.G.; YUNES, R.A.; Chemical and antimicrobial activity of Croton urucurana Baillon (Euphorbiaceae). Journal of Ethnofarmacology, v. 56, p PAIVA, L.A.; GURGEL, L.A.; SILVA, R.M.; TOMÉ, A.R.; GRAMOSA, N.V.; SILVEIRA, E.R.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N. Anti-inflammatory effect of kaurenoic acid, a diterpene from Copaifera langsdorfi on acetic acidinduced colitis in rats. Vascular Pharmacology, v. 39, p , PILLA, M.A.C.; AMOROZO, M.C.; FURLAN, A. Obtenção e uso das plantas medicinais no distrito de Martim Francisco, município de Mogi-Mirim, SP, Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 20, n. 4, p , PINTO, E. P. P.; AMOROZO, C. M.; FURLAN, A. Conhecimento popular sobre plantas medicinais em comunidades rurais de mata atlântica Itacaré, BA, Brasil. Acta botânica brasílica. n. 20, v. 4, p , QUINET, C.G.P.; ANDREATA, R.H.P. Estudo taxonômico e morfológico das espécies de Apocynaceae Adans. na reserva Rio das Pedras, município de Mangaratiba, Rio de Janeiro, Brasil. São Leopoldo: Instituto Anchietano de Pesquisas, Pesquisas Botânicas, n. 56, p , RIBEIRO, D.A.; OLIVEIRA, L.G.S.; MACÊDO, D.G.; MENEZES, I.R.A.; COSTA, J.G.M.; SILVA, M.A.P.; LACERDA, S.R.; SOUZA, M.M.A. Promising medicinal plants for bioprospection in a Cerrado area of Chapada do Araripe, Northeastern, Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v.155, p , RODRIGUES, F.F.G.; CABRAL, B.S.; COUTINHO, H.D.M.; CARDOSO, A.L.H.; CAMPOS, A.R.; COSTA, J.G.M. Antiulcer and antimicrobial activities of Stryphnodendron rotundifolium Mart. Pharmacognosy Mag,v. 4, p , RODRIGUES, V.E.G.; CARVALHO, D.A. Levantamento etnobotânico de plantas medicinais no domínio do cerrado na região do Alto Rio Grande - Minas Gerais. Revista Ciência e Agrotecnologia, v. 25, p ROQUE, A.A. Potencial de usos dos recursos vegetais em uma comunidade Rural do semi-árido do Rio Grande do Norte p. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento em Meio Ambiente) Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal. SAMY, R.P.; IGNACIMUTHU, S. Antibacterial activity of some folklore medicinal plants used by tribals in Western ghats of India. Journal Ethnopharmacolog, v. 69, p , SANTOS, A.C.B. Ecofisiologia e atividade biológica de Secondatia floribunda A. DC. (Apocynaceae) p. Dissertação de Mestrado submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Strictu Sensu em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri URCA, Crato-CE. SARAIVA, M.E.; ULISSES, A.V.R.A.; RIBEIRO, D.A.; OLIVEIRA, L.G.; MACÊDO, D.G.; SOUSA, F.F.; MENEZES, I.R.; SAMPAIO, E.V.; SOUZA, M.M. Plant species as a therapeutic resource in areas of the savanna in the state of Pernambuco, Northeast, Brazil. Journal Ethnopharmacology, v.171, p , SARAIVA. R.A.; ARARUNA, M.K.A.; OLIVEIRA, R.C.; MENEZES, K.D.P.; LEITE, G.O.; KERNTOPF, M.R.; COSTA, J.G.M.; ROCHA, J.B.T.; TOMÉ, A.R.; CAMPOS, A.R.; MENEZES, I.R.A. Topical anti-inflammatory effect of Caryocar coriaceum Wittm. (Caryocaraceae) fruit pulp fixed oil on mice ear edema induced by different irritant agents. Journal of Ethnopharmacology, v. 136, p , SANTOS, V.L. Avaliação da atividade antiulcerogênica, antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais p.Tese (Doutorado Área de Concentração em Farmacologia) - Departamento de Farmácia, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB. SERRA, C.P.; CÔRTES, S.F.; LOMBARDI, J.A.; BRAGA DE OLIVEIRA, A.; BRAGA, F.C. Validation of colorimetric assay for the in vitro screening of inhibitors of angiotensin converting enzyme (ACE) from plant extracts. Phytomedicine, v.12, n. 6-7, p , SILVA, C.S.P.; PROENÇA, C.E.B. Uso e disponibilidade de recursos medicinais no município de Ouro Verde de Goiás, GO, Brasil. Acta Botanica Brasílica, v. 22, n.2, p , SILVA, M.A.B.; MELO, L.V.L.; RIBEIRO, R.V.; SOUZA, J.P.M.; LIMA, J.C.S.; MARTINS, D.T.O.; SILVA, R.M. Levantamento etnobotânico de plantas utilizadas como anti-hiperlipidêmicas e anorexígenas pela população de Nova Xavantina-MT, Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 20, n. 4, p , 2010b. SILVA, V. A.; NASCIMENTO, V. T.; SOLDATI, G. T.; MEDEIROS, M. F. T.; ALBUQUERQUE, U.P. Etnobotânica aplicada à conservação da biodiversidade. In: Métodos e técnicas na pesquisa etnobiológica e etnoecológica. (Org.) ALBUQUERQUE, U.P.; LUCENA, R.F.P.; CUNHA, L.V.F.C., NUPPEEA, 2010a. SOUZA, E.L.; GRANGEIRO, A.R.S.; BASTOS, I.V.G.A.; Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

103 731 RODRIGUES, G.C.R.; SILVA,M.J.; ANJOS, F.B.R.; SOUZA, I.A.; SOUSA, C.E.L.; Antitumor activity of leaves of Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel- Apocynaceae (Janaguba) in the treatment of Sarcoma 180 tumor. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 46, n. 2, p , SOUZA, L.F. Recursos vegetais usados na medicina tradicional do Cerrado (comunidade de Baús, Acorizal, MT, Brasil). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 9(4), p SOUZA, R.K.D.; SILVA, M.A.P.; MENEZES, A.R.I.; RIBEIRO, A.D.; BEZERRA, R.L.; SOUZA, M.M.A. Ethnopharmacology of medicinal plants of carrasco, northeastern Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 157, p , TORRANCE, S. J.; WIEDHOPF, R. M.; COLE, J. R. Antitumor agents from Jatropha macrorhiza (Euphorbiaceae). Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 66, p , TROTER, R.; LOGAN, M. Informant consensus: a new approach for identifying potentially effective medicinal plants. In: Etkin, N. L. (Ed.) Indigenous medicine and diet: biobehavioural approaches. New York: Redgrave Bedford Hills, p , TUNHOLI, P.V. Etnobotânica e fitossociologia da comunidade Arborea e Efeito de Fogo em Eugenia dysenterica DC. na Reserva Legal de um Assentamento de Reforma agrária no Cerrado. 2011, 118p. Dissertação (apresentada junto a programa de Pós-graduação em Ecologia da Universidade de Brasilia). Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

104 732 Extrato de Mikania glomerata Sprengel inibe herpes simplex vírus tipo-1 (HSV-1) e tipo-2 (HSV-2) in vitro SILVA, M.E. 1 ; VILELA, F.M.P. 1* ; MIRANDA, M.A. 2 ; HÚNGARO, H.M., FERREIRA, F.M. 1, YAMAMOTO, C.H. 1, CAVALCANTI, J.F. 3, ROMANOS, M.T.V. 3, AMARAL, M.P.H. 1 1 Faculty of Pharmacy, Federal University of Juiz de Fora, Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil. 2 Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. 3Department of Virology, Institute of Microbiology, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. *Autor para correspondência: fernanda.vilela@ufjf.edu.br RESUMO: As infecções causadas pelo vírus herpes simplex caracterizam-se por feridas (HSV- 1) e lesões genitais (HSV-2) e são considerados uma das principais infecções no mundo que afetam a saúde pública. A Mikania glomerata Sprengel, popularmente conhecida como guaco, pertence à família Asteraceae e é rica em cumarinas. Além disso, esta planta é amplamente utilizada na medicina popular brasileira. Este estudo objetivou avaliar o efeito antiviral do extrato de M. glomerata contra o HSV-1 e HSV-2. As atividades do extrato seco e da cumarina isolada 1,2- benzopirona foram determinadas pela redução dos títulos virais do HSV-1 e HSV-2 e os resultados foram expressos pela porcentagem de inibição (PI). Os resultados mostraram que o extrato seco de guaco apresentou atividade inibitória contra os vírus HSV- 1 e HSV-2. Entretanto, o extrato foi mais ativo contra o HSV-2 (PI= 92,7% a 31,2 µg/ml) do que contra o HSV-1 (PI=87,7% a 15,6 e 31,2 µg/ml). A cumarina isolada 1,2-benzopirona não demonstrou atividade antiviral contra o HSV-2 (PI= 0%), sendo ativa somente contra o HSV-1 (PI=68.4% em 31, 2 µg/ml). O extrato foi mais potente do que a cumarina isolada, o que pode ser atribuído à presença de outros compostos que podem agir em sinergia. Apesar deste estudo estar em estágio inicial, as observações são interessantes e fornecem um suporte importante para estudos posteriores relacionados com o desenvolvimento de novos agentes anti-hsv. Além disso, este estudo ressalta o potencial antiviral inovador da M. glomerata. Palavras-chave: Mikania glomerata, extrato, cumarina, herpesvírus, antiviral ABSTRACT: Mikania glomerata extract inhibits herpes simplex virus type-1 (HSV-1) and type-2 (HSV-2). Herpes simplex virus infections are characterized by the cold sores (HSV-1) and genital lesions (HSV-2) and are considered one of the major infections in the world affecting the public health. Mikania glomerata Sprengel, popularly known as guaco, belongs to Asteraceae family and it is rich in coumarins. Also, this plant is widely used in Brazilian folk medicine. This study was designed to evaluate the antiviral effect of M. glomerata extract against the HSV-1 and HSV-2. The dried hydroalcoholic extract and the isolated coumarin 2H-1-benzopyran-2- one activities were determined by reduction of the HSV-1 and HSV-2 titres, and the results were expressed by percentage of inhibition (PI). Our results demonstrated that the extract has shown activity against both HSV-1 and HSV-2. However, the extract was more active against HSV-2 (PI = 92.7% at 31.2 µg/ml) than HSV-1 (PI = 87.7% at 15.6 and 31.2 µg/ml). The isolated coumarin, 2H-1-benzopyran-2-one did not exhibit antiviral activity for HSV-2 (PI = 0%), being active only against HSV-1 (PI = 68.4% at 31.2 µg/ml).the extract was more potent than the isolated coumarin which might be due to the presence of other compounds that could act in synergy. This is a preliminary study but our observations are interesting and provide important support for further studies toward the development of novel anti-hsv agents. In addition, this study highlighted the innovative antiviral potential of M. glomerata. Keywords: Mikania glomerata, extract, coumarin, herpesvirus, antiviral. Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/ / X/0154 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

105 733 INTRODUCTION Herpes simplex viruses (HSV) belongs to the Herpesviridae family of viruses, and the infection with the HSV, commonly known as herpes, can be due to either herpes simplex virus 1 (HSV-1) or herpes simplex virus 2 (HSV-2). Both HSV-1 and HSV-2 are highly infectious (Clemens & Farhat, 2010; WHO, 2015). HSV infections are among the most common diseases of humans. Primary infection leads to a persistent (latent) infection in sensory ganglia from which the virus can reactivate to cause symptomatic or asymptomatic recurrent infection (Brady & Bernstein, 2004). Typically, HSV-1 is transmitted by oralto-oral contact in childhood and adolescence. The symptoms of the viral infections are characterized by the appearance of small yellowish vesicles in the face, which are usually grouped and which break quickly, forming ulcers that may coalesce (Mertz et al., 2003). The disease caused by HSV-2 is commonly associated with the initiation of sexual activity and is responsible for genital lesions in adolescents and sexually active adults (Schomogyi et al., 1998). The main drugs used in the herpes simplex systemic treatment are acyclovir, valacyclovir, penciclovir, famciclovir, ganciclovir, foscarnet and cidofovir, reserved for immunocompromised patients with severe manifestations of herpes simplex. Regarding topical drugs, acyclovir, penciclovir and docosanol therapies have been approved, but the development of viral resistance towards these drugs have been recorded (Tagliari et al., 2012). Therefore, there is a need for new antiviral therapies with different mechanisms of action and low cost, which draws attention to the research of natural substances from plants which are already being used in folk pharmacotherapy for the treatment of infections (Astani et al., 2014). A large number of compounds from medicinal plant extracts, such as phenolics, polyphenols, terpenes, flavonoids, have been found to be promising anti-herpetic agents (Khan et al., 2005). Therefore, natural compounds from medicinal plants can be considered a good source of effective new antiviral agents (Kitazato et al., 2007). The Mikania genus, Asteraceae family, has been shown to have a great therapeutic potential. Mikania glomerata Sprengel, popularly known as guaco, is a plant rich in coumarins which is widely used in the Brazilian folk medicine in the treatment of coughs due to its bronchodilator and expectorant properties (Napimoga & Yatsuda, 2010). In addition to its traditional use, M. glomerata is also shown to have potential antiviral properties on suid (SuHV-1) and bovine (BoHV-1) herpes viruses (Kazyiama et al., 2012). Coumarin 2H-1-benzopyran-2-one is one of the major chemical constituents of M. glomerata which is present in large quantities in the leaves (Bolina et al., 2009; Celeghini et al., 2001). It has been previously reported that, 2H-1-benzopyran- 2-one is pharmacologically active compound responsible for the bronchodilator, anticonvulsant, and antitumor activities of M. glomerata (Nora et al., 2010; Santana et al., 2014; Wand & Liu, 2009). In addition, some studies have reported the antiviral activity of coumarins 2H-1-benzopyran-2-one (Kostova et al., 2006; Venugopala et al., 2013). Facing the necessity for new drugs with low cost, low toxicity and increased efficacy for the treatment of herpes, this study was designed to evaluate the antiviral effect of M. glomerata extract and 2H-1-benzopyran-2-one against the HSV-1 and HSV-2. To our knowledge, this is the first study that describes the antiviral effect of M. glomerata ethanolic extract against human herpesvirus. MATERIAL AND METHODS Plant material M. glomerata Sprengel leaves were collected from the Medical Garden of the Faculty of Pharmacy of the Federal University of Juiz de Fora (UFJF). The leaves were selected and dried in an oven with air circulation under controlled temperature of 35 C for 48 h. A voucher specimen was deposited in the Herbarium Leopoldo Krieger of the UFJF under number M. glomerata extract The hydroalcoholic extract of M. glomerata was prepared by maceration and percolation, according to the Brazilian Pharmacopeia 1 st edition (Brazilian Pharmacopeia Comission, 1926). Briefly, the dried leaves were crushed in a ring type hammer mill at 3,000 rpm and passed through the 20-mesh sieve. Ethanol/water 70:30 v/v was used as solvent and the mass/volume ration was of 1:1. The preparation of dried extract was achieved by lyophilization adding 5% of colloidal silicon dioxide as excipient (Silva et al., 2012). For further analysis, the extract concentration was adjusted by the addition of 5% of adjuvant. Coumarin analysis The quantification of coumarin was performed by UV-spectrophotometry and HPLC- UV/DAD analysis. The coumarin in the extract was determined spectrophotometrically at 275 nm using a standard coumarin 2H-1-benzopyran-2-one compound (Silva et al., 2012). Chromatographic analyses were performed on HPLC-DAD (Shimadzu) with software Class-VP Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

106 734 version 5.02 using the Zorbax SB-C18 ( mm; Agilent) column. The sample analyses were carried out by employing an isocratic elution system using a mobile phase composed of acetonitrile and water in a ratio of 40:60 (v/v) at a flow rate of 1 ml/min and 25 ºC. A 20 μl aliquot of each sample was injected and a run time of analysis of 15 min with detection at 274 nm (Celeghini et al., 2001; Silva et al., 2012). The quantification of 2H-1-benzopyran-2-one in the extract was evaluated using standard curve. The standard curve consisted of five points and the obtained equation was y = 86375x The correlation coefficient (r 2 ) was The extract was diluted in order to have a peak area value on the range of the standard curve. Samples were prepared in triplicate. Viruses and cell culture Human herpes simplex virus type 1 (HSV- 1) and type 2 (HSV-2) were obtained from the Virology Department of the Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), Brazil. Viruses were typed by detected by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers for identification (Markoulatos et al., 2001). Vero cells (African green monkey kidney cells), obtained from Rio de Janeiro Cell Bank, Brazil, were grown in Eagle s minimum essential medium (EMEM) (Cultilab) supplemented with 0.03 mg/ml L-glutamine (Sigma), 50 μg/ml garamicin, 2.5 μg/ml fungizon (Gibco), 0.25 mm of sodium bicarbonate solution (Merck), and 10 mm of HEPES (Sigma) plus 10% of heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) (Cultilab). Cells were maintained at 37 o C in an atmosphere of 5% of CO 2 (Garret et al., 2012). Acyclovir (Sigma Chemical 212 Company, USA) was used as positive control. Cytotoxicity assay The cytotoxicity assay was carried out to evaluate the toxicity of the extract and the standard coumarin in Vero cells. These results were then used to determine the safe concentrations which were subsequently used in the antiviral assay. 2H-1-benzopyran-2-one was used as standard since the pharmacological effects of Mikania genus are attributed mainly to the presence of this coumarin and derivatives. The extract and the 2H-1-benzopyran-2-one were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and diluted using EMEM to obtain a final concentration of 500 µg/ml. The final concentration of DMSO was not more than 1.0% after dilution of samples in media. The solutions were freshly prepared, sterilized by a Millipore membrane filter (0.22 μm) and maintained at room temperature until use. The cells were seeded at a density of 1 x 10 4 cells/well of a 96-well microplate. After 24 h of seeding, extract and 2H-1-benzopyran-2-one (500.0 to 7.8 µg/ml) were added to the cell monolayers in triplicate and treated for 48h at 37 o C. Morphological alterations of the treated cells were observed in an inverted optical microscope (Leitz-Germany ) and the maximum non-toxic concentrations (MNTC) were determined considering both morphological changes and Vero cells viability (Walker et al., 1971; De Clercq et al., 1980). Morphological changes in Vero cells were visually assessed under the optical light microscope and then quantified spectrophotometrically by neutral red in the same plate (Borenfreund & Puerner, 1985). The highest concentration of the extract showing no cellular morphologic changes and cell viability of at least 80% were considered as MNTC. Concentrations below MNTC were employed for antiviral assay. The 50% cytotoxic concentration (CC 50 ) was defined as the concentration required to reduce the viable cell number by 50% compared to that for the untreated controls. The CC 50 was determined by nonlinear regression analysis using GraphPad Prism (version 6.01 for Windows) (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Antiviral activity assay The antiviral activity of M. glomerata extract and 2H-1-benzopyran-2-one were evaluated by reduction of the virus titers, using TCID 50 (50% tissue culture infective dose) determinations. The virus titers were calculated using the Reed & Muench (1938) statistical method and expressed as TCID 50 per ml. Infectious titers of viruses were 10 5 TCID50/ ml for HSV-1 and HSV-2, respectively. Vero cell monolayers were treated with the extract, and 2H-1-benzopyran-2-one at the MNTC. Acyclovir at the MNTC 200 µg/ml was used as a positive control compound. One hundred µl of a 100 TCID 50 /ml of HSV-1 and HSV-2 suspensions were added to treated and untreated cell cultures at a multiplicity of infection of approximately 1.0 PFU per cell. Cells were incubated in a 5% CO 2 atmosphere for 48 h at 37 o C. Following incubation, cells were collected and lysated by freeze-thaw cycles. The supernatant was collected and virus titres in treated and untreated cells were determined. The experiment was performed in triplicate (Garret et al., 2012; Soares et al., 2012). The antiviral activity was expressed as percentage inhibition (PI) using antilogarithmic TCID 50 values as follows: PI = [1-(antilogarithmic test value/ antilogarithmic control value)] x100 (Nishimura et al., 1977). The dose-response was established starting from the MNTC. The cytopathic effects or morphologic changes in cells induced by human herpes viruses include ballooning of infected cells, small syncytia, and formation of multinucleated giant cells (Motamedifar & Noorafshan, 2008). Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

107 735 RESULTS AND DISCUSSION The dried extract obtained by lyophilization was a pale beige colored fine powder. The addition of 5% colloidal silicon dioxide before the lyophilization process was found to be a suitable method for reducing hygroscopicity and the caramelization effect. Spectrophotometric analysis demonstrated the presence of coumarin in the M. glomerata extract at a concentration of 68.6 ± 1.77 mg/g dried extract. HPLC analysis showed the presence of 2H-1-benzopyran-2-one at a concentration of 24.6 ± 0.15 mg/g of dried extract. These results showed that there were some discrepancies in the spectrophotometric analysis that can be explained by the absorbance from other constituents present in the hydroalcoholic extract. Accordingly, the values obtained in the HPLC analysis were considered for further assays. Figure 1 shows the HPLC profile of the 2H-1-benzopyran-2-one, and the lyophylized extract of M. glomerata. The coumarin 2H-1-benzopyran-2- one eluted with a retention time of 7 min. Cytotoxicity The extract and 2H-1-benzopyran-2-one ( µg/ml) were added to the cell culture to examine the changes in the cellular morphology, and the viability of Vero cells. These evaluations allowed the determination of the maximum nontoxic concentration (MNTC) and 50% cytotoxic concentration (CC 50 ). Based on the results from the cytotoxicity assay, concentrations below 31.2 µg/ml of both the dried extract of M. glomerata and 2H-1-benzopyran- 2-one resulted in no changes in cell morphology. Regarding cell viability, M. glomerata extract and coumarin showed CC 50 of ± 1.56 µg/ml, and ± 1.54 µg/ml, respectively (Figure 2). Acyclovir showed CC 50 value greater than 250 µg/ml. Antiviral activity The in vitro antiviral effect of the extract and 2H-1-benzopyran-2-one was determined against HSV-1 and HSV-2 through the evaluation of the respective percentage of inhibition (PI). The extract and the coumarin were subjected FIGURE 1. HPLC analysis of the 2H-1-benzopyran-2-one (A), and M. glomerata extract (B). Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

108 736 FIGURE 2. Cytotoxic effect of M. glomerata extract and 2H-1-benzopyran-2-one coumarin on Vero cells. Values are means ± SD of four independent experiments. *: P<0.05 treatments comparison as determined by two-way ANOVA followed by Bonferroni post test. to serial dilutions, starting at a concentration which led to at least 80% of viable cells. Four concentrations were tested: 31.2; 15.6; 7.8 and 3.9 µg/ml. Acyclovir at 200 µg/ml was used as the positive control compound. The extract showed activity against both HSV-1 and HSV-2, but did not show any dose response relationship. It was more potent against HSV-2 (PI = 92.7% at 31.2 µg/ml) than HSV-1 (PI = 87.7% at 15.6 and 31.2 µg/ml). The isolated coumarin 2H-1-benzopyran-2-one did not exhibit antiviral activity for HSV-2 (PI = 0%), being active only against HSV-1 at 31.2 µg/ml (PI = 68.4%). Overall, M. glomerata extract showed a higher activity against HSV-1 and HSV-2 compared with 2H-1-benzopyran-2-one, which suggests the presence of other constituents in the extract, which might act in synergy, contributing to the activity of this extract. Acyclovir showed 99.9% of inhibition for both HSV-1 and HSV-2. Previous studies using M. glomerata ethanolic extracts have mainly identified the presence of coumarin, o-coumaric acid, kaurenoic acid, benzoyl and cinnamoylgrandifloric acids (Bertolucci et al., 2008; Gasparetto et al., 2013; Santana et al., 2014). Moreover, it is interesting to consider the anti-inflammatory and antimicrobial activities previously reported for M. glomerata which would also act against secondary infectious processes at the site of injuries induced by herpesvirus (Napimoga & Yatsuda, 2010). M. glomerata is cited in the Normative Instruction # 2 of the Brazilian National Health Surveillance Agency (ANVISA), which publishes the List of Phytotherapeutic Drugs of Simplified Registration and List of Traditional Phytotherapic Products of Simplified Registration (ANVISA, 2014). According to this list, the herbal medicines obtained from the species described therein (n = 71) do not require safety and efficacy validation since their therapeutic and safe use are widely reported in several databases including COCHRANE, PUBMED, BVS-Medline, BVS-Lilacs, and Coordination of Improvement of Higher Education Personnel (CAPES). Although the current study is at its primary stage, the observations are interesting and provide important support for further studies toward the development of novel anti-hsv agents. The current study also highlights the innovative antiviral potential of M. glomerata as it is the first report showing its activity against HSV-1 and HSV-2. ACKNOWLEDGMENTS The authors are grateful to Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brazil) for financial support and a research fellowship. CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest. REFERENCES ANVISA. Publishes List of Phytotherapeutic Drugs of Simplified Registration and List of Traditional Phytotherapic Products of Simplified Registration. Normative Ruling # 2, May 13, Disponível em: int0002_13_05_2014.pdf. Acesso em: 15 fev ASTANI, A. et al. Attachment and penetration of acyclovir resistant herpes simplex virus are inhibited by Melissa Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

109 737 officinalis extract. Phytotherapy Research, v.28, p , BERTOLUCCI S.K. et al. Development and validation of an RP-HPLC method for quantification of cinnamic acid derivatives and kauranetype diterpenes in Mikania laevigata and Mikania glomerata. Planta Medica, v.75, p , BOLINA, R.C. et al. Comparative study of the chemical composition of the species Mikania glomerata Sprengel and Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.19, p , BORENFREUND, E., PUERNER, J.A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters, v.24, p , BRADY, R.C., BERNSTEIN, D.I. Treatment of herpes simplex virus infections. Antiviral Research, v.61, p.73-81, Brazilian Pharmacopeia Comission. Brazilian Pharmacopeia, 1st ed. Companhia Editora Nacional: São Paulo, Brazil, CELEGHINI, R.M.S. et al. Extraction and quantitative HPLC analysis of coumarin in hydroalcoholic extracts of Mikania glomerata Spreng: ( guaco ) Leaves. Journal Brazilian Chemical Society, v.12, p , CLEMENS, S.A.C., FARHAT, C.K. Seroprevalence of herpes simplex 1-2 antibodies in Brazil. Revista de Saude Publica, v.44, p , DE CLERCQ, E. et al. Comparative efficacy of antiherpes drugs against different strains of herpes simplex virus. Journal of Infectious Diseases, v.141, p , GARRETT, R. et al. Antiherpetic activity of a flavonoid fraction from Ocotea notata leaves. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.22, p , GASPARETTO, J.C. et al. Chemical constituents of Mikania glomerata Spreng and Mikania laevigata Sch. Bip. ex Baker. Journal of Medicinal Plants Research, v.7, p , KITAZATO, K. et al. Viral infectious disease and natural products with antiviral activity. Drug Discovery Therapy, v.1, p.14-22, KAZIYAMA, V.M. et al. Antiviral activity of commercially available medicinal plants on suid and bovine herpesviruses. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.14, p , KHAN, T.H. et al. Extracts and molecules from medicinal plants against herpes simplex viruses. Antiviral Research, v.67, p , KOSTOVA, I. et al. Structure-activity relationships of synthetic coumarins as HIV-1 inhibitors. Bioinorganic Chemistry and Applications, 1-9, MARKOULATOS, P. et al. Laboratory diagnosis of common herpesvirus infections of the central nervous system by a multiplex PCR assay. Journal of Clinical Microbiology, v.39, p , MERTZ, G.J. et al. Is herpes simplex virus type 1 (HSV- 1) now more common than HSV-2 in first episodes of genital herpes? Journal of Sexually Transmitted Diseases v.30, p , MOTAMEDIFAR, M., NOORAFSHAN, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron, v.39, p , NAPIMOGA, M.H., YATSUDA, R. Scientific evidence for Mikania laevigata and Mikania glomerata as a pharmacological tool. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v.62, p , NISHIMURA, T. et al. Antiviral compounds. XII. Antiviral activity of aminohydrazones of alkoxyphenyl substituted carbonyl compounds against influenza virus in eggs and mice. Kitasato Archives of Exploratory Medicine, v.50, p.39-46, NORA, G.D. et al. Antiproliferative and genotoxic effects of Mikania glomerata (Asteraceae). Biocell, v.34, p , REED, L.J., MUENCH, H.A. Simple method of estimating fifty percents endpoints. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.27, p , SANTANA, L.C.L.R., et al. Mikania glomerata: Phytochemical, Pharmacological, and Neurochemical Study. Evidenced-Based Complementary and Alternative Medicine, p.1-11, SCHOMOGYI, M. et al. Herpes simplex virus-2 infections: an emerging disease? Infectious Disease Clinics of North America, v.12, p.47-61, SILVA, L.S. et al. Preparation of dry extract of Mikania glomerata Sprengel (Guaco) and determination of its coumarin levels by spectrophotometry and HPLC-UV. Molecules, v.17, p , SOARES, A.R. et al. Antiviral activity of extracts from Brazilian seaweeds against herpes simplex virus. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.22, p , TAGLIARI, N.A.B. Therapeutic aspects of infections caused by Herpes Simplex Virus Type-1. Perspectives, v.36, p , VENUGOPALA, K.N. et al. Review on natural coumarin lead compounds for their pharmacological activity. BioMed Research International, p.1-14, WALKER, W.E. et al. A method for determining sensitivities of antiviral drugs in vitro for possible use as clinical consultation. American Journal of Clinical Pathology, v.56, p , WAND, L.H., LIU, H.H. Electrochemical reduction of coumarins at a film-modified electrode and determination of their levels in essential oils and traditional chinese herbal medicines. Molecules, v.14, p , WHO. Herpes simplex virus. Fact sheet # 400, Disponível em: factsheets/fs400/en/. Acesso em: 15 fev Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

110 738 Identificação de potencialidades no uso de plantas medicinais em assentamentos rurais do litoral norte alagoano CRISTO, C.C.N. 1 ; VALENTE, E.C.N. 1 ; LIMA, A.S.T. 1* 1 Instituto Federal de Ciência e Tecnologia de Alagoas, Maragogi, AL; *Autor para correspondência: andre. sueldo@ifal.edu.br RESUMO: Há uma ampla variedade de plantas que desde os primórdios da humanidade vêm sendo utilizadas para o tratamento de enfermidades em geral. Porém, com a modernização do campo e da própria forma de fabricação de medicamentos, a rede de transmissão desse conhecimento tem sido enfraquecida. Dessa forma, a presente pesquisa visou levantar o conhecimento médico popular e suas técnicas terapêuticas e também traçar o perfil sócioeconômico das famílias entrevistadas, através de um questionário semiestruturado. Através destas entrevistas obtiveram-se resultados satisfatórios sobre as formas de uso e a fabricação de fitoterápicos, subsidiando assim, trabalhos futuros. Fica claro que resgatar os conhecimentos e as técnicas terapêuticas da fitoterapia valoriza a medicina popular, além de motivar as comunidades onde o trabalho foi feito a trocar conhecimentos, gerando inclusive, informações e discussões sobre a saúde local. Palavras-chaves: Conhecimentos Tradicionais, Enfermidades, Fitoterapia, Saúde. ABSTRACT: Identification of potential use of medicinal plants in rural settlements in the North coast of Alagoas State, Brazil. There are a wide variety of plants that since the dawn of humanity has been used for the treatment of diseases in general. However, with the modernization of the countryside and the industrialization of medicines, the network of transmission for knowledge has been weakened. Thus, the present study sought to assess the popular medical knowledge and its therapeutic techniques and also to outline the socioeconomic profile of the interviewed families, using a semi-structured questionnaire. Through these interviews, we have observed interesting results on the different uses and manufacturing of herbal medicine, that can subsidize future work. Therefore, to rescue the knowledge and therapeutic techniques and values of herbal folk medicine and to motivate communities, this work was done with knowledge exchange, including providing information and discussion on local health. Keywords: Traditional Knowledge, Disease, Herbal Medicine, Health. INTRODUÇÃO A partir do momento em que o homem começou a desvendar e utilizar da natureza uma ampla variedade de plantas têm sido usadas como medicamentos para enfermidades em geral. Com o passar do tempo, a fitoterapia vêm sendo utilizada quase que unicamente na tradição popular. Mudanças constantes no âmbito social, político e econômico, decorrentes do processo de modernização, fizeram com que a passagem dos conhecimentos sobre estas plantas sofresse alterações, reduzindo de forma considerável o uso da fitoterapia. É de extrema importância o levantamento e a manutenção dos conhecimentos populares sobre o uso e a manipulação das plantas medicinais, afinal, o Recebido para publicação em 15/03/2016 Aceito para publicação em 15/03/2017 uso destas é uma tradição histórico-cultural em todo o mundo. A fitoterapia no Brasil sobreviveu devido às raízes profundas na consciência popular que reconhece sua eficácia e legitimidade (Sacramento, 2001). Porém, é fato que o interesse acadêmico a respeito do conhecimento que estas populações detêm sobre plantas e seus usos têm crescido, após a constatação de que a base empírica desenvolvida por elas ao longo de séculos pode, em muitos casos, ter uma comprovação científica, que habilitaria a extensão destes usos à sociedade industrializada (Farnsworth, 1988). Segundo Martins (1995), as plantas medicinais, que têm avaliadas a sua eficiência terapêutica e a toxicologia ou segurança do uso, dentre outros aspectos, estão cientificamente / X/0157 Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

111 739 aprovadas a serem utilizadas pela população nas suas necessidades básicas de saúde, em função da facilidade de acesso, do baixo custo e da compatibilidade cultural com as tradições populares. Pode-se ressaltar ainda os benefícios que o conhecimento tradicional traz para as comunidades como forma de empoderamento e manutenção da comunidade local. Colaborando com a permanência nas comunidades, possível fonte de renda, troca de saberes e, no caso específico das plantas medicinais, serve, além de tudo, como alternativa de manutenção da própria saúde dos assentados. Para Fuzér & Souza (2003), a utilização de plantas medicinais para produção de medicamentos apresenta uma melhor relação custo/benefício quando comparada aos produtos sintéticos, pois sua ação biológica é eficaz com baixa toxidade e efeitos colaterais, além de apresentar um custo de produção inferior e, consequentemente, um preço de venda menor. Diante dessas constatações, é um dos deveres máximos dos profissionais da Agroecologia inovar e levantar este conhecimento que passa muitas vezes despercebido, no intuito de melhorar a vida das pessoas mediante o manejo ecologicamente adequado dos recursos naturais e a correta seleção de tecnologias, visando a sustentabilidade, estabilidade, produtividade e equidade social. O estudo de plantas medicinais, a partir de seu emprego pelas comunidades, pode fornecer informações úteis para a elaboração de estudos farmacológicos, fitoquímicos e agronômicos sobre estas plantas, com grande economia de tempo e dinheiro. Desta forma, podemos planejar a pesquisa a partir de conhecimento empírico já existente, muitas vezes consagrado pelo uso contínuo, que deverá ser testado em bases científicas segundo Brasileiro et al. (2008), tendo isto como eixo central, o objetivo deste trabalho foi o de levantar conhecimentos populares sobre o uso e manipulação de plantas medicinais. MATERIAL E MÉTODOS O levantamento foi realizado no município de São Luís do Quitunde, território do Litoral Norte alagoano. O projeto envolveu famílias agricultoras de assentamentos de reforma agrária realizado pelo Instituto Nacional de Colonização e Reforma Agrária INCRA. Nesse município existem treze projetos de assentamentos, e a escolha da área foi realizada em conjunto com o Sindicato dos Trabalhadores Rurais do município, dando preferência aos projetos de assentamento rurais mais antigos. O assentamento escolhido foi o Assentamento São Frutuoso. A pesquisa foi dividida em duas etapas. Na primeira etapa, foram realizadas entrevistas, através de um formulário, previamente elaborado. Tal instrumento é formado por questões diretas na obtenção das informações a respeito das plantas medicinais, sua manipulação e o contexto do seu uso. Aborda-se ainda, o levantamento das informações socioeconômicas das famílias para compor o perfil dos entrevistados. Na segunda etapa deste estudo, foi realizada a tabulação dos dados sobre as plantas medicinais. Foram registrados os nomes comuns, os nomes científicos, as partes das plantas utilizadas, as formas de uso, assim como a finalidade terapêutica a que se destinava. Durante o processo de pesquisa houve a colaboração do líder da comunidade na interlocução com os entrevistados, membros da comunidade e na síntese das informações em reuniões com a participação de toda a comunidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO Durante a execução dos trabalhos foi possível Identificar algumas das principais espécies de plantas medicinais utilizadas pelas comunidades rurais, destacando-se a família Labiatae (Lamiaceae) e as leguminosas. Contabilizou-se uma parte das enfermidades que são tratadas com produtos fitoterápicos, em geral são inflamações, doenças não infecciosas e dores em geral. Graças a esta boa oferta de dados foi possível originar tabelas com os resultados já confirmados, abaixo a primeira tabela confeccionada com dados das plantas de uso fitoterápico já detectadas (Tabela 1). De acordo com a Figura 1, a parte da planta mais utilizada como medicamento é a folha 44%, seguida da seiva com 13 (%) e das raízes e dos tubérculos, ambos com 9%. Esses dados estão de acordo com Pereira et al. (2005) que, ao estudar a utilização de plantas medicinais no município de Campo dos Goytacazes RJ, observou predominância da utilização de folhas, bem como a utilização de outros componentes no preparo, como mel e leite. A folha é uma das partes mais utilizadas na fabricação de fitoterápicos devido a facilidade em coletá-las e por apresentarem a maior quantidade dos princípios ativos necessários para combater a doença. Pode-se concluir, com a pesquisa realizada, que a tradição de produzir medicamentos alternativos resiste mesmo com as imposições da modernidade. O assentamento rural São Frutuoso, no município de São Luís o Quitunde AL, possui um enorme conhecimento sobre o uso e a manipulação das plantas medicinais. Essas são utilizadas pela maioria dos assentados, sendo a folha a parte mais extraída da planta e utilizada como fitoterápico na localidade. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.

112 740 TABELA 1. Informações a respeito das plantas medicinais, sua manipulação e o contexto do seu uso nos assentamentos rurais em São Luís do Quitunde - AL. Nome Popular Nome Científico Doença Sanada Parte utilizada Abacate Perseal Americana Renal Folha Abacaxi Ananas comosus L. Merril Tosse Fruto Alfazema Lavandula Officinalis Chaix e Kitt. Gastrite Folha Amescla Cheirosa Inflamação na Garganta Cera Anador Justicia pectoralis var. stenophylla Leonard. Dores de cabeça Folha Arruda Ruta graveolens L. Inflamações Folha Barbatimão Stryphnodendron barbatimam M Corte/Raladura Casca Banana Prata Musa Paradesíaca L. Gastrite Fruta Batata de Purga Operculina Macrocarpa (Linn) Urb. Secreção Pulmonar Tubérculo Cajueiro Anacardium occidentale Gripe Casca Capim Santo Cymbopogon citratus. Estresse Folha Cebola Allium caepa Gripe Tubérculo Cipó Sabão Queimadura Seiva Erva Cidreira Melissa officinalis L. Problemas Intestinais Folha Gergelim Sesamun Indicum Diabetes Seiva Hortelã Grossa Plectranthus amboinicus (Lour.) Spr. Gripe Folha Hortelã Miúdo Mentha Piperita L Vermes//Enxaqueca//Gripe Folha Jurubeba Solanum Paniculatum L. Tosse//Gripe Raiz Mangaba Hancornia Speciosa Gomes Vermes Seivas Melancia Melancia (Citrullus Lanatus) Renal Fruto Noni Morinda Citrifolia Câncer Fruto Pau-Teiú Casearia Sylvestris Swartz Inflamação Casca Pião Branco Furúnculo Semente Quebra Pedra Phyllanthus niruri L. Renal Folha Quiábo Abelmoschus esculentus Diabetes Seiva Quitoco Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera Cólicas Folha Souda Osso Ossos Quebrados Raiz Tapiá Alchornea triplinervea (Spreng.) Müll. Arg Tosse Folha FIGURA 1. Partes das plantas medicinais mais utilizadas na fabricação de medicamentos no assentamento Frutuoso, São Luís do Quitunde AL. Rev. Bras. Pl. Med., São Paulo, v.18, n.3, p , 2016.