Gênero Mycobacterium. Prof. Adj. Ary Fernandes Júnior Departamento de Microbiologia e Imunologia IBB-UNESP-Campus de Botucatu

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1 Gênero Mycobacterium Prof. Adj. Ary Fernandes Júnior Departamento de Microbiologia e Imunologia IBB-UNESP-Campus de Botucatu ary@ibb.unesp.br

2 Ordem Actinomycetales Família Mycobacteriaceae Genero Mycobacterium Aproximadamente 165 espécies e 13 sub-espécies no gênero Mycobacterium Euzéby: List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (2013)

3 1873 Gerhard Henrick Armauer Hansen (M. leprae) 1882 Robert Koch (bacilo da Tb tipo mamífero) (M. tuberculosis) Micobactérias clássicas (Sempre Patogênicas): M. tuberculosis (Tb HO), M. bovis (Tb em BO), M. ulcerans (úlcera tuberculótica HO), M. leprae (Hanseníase) (Doença antiga - Bíblia) 1959 Classificação de Runyon em 4 grupos) Micobactérias não tuberculóticas (= Atípicas ou Anônimas) (Oportunistas)

4 Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti (roedores), M. caprae (caprinos), M. canetti (var. do M. tuber Somália), M. pinnipedii (leões) Complexo Mycobacterium tuberculosis 99,9% de identidade genética (RNAr 16S)

5 Espécies de Mycobacterium de maior importância Espécie Grupos de Runyon Significado M. leprae, M. ulcerans, M. tuberculosis, M. bovis - Sempre Patogênicas M. marinum, M. kansasii, M. asiaticum, M. simiae I (Fotocromógenas) (carotenóides) Geralmente Patogênicas M. scrofulaceum, M. flavescens, M. xenopi, M. gordonae, M. szulgai II (Escotocromógenas) Geralmente Patogênicas M. avium (3 subespécies), M. terrae M. Intracellulare M. fortuitum, M. chelonae, M. vaccae, M. phlei, M. smegmatis III (Não-Cromógenas) IV (Rápidos Crescedores) Geralmente Patogênicas Geralmente não Patogênicas M. avium subesp. paratuberculosis (doença de Johne) (gastroenterites em ruminantes)

6 Micobactérias não tuberculosas ou atípicas (MNT) patogênicas para o homem segundo classificação de Runyon Grupos Espécies de crescimento Apresentação clínica comum Tempo Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV Fotocromogênicas M. kansasii M.marinum M.simiae M. asiaticum Escotocromogênicas M. scrofulaceum M. xenopi M. szulgai M. gordonae M. flavencens Não cromogênicas Complexo M. avium (inclui M.intracellulare) M. malmoense M. hemophilum M. terrae M. ulcerans M. noncromogenicum De Crescimento Rápido- Complexo M. fortuitum (inclui M.chelonae), M.abscessus M. thermoresistible M. neoaurum Pulmonar e ganglionar Lesões cutâneas pulmonar pulmonar Pulmonar e ganglionar Pulmonar Pulmonar *Não patogênica *Não patogênica Pulmonar, ganglionar ou disseminada Pulmonar Cutânea e de tecidos moles * Não patogênica Úlceras cutâneas Úlceras cutâneas Pulmonar, tecidos moles, óssea * Não patogênica *Nãopatogênica * Usualmente saprófitas, porém há registros de doenças provocadas por elas. Fonte: adaptado de Runyon ( ATS Statement, 1997) In: Ministério da Saúde,2007 Lento Rápido Lento Lento Lento Lento Lento Lento Lento Lento Lento Lento Lento Rápido Rápido Rápido

7 Tuberculose Infecção 90 a 95% dos infectados Tuberculose Doença 5 a 10% dos infectados (Óbito - 50% 2,7 milhões/ano), (Doença Crônica - 25%), (Cura natural - 25%) Doença grave, porém 100% curável

8 Epidemiologia A importância econômica atribuída à doença bovina está baseada nas perdas diretas e indiretas: resultantes da morte de animais, queda no ganho de peso, diminuição da produção de leite, descarte precoce, eliminação de animais de alto valor zootécnico, condenação de carcaças no abate, perda de prestígio e credibilidade da unidade de criação onde a doença é constatada. Dados de notificações oficiais indicam uma prevalência média nacional de 1,3% de animais reagentes à tuberculina.

9 Huang et al. (2007) Características Gerais Bacilos (pleomórficos) retos ou encurvados, cocobacilos, filamentosos ou formas ramificadas. (0,2-0,6 m por 1-10 m)

10 Características Gerais Não formam esporo, flagelo ou cápsula Parede Complexa quanto a composição química Lipídeos (60% PS) Natureza hidrofóbica para a parede (30% do genoma para produção destes lipídeos) (Ácido micólico = Ác. graxo com 70 a 80 carbonos) (* Características importantes)

11 O complexo ácido micólico arabinogalactana - peptidoglicano representam o núcleo rígido da parede bacteriana

12 Características Gerais * Bacilos Álcool Ácidos Resistentes (BAAR) (Ziehl-Neelsen)

13 Coloração para baciloscopia Amostras Clínicas Exame Direto para pesquisa de BAAR (ou Bacilo de Koch) (Ziehl-Neelsen ou Kinyoun) Limite de detecção bacilo/ml material (2 a 3 amostras) Frasco estéril boca larga Kinyoun

14 Características Gerais Intracelulares - Infectam e proliferam-se no interior de macrófagos M. intracellulare

15 Características Gerais Cultivo: Meio de cultura Lowenstein-Jensen (Albumina, Lecitina (Ovo), Glicerol, Asparagina, Sais Minerais e Verde Malaquita (agente inibidor) Middlebrook (agar (7H10 e 7H11) e caldo (7H9))(sais específicos, vitaminas, cofatores, acido oléico, albumina, catalase, glicerol, asparagina) cresce menos contaminantes que o contendo ovo Stonebrink (Sem glicerol, com piruvato) M. bovis Dubois, Ogawa

16 Stonebrink Lowenstein-Jensen

17 Cultura de Mycobacterium canettii em Middlebrook 7H10 agar (cultura de 4 semanas) Somoskovi A et al. J. Clin. Microbiol. 2009;47:

18 Características Gerais Cultivo: Condições de cultivo Aeróbios Estritos (requer O 2 ) ou Microaerófilos, ph 6,8-7,0, T o C: o C (Mamíferos), 25 e 45 o C (Aviário) Crescimento Lento 10 dias a 3 semanas * tempo de geração de 18 a 24 horas; rápido 3 a 7 dias (normalmente as saprofíticas)

19 Patogenia Sem Fatores de Virulência Clássicos (toxinas, adesinas, cápsula polissacarídica) *Componentes lipídios estão envolvidos na patogênese (Intracelulares facultativas e não destruídos no interior dos fagócitos Evita fusão do fagossoma com o lisossoma ) (Resposta mediada por células) Infecções que podem durar a vida toda do indivíduo

20 Outras bactérias e Warner & Mizrahi, Nature Medicine 13, A maioria das bactérias e micobactérias não patogênicas são rapidamente mortas quando fagossomo fundise com lisossomos. Por outro lado, o M. tuberculosis permanece dentro dos fagossomos e a bactéria libera PknG (proteina kinase G) para bloquear a fusão fagossomo com lisossomo. As bactérias que não possuem gen pkng são rapidamente transferidas para os lisossomos e eliminadas.

21 Patogenia Transmissão aérea Alvéolo pulmonar Fagocitose por Macrófagos DESTRUIÇÃO TECIDUAL Multiplicação intra celular com lise dos macrófagos e liberação de lisossomas RESPOSTA INFLAMATÓRIA CANCRO DE INOCULAÇÃO Acúmulo de polimorfonucleares FORMAÇÃO DE GRANULOMA Lesões secundárias por Contiguidade - Tuberculose miliar Disseminação principalmente nos Rins e Ossos longos (Olhos, SN, TI, Linfonodos, Pâncreas, Pele, Cavidade Oral, etc )

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23 Desenvolvimento e estrutura de um granuloma na tuberculose humana. 1 - Captação do M. tuberculosis pelos macrófagos alveolares. 2 - Migração do macrófago infectado para linfonôdo de drenagem. 3 - Recrutamento de monócitos sistêmicos. 4 - Formação do granuloma. L, Linfócitos na periferia do granuloma. F, Cápsula fibrosa (fibroblastos, colágeno e outras proteínas). M, região com macrófagos infectados. C, Cerne caseoso (contem material debris e lipídios de macrófagos). Stehr et al, 2012 (Microbes and infection), v.14, n.13,

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26 Pulmão e linfonôdo bovino com diversos nódulos de aspecto caseoso. Fonte:

27 Tuberculose no figado (Mycobacterium bovis) Úbere bovino com mastite caseosa (Mycobacterium bovis) Endometrite granulomatosa em bovino por Mycobacterium sp Tuberculose em útero bovino

28 Caixa torácica de bovino com granulomas de origem por M. bovis Lesões granulomatosa em pulmão de bovino causado por M. tuberculosis

29 Sintomas (Humano) Tosse (por mais de 15 dias), Dispnéia, Cansaço fácil, Dor torácica, Rouquidão, Febre ( mais comum ao entardecer), Sudorese Noturna, Falta de apetite, Emagrecimento

30 Manifestações clínicas Bovinos (M. bovis) Forma Pulmonar ( HO), Forma Ganglionar, Intestinal (diarréia crônica), Cutânea (Úbere) (M. tuberculosis e M. avium autolimitante) Suínos Via alimentar - M. bovis lesões clássicas Ovinos e Caprinos M. bovis (M. avium) ( Bovinos) Equinos Raramente infectados (M. avium) (Trato alimentar) Cães e gatos Raro - M. bovis (M. tuberculosis) (comum localização intestinal e abdominal)

31 Os sinais clínicos da tuberculose bovina Na maioria das vezes estão ocultos (sem sinais clínicos) Quando presentes são representados por: Perda de peso progressivo; Aumento do volume dos linfonôdos; Em alguns casos tosse; Debilidade; Caquexia; Sinais respiratórios (Dispnéia), Menor freqüência: sinais digestivos (diarréia) e geniturinários, neurológicos e outros. Obs: Nos bovinos é conhecida por ser uma doença crônica debilitante, mas também pode apresentar curso agudo progressivo

32 Diagnóstico Laboratorial Amostras Clínicas Exame Direto (Ziehl - Neelsen), Cultura (Lowestein-Jensen) Baciloscopia Permite descobrir fontes de infecção = Bacilíferos Cultura (Lowestein-Jensen, Middlebrook) limite de detecção é de 10 2 bacilos/ml (O aumento da tensão de CO 2 intensifica o crescimento) Identificação Bioquímica: Niacina, Redução de Nitrato, Hidrólise do Tween, Catalase a 68 o C, Urease Testes moleculares: Sondas M. tuberculosis PCR Amplificação de sequências espécies específicas RNAr 16S

33 Imunodiagnóstico: Teste da Tuberculina (Teste Cutâneo) Tuberculinização Os animais infectados são reativos ( alérgicos ) às proteínas (transporte e porinas da parede) contidas na tuberculina e desenvolvem reações de hipersensibilidade do tipo tardio (tipo IV) edema no local da inoculação. Hipersensibilidade mediada por células X Tuberculina ou PPD (Purified Protein Derivative) (0,1 ml de solução de tuberculina = 0,04 µg)

34 Teste Cervical Simples e Teste da Prega Caudal em bovinos

35 Hipersensibilidade do tipo IV Reações Granulomatosas

36 Tuberculose em bovinos Queda de produtividade do rebanho; Quadro crônico de evolução progressiva; Condenação de carcaças no abate. Um método de avaliação de prevalência da tuberculose bovina é a realização de uma inquisição epidemiológica em matadouros, procurando, a partir das carcaças e vísceras desviadas ao Departamento de Inspeção Final (DIF), identificar alterações anátomo-patológicas características.

37 Não há tratamento indicado para a tuberculose bovina. A redução na incidência da doença se torna possível com a utilização de medidas de controle e profilaxia adequadas, incluindo o sacrifício dos animais positivos, segundo as normas do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT), elaborado em 2001 pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).

38 Drogas para Tratamento: (Estreptomicina, Isoniazida, Ethambutol, Rifampicina ) Padronizado e duração de 6 meses - Esquema Básico para humanos -Nos dois primeiros meses: Isoniazida, Rifampicina e Pirazinamida e Etambutol -Nos quatro últimos meses: Isoniazida e Rifampicina -Tratamento responsabilidade exclusiva do setor público de saúde

39 Vacinação BCG (Bacilo de Calmette e Guérin) (1921) (M. bovis modificado) (50% de proteção) Resistência as condições ambientais Sensíveis a temperaturas elevadas ( pasteurização ) * Resistência as condições ambientais (dessecação e desinfetantes)

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41 Lesão verrucosa de tuberculose cutânea no polegar de um veterinário (M. bovis) Twomey D F et al. Veterinary Record 2010;166: Copyright British Veterinary Association. All rights reserved.