23/10/2013. Como desenvolver novas vacinas? Patogênese microbiana -base para o desenvolvimento de uma vacina. Características de um imunógeno
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- Agustina Ribeiro Espírito Santo
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico Graduação em Biotecnologia Disciplina de Vacinologia e Engenharia de Vacinas Patogênese microbiana -base para o desenvolvimento de uma vacina Como desenvolver novas vacinas? Que conhecimento preciso ter para isso? Vacinologia experimental: Qual a resposta imune a ser induzida? Quais adjuvantes/moduladores usar? Qual a melhor estratégia para combater a infecção? Qual imunógeno? Características de um imunógeno Quero pesquisar e produzir novas vacinas! Imunógeno X antígeno X hapteno Requerimentos: Ser estranho; Alto peso molecular; Complexidade química; Degradabilidade; Proteínas Carboidratos Lipídeos Outras moléculas Que conhecimento preciso ter para isso? Compreender a patogenicidade microbiana como base para o desenvolvimento de uma vacina Vacinologia experimental: Qual a resposta imune a ser induzida? Quais adjuvantes/moduladores usar? Qual a melhor estratégia para combater a infecção? Qual imunógeno? Patógenos bacterianos utilizam uma série de moléculas para causar infecção Fatores de virulência Potenciais alvos para vacina, mas compreender a base molecular da patogenicidade é requerida para o desenvolvimento racional de vacinas Patogenicidade e Virulência Patogenicidade: Capacidade de causar doença; Virulência: Medida quantitativa da habilidade de causar doença; Patogênico refere-se às características genotípicas expressas ou não; Virulento refere-se às características fenotípicas que induzem alterações patológicas no hospedeiro; 1
2 Infecção Patogênese microbiana: Suscetibilidade do hospedeiro Mecanismos de patogenicidade a presença de microrganismo nem sempre leva à doença. Imunocomprometido/imunocompetente imunizações idade traumas predisposição genética terapia antimicrobiana Secreção de fatores (toxinas) Manipulação direta das células do hospedeiro Defesas do hospedeiro Barreiras naturais Microbiota residente afetada por dieta, antibióticos, exclusão competitiva ph inibe o crescimento Mucina glicoproteínas viscosas (barreira, armadilhas ) Portas de entrada Membranas mucosas; Trato respiratório, gastrointestinal, genito-urinário e conjuntiva; Resposta imune inata PRR - (pattern recognition receptor receptor de reconhecimento de padrão) Células: Macrófagos, PMNs, células dendríticas, cel. NK, mastócitos, basófilos, eosinófilos; Resposta imune adquirida B-cells produção de anticorpos patógenos extracelulares T- cells resposta citotóxica patógenos intracelulares Pele; Intacta = barreira; fissuras, arranhões... Parenteral; microrganismos são depositados em tecidos abaixo da pele e mucosas; Porta de entrada preferencial A patogenicidade depende de uma porta de entrada preferencial: Streptococcus pneumoniae Se inalado pode causar pneumonia; Se entrar pelo trato G.I. não causará doença; Salmonella typhi Se entra pelo trato G.I. pode causar a febre tifóide; Na pele não causa doença alguma; Número de microrganismos infectantes Importante pois são necessários microrganismos que resistam ao sistema imune do hospedeiro para estabelecer a infecção; Depende essencialmente do hospedeiro, do patógeno e da via de infecção; Fundamental para o desenvolvimento de vacinas... 2
3 Medidas de doses infectantes DL 2 vezes a DL 50 é a DL 100? 50 dose de microrganismos ou toxina que será letal para 50% dos animais experimentalmente inoculados; DI 50 dose infectante requerida para causar doença em 50% dos animais experimentalmente inoculados; DL min a menor dose letal; DL 100 dose letal para todos os animais em experimentação; DL 50 numa população heterogênea DL X DL 50 DL 50 Dose Animais n = 10 Medidas de virulência Exs.: Vibrio cholerea: 10 8 células Leptospira interrogans: 10 células Fatores de virulência bacterianos Aderência Pili Motilidade (flagelo), quimiotaxia Proteínas de membrana externa Processo infeccioso Exotoxinas, endotoxinas Sist. secreção dos tipos III e IV Crescimento intracelular Proteção contra as defesas do organismo Capsula, parede celular, membrana externa Inibição da ativação do complemento Variação antigênica Formação de biofilme Adesão Crucial para o patógeno resistir à tentativa de remoção mecânica pelo hospedeiro; Permite o estabelecimento da infecção; Fatores de adesão (adesinas): Proteinas; Pili ou fímbrias; Não fimbriais; Carboidratos; Receptores; Fatores de adesão fimbriais Arranjo polimérico helicoidal e protuberante com afinidade à algum receptor do hospedeiro; Muito comum em Gramnegativas: E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, Neisseria spp. Pili tipo IV Motilidade twitching Fatores de adesão Adesinas protéicas não fimbriais: Não possuem a estrutura longa e polimérica da fímbria; Contato íntimo ao hospedeiro; Proteínas de membrana externa expostas na superfície; Gram negativas: Yersinia pseudotuberculosis, E. coli enteropatogênica, Neisseria spp.,... Gram positivas: Staphylococcus spp., Streptococcus spp.; Micobacterias; 3
4 Adesão por polissacarídeos Polissacarídeos que compõem a membrana externa, parede celular ou cápsula; Ex.: Ácido teicóico serve de adesinas para Staphylococcus spp. e Streptococcus spp; Fatores de motilidade A motilidade é um fator essencial à virulência de diversos microrganismos; Permite a difusão pelos tecidos do hospedeiro em busca de locais preferenciais para o estabelecimento da infecção, bem como fuga do sistema imune; Proporcionado por flagelo ou pili; Adesão e movimento Anticorpos contra adesinas ou flagelo normalmente bloqueiam a adesão do patógeno ao hospedeiro ou sua motilidade, permitindo a lise pelo sistema complemento; Potenciais alvos para desenvolvimento de vacinas de subunidade Proteínas de membrana externa Proteínas de membrana expostas na superfície bacteriana que proporcionam adesão ou invasão de células do hospedeiro; Alvos potenciais para vacinas; E. coli - OmpA facilita adesão e invasão Anticorposcontra OmpA bloqueiam a invasão E. coli invasion (Prasadarao et al, Infect. Immun. 1999) Invasão Uma vez aderidos, diversos patógenos penetram em determinados locais do hospedeiro; Invasão extracelular e invasão intracelular; A invasão extracelular permite o acesso dos patógenos a nichos em tecidos onde possam proliferar, disseminar a outros sítios, expressar toxinas... Invasão extracelular Streptococcus β-hemolítico e Staphylococcus aureus secretam enzimas que degradam moléculas do hospedeiro: Hialuronidase: clivam proteoglicanos intracelulares; Streptoquinase e stafiloquinase: desmancham coágulos; Lipases: degradam lipídeos acumulados; Hemolisinas: degradam hemácias e outras células; 4
5 Invasão intracelular O patógeno entra nas células do hospedeiro e sobrevive neste ambiente; Invasão intracelular Salmonella spp. e Shigella spp. Alguns patógenos injetam proteínas (efetores) por meio de sistemas de secreção do tipo III (T3SS) dentro da célula do hospedeiro; Estas proteínas induzem modificações na célula, facilitando a invasão bacteriana; Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia spp. Pedestal de actina Estratégias intracelulares Bactérias intracelulares obrigatórias Bactéria intracelulares facultativas Listeria monocytogenes Movimento mediado por actina Chlamydia spp. Rickettsia spp Coxiella burnetii Mycobacterium spp Salmonella spp. Legionella pneumophila Brucella spp. Francisella tularensis Shigella spp. Listeria monocytogenes Yersinia spp. A invasão pode ocorrer em células fagocíticas ou não. Quando invadem células fagocíticas as bactérias sobrevivem à ação enzimática do lisossomo. Sobrevivência intracelular Patógenos invasores desenvolvem mecanismos para sobreviver intracelularmente Acidificação do vacúolo Fusão fagossomo-lisossomo Lise da membrana vacuolar e localização no citoplasma Maquinaria para recrutamento de actina; Patógenos intracelulares requerem indução de resposta imune celular Estratégias para evasão do sistema imune Anti-fagocitose Exemplos: - Yersinia (tirosina fosfatase, serina-treonina quinase, inibidores de actina) - E. coli EPEC (fosfatidil inositol-3 quinase) Vacina pode ser desenhada para neutralizar estes fatores, tornando os patógenos susceptíveis a fagocitose e morte intracelular 5
6 Estratégias para evasão do sistema imune Variação antigênica; Estratégias para evasão do sistema imune Cápsula bacteriana: polissacarídeos expostos de alto peso molecular; Inibem fagocitose por dificultar ligação de anticorpos e/ou componentes do complemento; Neisseria gonorrhoeae Variação antigênica do pili Aumentam virulência; Bacillus anthracis Streptococcus pneumoniae Klebsiella pneumoniae Streptococcus mutans Biofilmes Agregado microbiano em que as células se aderem umas às outras em uma superfície sólida. Substâncias poliméricas extracelulares; Biofilmes Funções: Resistência a fagócitos, dessecação, antibióticos, detergentes e estresses mecânicos; Ligação e sequestro de nutrientes; Formação de comunidades microbianas interdependentes; Bacterial biofilm - magnified 7,000x ( quorum_talk.html) S. Typhi colonização crônica Parede celular bacteriana Mary Mallon conhecido como Typhoid Mary Portador assintomático Isolado por força 3 decadas isolado até morreu 6
7 LPS Principal responsável por choque séptico; Ativa sistema imune inato via TLR4; Endotoxina! Toxinas Protéicas ou não-protéicas (LPS); Endotoxinas (LPS) ou exotoxinas; Fatores de virulência melhor caracterizados; Fáceis de purificar (sobrenadante); Utilizados como toxóides em vacinas; Ótimos adjuvantes; EXOTOXINAS x ENDOTOXINAS Exotoxinas protéicas Secretadas para o meio externo ou injetadas diretamente na célula do hospedeiro por T3SS; A maioria dos genes para exotoxinas está em plasmídeos ou fagos; 1. Toxinas A-B; 2. Toxinas proteolíticas; 3. Toxinas formadoras de poros; Outras... Toxinas A-B Subunidade A: Atividade enzimática, tóxica; Subunidade B: Ligação a receptor e internalização da toxina; Toxinas A-B P. aeruginosa, E. coli, V. cholerae, C. diphtheriae e B. pertussis; Atividades da subunidade A: Proteolítica: toxina tetânica e botulínica; Atua em adenilato ciclase (eleva camp): toxina colérica, diftérica, pertussis, exotoxina A de P. aeruginosa e toxina termolábil de E. coli; Subunidade B: excelente adjuvante; 7
8 Toxinas A-B Toxinas proteolíticas Clivam proteínas específicas do hospedeiro levando à manifestações características da doença; Toxina botulínica e toxina tetânica atuam em neurotransmissores; Botulínica: ingerida paralisia flácida; Tetânica: feridas paralisia espasmica; P. aeruginosa: toxinas que degradam matriz extracelular Elastase: degrada fibras de elastina. Toxinas formadoras de poros Levam à lise celular; Toxinas da família RTX (motivos repetitivos arginina [R] treonina [T]) Gram-negativas secretam por T1SS; Leucotoxinas e hemolisinas; Toxinas formadoras de poros Muitas Gram-positivas secretam citolisinas ativadas por sulfidril; A melhor caracterizada é a listeriolisina O, utilizada por Listeria monocytogenes para escapar do fagolisossomo; Outras toxinas IgA-proteases ; Neisseria spp. e Haemophilus influenzae; Toxinas termo-estáveis que ativam guanilato ciclase (eleva níveis de cgmp); Enterotoxina termo-estável de E. coli enterotoxigênica; Toxinas que modificam o citoesqueleto; Rho GTPases (Clostridium difficile, Salmonella, Shigella); E os vírus? Vacinas baseadas em peptídeos de superfície; As disponíveis são vacinas atenuadas replicantes ou inativadas; Preocupam pois podem propagar-se no organismo; Recombinação e origem de novos vírus; 8
9 Vacinas virais Resposta de anticorpos IgM e IgG aglutinantes e neutralizantes; Extracelular; Resposta Th1 células citotóxicas; NK e macrófagos; Intracelular; DNA de fita simples TLR8; DNA de fita dupla TLR3; Desafios na produção de vacinas virais Dificuldade de produção; Curta vida de prateleira dos produtos; Imunidade curta; Necessidade de dezenas de antígenos para abranger a diversidade antigênica viral; Laboratório nível três; Alumínio como adjuvante; Inativação incompleta no uso de formaldeído; E os parasitas? Vacinas contra parasitas Taenia solium mais de 3m Th2 IgE Plasmodium spp. protozoário invade hepatócitos e eritrócitos Leishmania spp. protozoário invade macrófagos Evasão do sistema imune E os fungos? Tegumento: barreira física contra anticorpos e células de defesa; Proteínas antioxidantes: expressam superóxidos dismutases que convertem superóxido em H2O e O2; Proteínas do tegumento bloqueiam a formação do complexo de ataque à membrana; Possuem fatores de virulência semelhante aos bacterianos; A maioria das infecções ocorre em depressão imunológica; Destacam-se a produção de micotoxinas, como a aflatoxina de Aspergillus spp. Interfere na síntese de proteínas e seus metabólitos podem se intercalar no DNA cancerígenos; Eosinófilos atraídos por IgE ligado à larva de Schistosoma mansoni 9
10 Dúvidas... 10
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