UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS DETECÇÃO DO VÍRUS MAEDI-VISNA NO LAVADO BRONCO- ALVEOLAR DE PULMÕES OVINOS FORTALEZA

2 GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS DETECÇÃO DO VÍRUS MAEDI-VISNA NO LAVADO BRONCO-ALVEOLAR DE PULMÕES OVINOS Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira FORTALEZA

3 M387d Martins, Gabrielle Rosemblit. Detecção do vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos / Gabrielle Rosemblit Martins CD-ROM. 49 f. il. (algumas color); 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm). Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira. 1. Pneumonia. 2. Abatedouro. 3. Nested-PCR. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. CDD :

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5 À Deus, sem Ele não poderia conquistar nada do que tenho até hoje. Aos meus pais, Eguimar Araújo Martins e Rita Maria Rosemblit Martins, que com muito amor e dedicação sempre me apoiaram e me incentivaram em todas as etapas da minha vida. 5

6 AGRADECIMENTOS A Universidade Estadual do Ceará por disponibilizar condições técnica e pessoal para realização deste trabalho. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro. A Deus por tudo que já conquistei até hoje, e peço a Ele sabedoria para conseguir conquistar muito mais. Aos meus pais, Eguimar Araújo Martins e Rita Maria Rosemblit Martins, pelo amor e apoio incondicional, me tornando mais forte a cada dia. Sei que sempre posso contar com vocês. Aos meus avôs, José de Freitas Rosemblit (IN MEMORIAN) e Maria Helena Viana Rosemblit, que com todo carinho sempre torceram por mim e me apoiaram. Ao meu irmão Gustavo Rosemblit Martins que com todo o seu alto astral está sempre alegrando a nossa casa. Ao meu noivo Ismael Aires que me apoia todo dia e me da força para conquistar cada dia mais. A minha orientadora Profa. Dra. Fátima Teixeira que colabora com a minha formação acadêmica desde a graduação, aprendi muito com ela e ainda tenho muito a aprender. Agradeço por toda a atenção e carinho durante este mestrado, e por todas as oportunidades. Aos meus amigos do LABOVIR, especialmente ao Rosivaldo Junior, Rebeca Cavalcante, Igor Barroso e D avila Aguiar, por todos os bons momentos que vivemos durante esses anos e apoio durante a realização desse experimento. 6

7 RESUMO O vírus Maedi-Visna é um lentivírus pertencente à família Retroviridae, responsável por causar uma doença de caráter multissistêmico, que não possui tratamento ou vacina, denominada Maedi-Visna. O animal infectado pode apresentar lesões nos pulmões, articulações, glândulas mamárias e cérebro, isoladamente ou não; porém, normalmente, o animal se apresenta assintomático, devendo-se recorrer a testes laboratoriais para seu diagnóstico. O objetivo desse trabalho foi detectar o vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos provenientes de abatedouro da Região Metropolitana de Fortaleza. Para tanto, foram coletadas amostras de pulmões ovinos, e realizado o lavado bronco-alveolar para obtenção das células de interesse, em sua maioria leucócitos, que foram destinados ao cultivo celular e posterior extração e amplificação do DNA. Por meio de Nested-PCR, a presença do DNA pró-viral foi confirmada em seis (10,48%) das 58 amostras estudas, demonstrando a presença do vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar, e reafirmando a importância da via respiratória na transmissão desse patógeno. Dessa forma, amostras de lavado broncoalveolar podem ser utilizadas visando-se diagnosticar essa doença, sendo a detecção do DNA pró-viral um diagnostico conclusivo. Palavras-chave: Pneumonia. Abatedouro. Nested-PCR. 7

8 ABSTRACT Maedi Visna Virus is a lentivirus belonging to the Retroviridae family, responsible for causing a multisystem disease that has no vaccine or treatment, called Maedi-Visna. The infected animal may show lesions in the lungs, joints, brain and mammary glands, singly or not, but usually the animal doesn t shows symptoms, and should be resorted to laboratory tests for diagnosis. The aim of this study was to detect the Maedi Visna Virus in bronchoalveolar lavage of sheep lungs from slaughterhouse in the Metropolitan Region of Fortaleza. For this purpose, samples lungs were collected from sheep, and performed bronchoalveolar lavage to obtain the cells of interest, mostly leukocytes, which were intended for cell culture and subsequent DNA extraction and amplification. By nested PCR, the presence of proviral DNA was confirmed in six (10.48%) of the 58 samples studied, demonstrating the presence of virus Maedi-Visna in bronchoalveolar lavage, and reaffirming the importance of airway in the transmission of this pathogen. Thus, samples of bronchoalveolar lavage can be used in order to diagnose this disease, and the detection of proviral DNA a conclusive diagnosis. Key words: Pneumonia. Slaughterhouse. Nested-PCR. 8

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Detecção do DNA pró-viral do MVV nas amostras de lavado broncoalveolar. Linha 1 corresponde ao marcador molecular 100pb, linha 2 controle negativo, linha 10 ao controle positivo, linha 4 e 9 as amostras positivas...35 Figura 2 Alterações macroscópicas dos pulmões ovinos infectados pelo MVV. Pulmões 23 apresentando coloração esbranquiçada, aumento de tamanho, pontos hemorrágico e bordas esbranquiçadas. Pulmão 36 com coloração rosa, áreas de enfisema, pontos hemorrágicos e bordas esbranquiçadas

10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIEV Vírus da Anemia Infecciosa Equina BIV Vírus da Imunodeficiência Bovina CAE Artrite Encefalite Caprina CAEV Vírus da Artrite Encefalite Caprina ELISA Enzyme-Linked Immunosorbet Assay env Gene que codifica as proteínas do envelope viral FAO Food and Agriculture Organization of United Nations FIV Vírus da Imunodeficiência Felina G Unidade da força centrífuga relativa g - gramas gag gene viral que codifica as proteínas internas do vírus gp Glicoproteína HIS Hibridização in situ HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IDGA Imunodifusão em Gel de Agarose IN Integrase LVPR Lentivírus de Pequenos Ruminantes MEM Meio Essencial Minimo MSC Membrana sinovial caprina MV Maedi-Visna MVV Maedi-Visna Vírus OIE - Organização Mundial de Saúde Animal PCR Reação em cadeia polimerase pol Gene que codifica as enzimas virais 10

11 rev Gene de regulação viral RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta RT Transcriptase reversa SNC Sistema Nervoso Central SIV - Vírus da Imunodeficiência Símia vif Gene de regulação viral UECE Universidade Estadual do Ceará 11

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA DEFINIÇÃO HISTÓRICO AGENTE ETIOLÓGICO CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL EPIDEMIOLOGIA PATOGENIA SINAIS CLÍNICOS ALTERAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS DIAGNÓSTICO PROFILAXIA E CONTROLE JUSTIFICATIVA HIPOTESE CIENTIFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS ANEXO I

13 1 INTRODUÇÃO O Vírus Maedi-Visna (MVV) e o Vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) são lentivírus que acometem pequenos ruminantes causando infecções persistentes e progressivas. O MVV e CAEV são lentivírus intimamente relacionados, que infectam preferencialmente ovinos e caprinos, respectivamente, causando doença pulmonar progressiva, encefalomielite e artrite (Franke, 1998). A denominação Maedi-Visna, originada na Islândia, refere-se, respectivamente, a dispnéia associada à pneumomia intersticial progressiva (Maedi) e a prostação (Visna). O lentivírus ovino causa doença multissistêmica, com lesões caracterizadas pela infiltração de células mononucleares e linfoproliferação. A sintomatologia apresentada inclui intolerância ao exercício, fadiga ou deficiência para caminhar com o rebanho, mastite, artrite, e no caso da forma nervosa podem apresentar tremor, ataxia e paralisia. A forma pulmonar é mais comumente presente como pneumonia intersticial crônica com sinais de doença respiratória progressiva (Gudnadottir, 1974; Dawson, 1980). Essa doença causa perdas de forte impacto econômico, devido à mortalidade de 10 a 20% de adultos após o desenvolvimento de sinais clínicos; mortalidade de cordeiros e crescimento reduzido pela falta de colostro/leite, aumento na taxa de descarte, incidência de artrite, parto prematuro, diminuição na taxa de crescimento, diminuição da vida produtiva, redução da produção leiteira, predisposição da glândula mamária a infecções bacterianas, desvalorização comercial dos produtos de criatórios com animais positivos e despesas com programas de controle (Pinheiro, 2001). Por se tratar de uma doença que provoca graves perdas na produção, deve-se instituir medidas de controle eficazes, incluindo diagnóstico precoce e descarte dos animais infectados, a fim de evitar a disseminação desse vírus. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo identificar animais infectados pelo vírus Maedi-Visna, através da detecção desse patógeno no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos provenientes de abatedouro. 13

14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 DEFINIÇÃO Maedi-Visna (MV) é uma doença que acomete preferencialmente ovinos, caracterizada por infecção lenta e progressiva. A denominação Maedi-Visna, originada na Islândia, refere-se à dispnéia associada à pneumomia intersticial progressiva (Maedi) e a prostação (Visna) associada à meningoencefalite. Inicialmente acreditava-se tratar-se de doenças distintas, porém após o estabelecimento de suas etiologias verificou-se que se tratava do mesmo patógeno sendo responsável por manifestações histopatológicas e clínicas distintas, denominando-se Maedi-Visna (Gudnadottir, 1974; Dawson, 1980; Quinn et al., 2005). A denominação Maedi-Visna é a mais comumente utilizada em muitas partes de mundo, porém também existem outras denominações como Zwoergerziekte na Holanda (De Bôer, 1975; Houwers, 1985), Jaagsiekte na África do Sul (Verwoerd et al., 1983) e Doença Pulmonar de Montanha ou Pneumonia Progressiva Ovina (PPO) nos Estados Unidos (Cutlip & Laird, 1976). 2.2 HISTÓRICO O MVV foi o primeiro membro de lentivírus reconhecido como uma doença independente de ovino, pertencente a uma nova categoria de doenças caracterizada por uma infecção com replicação lenta (Sigurdsson, 1954; Straub, 2004). Ao estudar o vírus Maedi-Visna, Sigurdsson (1954) criou o termo vírus lento ou lentivírus para aquelas infecções causadas por retrovírus que desenvolvem infecções crônicas de evolução lenta, persistente, progressiva e degenerativa. O Visna e Maedi apresentaram os primeiros surtos produzindo uma doença lentamente progressiva e fatal, incluindo síndromes debilitantes acompanhadas de degeneração do sistema nervoso (Haase, 1986). As primeiras descrições de doenças com sintomatologia semelhante à da MV foram feitas na África do Sul (Mitchel, 1915) e, posteriormente, nos Estados Unidos da América (Marsh, 1923). Apesar de existirem relatos sobre essa doença desde o ano de 1915, somente após um surto ocorrido na Irlanda entre os anos de 1939 e 1952 ela recebeu a devida 14

15 atenção. Esse fato decorreu da importação de ovinos Karakul da Alemanha em 1933, visando um melhoramento genético da raça nativa (Sigurdsson, 1954). Sigurdsson et al. (1960) isolaram o MVV primeiramente do sistema nervoso central (SNC) de ovinos, demonstrando que esse vírus tinha sido introduzido na Islândia através da importação de ovinos Karakul da Alemanha em Essa importação teve como meta melhorar a raça nativa da Islândia, mas a raça Karakul também introduziu adenomatose pulmonar, paratuberculose e visna. Inicialmente Maedi-Visna foi reconhecida como duas doenças distintas, porém estudos comparativos dos isolados de ovinos afetados com Visna (Sigurdsson et al., 1960) e Maedi (Sigurdardóttir & Thormar, 1964), demonstraram a similaridade entre esses vírus, revelando se tratar apenas de uma doença Maedi-Visna (Thormar & Helgadottir, 1965; Straub, 2004). No Brasil, os primeiros relatos dessa doença em ovinos ocorreram em 1988 e 1989 (Dal Pizzol et al., 1989). A presença do vírus foi confirmada pelo posterior isolamento do vírus de ovinos (Moojen et al., 1996; Milczewski et al., 1997; Almeida, 2003). 2.3 AGENTE ETIOLÓGICO O vírus Maedi-Visna (MVV) é um vírus não oncogênico pertencente à família Retroviridae e ao gênero Lentivírus (Pasick, 1998). Vários outros vírus de importância veterinária e humana também estão incluídos neste gênero, como os vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (AIEV), da artrite encefalite caprina (CAEV), da Doença de Jembrana e das imunodeficiências humana (HIV), bovina (BIV), felina (FIV), símia (SIV) (Pritchard & Dawson, 2000), e o lentivirus puma (ICTV, 2011). O MVV e o CAEV estão intimamente relacionados, apesar de geralmente infectarem ovinos e caprinos, respectivamente, podem infectar ambas as espécies, principalmente através do leite ou colostro contaminado, sendo, por isso, denominados Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR) (Pritchard & Dawson, 2000). Os lentivírus de ovinos e caprinos podem ser divididos em dois grupos biologicamente distintos. O vírus protótipo do grupo I é o visna, vírus islandês cepa Este vírus se replica rapidamente, causando lise em culturas primárias de células de membrana sinovial de caprinos (MSC) e de células do plexo coróide de ovinos 15

16 (CPC), sofre variação antigênica e induz a produção de anticorpos neutralizantes pelo hospedeiro. O protótipo do grupo II é o vírus CAEV cepa Cork (Zink & Jonhson, 1994). O MVV como os demais lentivírus são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100 nm de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas moléculas idênticas de RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg2+ e proteínas do nucleocapsídeo (Gonda et al., 1986). O envelope está associado covalentemente com as glicoproteínas transmembranárias (TM) e de superfície (SU). Outra estrutura presente na partícula viral é a matriz que está situada entre o capsídeo e o envelope (Pepin et al., 1998). 2.4 CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL O MVV infecta ovinos e caprinos tanto natural como experimentalmente (Banks et al., 1983; Leroux et al., 1995; Castro et al., 1999). Infecta, in vivo, células das linhagens de monócitos e macrófagos (Narayan & Clements, 1989). In vitro, os LVPR replicam-se em cultivos de células fetais do plexo coróide (Sigurdsson et al., 1960), músculo liso cardíaco (Leroux et al., 1995), baço, timo, linfonodo escapular (Narayan et al., 1980), membrana sinovial caprina (Crawford et al., 1980), células de linhagens fibroblásticas imortalizadas (Teixeira et al., 1997) e tecido epitelial (Lee et al., 1996). O efeito citopático produzido consiste na formação de células gigantes multinucleadas (sincício) e lise celular (Carey & Dalziel, 1983). Os retrovírus possuem a enzima transcriptase reversa que é capaz de transformar o RNA viral na dupla fita de DNA pró-viral, o que permite sua incorporação ao genoma celular. Os lentivírus são capazes de replicar-se em células diferenciadas que não estão se replicando, ou seja, não dependem da síntese de DNA celular para sua replicação, o que os difere de outros grupos de retrovírus. Entretanto, estas células precisam ser ativadas para produzir a progênie viral (Clements & Payne, 1994). O ciclo de replicação dos LVPR pode ser dividido em duas etapas principais: infecção e expressão. A fase de infecção dá origem ao provírus e a fase de expressão resulta na produção do RNA viral e formação de vírions (Gonda, 1994). Inicia-se com a ligação do vírus, através das glicoproteínas de seu envelope, aos receptores da superfície celular (adsorção). A seguir ocorre a fusão do envelope a membrana celular e liberação do RNA viral no citoplasma da célula (desnudamento). O RNA viral é transcrito em DNA por ação enzimática da transcriptase reversa, transportado ao núcleo celular e 16

17 integrado, como um provírus, ao genoma celular por ação da enzima integrase (Brooks et al., 1998). Em seguida ocorre a síntese do RNA viral pela RNA polimerase II celular usando o provírus como molde, transcrição do genoma em RNA-mensageiros (RNAm) síntese das proteínas virais, montagem, construção do capsídeo e brotamento do vírus (Coffin, 1996). O provírus, uma vez integrado, é estável, não existindo evidência de qualquer mecanismo para remoção dos provírus do DNA celular, transposição direta dele para outro sítio ou replicação independente (Coffin, 1996). A integração do DNA proviral ao DNA celular não é essencial à replicação dos lentivírus, mas é fundamental para a persistência da infecção (Haase, 1986). 2.5 EPIDEMIOLOGIA O MVV está presente em todo mundo, com exceção da Islândia, onde foi erradicado em 1965, após uma campanha de controle e erradicação executada durante 30 anos (Pétursson, 1994), e da Austrália e Nova Zelândia, dois grandes produtores de ovinos onde a doença nunca foi relatada (Greenwood et al., 1995). No Brasil, o primeiro relato da presença de ovinos infectados pelo MVV foi registrado em 1988 e 1989 no Rio Grande do Sul, onde foram avaliadas 267 amostras de soro ovino, pertencentes a propriedades com histórico de importação de animais de países onde a doença já foi relatada, pela técnica de IDGA, demonstrando que 10,48% dos animais eram positivos (Dal Pizzol et al., 1989). Já foram diagnosticados através de sorologia animais com Maedi-Visna nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e Paraná (Moojen, 1986), Pernambuco (Abreu, 1998). Moojen et al. (1996) isolou o MVV em células infectadas de ovinos soropositivos, através de microscopia eletrônica, concluindo o primeiro isolamento deste vírus no país. No Ceará, foram realizados os primeiros levantamentos soro epidemiológicos através de técnica de IDGA, em animais destinados a abate na região metropolitana de Fortaleza, onde se observou que um percentual de 31,61% dos animais avaliados eram positivos (Almeida et al., 1999). Enquanto que Araújo (2004), verificou uma prevalência de 5% da infecção pelo MVV em uma amostra de 223 animais. A forma respiratória (Maedi) é a manifestação mais comum. Visna, a forma nervosa, foi descrita primeiramente na Islândia como uma doença paralítica progressiva 17

18 crônica de ovinos adultos. Entretanto, à exceção de outras epidemias da Islândia, a forma neurológica foi raramente relatada, geralmente acompanhada da forma respiratória, na Europa e nos Estados Unidos. Na Espanha, onde a prevalência da infecção por MVV é alta, as formas respiratória e mamária são as mais comuns. Entretanto, casos numerosos da forma neurológica foram reconhecidos na região Castilla y Leon da Espanha, sendo a maioria na raça Assaf (Benavides et al., 2006). 2.6 PATOGENIA Os lentivírus de ovinos e caprinos são transmitidos tanto horizontalmente quanto verticalmente. A transmissão horizontal ocorre pela inalação de exsudatos respiratórios contendo vírus ou células infectadas. A transmissão vertical ocorre, principalmente, pela ingestão de leite e colostro contendo macrófagos infectados (Zink & Johnson, 1994). Existe também a hipótese de transmissão sexual, Blacklaws et al. (2004) sugerem que a presença do vírus no sêmen pode ser devido à excreção de células epiteliais epididimais, os resultados destes estudos mostraram que a infecção corrente ou inflamação nos testículos induz a liberação do MVV dentro do sêmen. Os alvos celulares primários da infecção por MVV são as células da linhagem monocitico-fagocitária, sendo que a expressão viral é ativada com a diferenciação do monócito a macrófago. O MVV persiste dentro dessas células e pode permanecer em estado latente por um período indeterminado (Christodoulopoulos, 2006). A produção restrita de vírus nos monócitos permite a disseminação insidiosa do vírus por todo o organismo, com uma estimulação imunológica mínima. A ocorrência de variantes antigênicas durante o curso de uma infecção como resultado da instabilidade genética também facilita a persistência (Quinn et al., 2005). A Maedi-Visna é caracterizada por uma proliferação linfoide e infiltração intersticial mononuclear dos órgãos afetados (Benavides et al., 2006). Cultivo celular e estudos in vivo têm demonstrado a interação de macrófagos primários de ovinos ou caprinos infectados com um único tipo de interferência, LV IFN. Esta citosina tem sido detectada in vivo no pulmão e articulações de animais infectados. O LV IFN induz a expressão de antígenos MHC classe II nos macrófagos. Este aumento pode apresentar antígenos virais para células T helper, as quais secretam uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, algumas com atividade quimiotática para monócitos e 18

19 linfócitos. Estas citocinas podem então contribuir para uma intensa inflamação vista nos tecidos afetados (Zink & Johnson, 1994). Os LVPR afetam, principalmente, os pulmões, úbere, articulações e cérebro, porém já foram identificados em gânglios linfáticos, baço e medula óssea (Extramiana et al., 2002; Preziuso et al., 2003). Angelopoulou et al. (2006) verificaram a presença do MVV no rim e pulmão de animais naturalmente infectados, detectado através de PCR, e também visualizada na imunohistoquímica realizada com amostras de tecido renal, em que foi identificada a presença desse vírus nas células epiteliais tubulares renais. A indução da resposta imunológica é variável e não protege contra a infecção (Callado et al., 2001). Apesar dos anticorpos surgirem tardiamente, aumentam em título lentamente, mas a resposta celular em órgãos afetados, como nos pulmões, promove lesões permanentes e difusas com proliferação de células linforeticulares, chegando a atingir os alvéolos pulmonares comprometendo as trocas gasosas (Ishizuka et al., 2005). Muitos ovinos permanecem portadores assintomáticos durante toda sua vida e de acordo com Christodoulopoulos (2006) somente uma porcentagem de 25-30% dos animais soropositivos desenvolvem os sinais clínicos. 2.7 SINAIS CLÍNICOS O MVV causa doença multissistêmica, caracterizada pela infiltração de células mononucleares e linfoproliferação (Brodie et al., 1998). Os ovinos geralmente exibem sinais da doença no segundo ano de infecção e morrem em consequência da prostração e doença progressiva (Haase, 1986). Ocorrem quatro formas clínicas da doença: respiratória, nervosa, articular e mamária, estas podem apresentar-se juntas ou separadas. Na forma respiratória os ovinos podem apresentar tosse, dispnéia (após exercícios físicos), taquipnéia, consolidação pulmonar, som úmido à auscultação, comprometimento do estado geral e quadros secundários de pneumonia (Callado et al., 2001; Moojen, 2001). Maedi é a manifestação clínica mais comum de infecção por MVV. O primeiro sinal clínico é a perda de condição corporal com a evolução da doença para taquipnéia, que é um achado aparente mesmo em repouso. Os animais permanecem alertas mesmo ao se alimentarem, apesar da dispnéia e emaciação. Pode ocorrer perda de lã, febre, tosse e corrimento nasal não são sinais de Maedi, a menos que infecção bacteriana secundária esteja presente (Christodoulopoulos, 2006). 19

20 A forma nervosa é pouco importante, tendo sido relatada em ovinos adultos geralmente como complicação da forma respiratória (Ishizuka et al., 2005). A meningoencefalomielite é caracterizada por tremor, ataxia e ocasionalmente por paralisia progressiva do membro posterior (Constable et al., 1996). Os ovinos podem apresentar: incoordenação; andar em círculo, postura anormal da cabeça, nistagmo, paresia gradual posterior, que progride a paralisia; e morte. Apesar da manutenção do apetite há perda progressiva de peso. Esta forma é encontrada com menor frequência, mas era comum nos ovinos da Islândia antes da erradicação da doença (Brodie et al., 1998; Moojen, 2001). Normalmente o quadro nervoso é observado em animais com mais de dois anos, porém Benavides et al. (2007) relatou a ocorrência em quatro ovelhas de quatro a seis meses, que apresentaram andar cambaleante e ataxia, evoluindo para decúbito, movimentos circulares com as quatro patas e falta de resposta a estímulos visuais e sonoros. Não sendo observado febre, dispnéia ou perda de peso. O quadro articular é caracterizado por claudicação e aumento de volume das articulações, principalmente as do carpo e tarso. A artrite pode ser uni ou bilateral (Brodie et al., 1998). Na forma mamária alguns animais podem apresentar mastite indurativa linfocítica, resultante de um aumento, simétrico e firme da glândula mamária, que difere clinicamente da mastite causada por infecção bacteriana. A doença resulta em redução da produção de leite, que é causada possivelmente pelo bloqueio dos ductos da teta pelo acúmulo de linfócitos e fibrose circunferencial (Oliver et al., 1981, Cutlip et al., 1998). A mamite caracteriza-se pelo endurecimento difuso do úbere e pela presença de pequenos nódulos, só identificados pela cuidadosa palpação (Brodie et al., 1998; Moojen, 2001; Torsteinsdottir et al., 2007). 2.8 ALTERAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS Os principais órgãos-alvo da infecção viral, pulmão e cérebro são os mais afetados apresentando diversas alterações macro e microscópicas derivadas da infiltração e proliferação de células mononucleares (Moojen, 2001). À necropsia, os pulmões de ovinos com infecção crônica de lentivírus pesam frequentemente, duas a três vezes o peso normal, são enfisematosos, não colapsam quando removidos do animal e frequentemente demonstram pequenos (1 a 2 mm) focos 20

21 cinzentos na superfície pleural, difusamente espalhados, que exibem, ao corte, superfície granular e seca. Esses órgãos têm uma consistência densa e borrachosa, mas não parecem estar consolidados. Microscopicamente, estas lesões são caracterizadas pela infiltração e acúmulo de linfócitos e macrófagos dentro do septo alveolar, caracterizando uma pneumonia intersticial difusa e crônica (Brodie et al., 1998; Jones et al., 2000; Moojen, 2001; CFSPH, 2007). Podem apresentar nódulos na via aérea inferior ou ao redor de vasos sangüíneos, e os linfonodos mediastínicos e traqueobrônquicos são geralmente aumentados e edematosos. Pneumonia bacteriana secundária pode mascarar as lesões primárias (CFSPH, 2007). Ocorre hipertrofia do tecido conjuntivo e consequente engrossamento das paredes alveolares. Essas lesões revelam que a perda da elasticidade e compressibilidade, como também a cor acinzentada, são causadas por um grande aumento na espessura das paredes alveolares. Esse espessamento pode ser tão grande que os espaços alveolares ficam obliterados. As células de revestimento dos alvéolos próximos aos brônquios tendem a sofrer tumefação e tornarem-se cuboides (Jones et al., 2000). Quanto ao sistema nervoso, a lesão típica vista é uma meningoleucoencefalite não supurativa com desmielinização secundária (Moojen, 2001). Num exame geral, o cérebro e medula espinhal usualmente aparecem normais. Histologicamente, infiltração inflamatória linfoplasmacítica das leptomeninges, frequentemente envolve ambos o cérebro e medula espinhal, e formação nodular linfocítica no plexo coróide, são observados no início e como características patológicas subclínicas da doença (Constable et al., 1996). Nas articulações há hiperplasia sinovial com edema, hiperemia, linfocite subsinovial e infiltração celular são achados histológicos comuns (Brodie et al., 1998). Nas glândulas mamárias há hiperplasia folicular e alguma fibrose (Moojen, 2001). O úbere pode estar difusamente endurecido e os linfonodos relacionados ao úbere, aumentados (CFSPH, 2007). Ocorre uma hiperplasia folicular generalizada nos linfonodos e baço, e podem ser detectados infiltrados linfoides em praticamente todos os órgãos (Jones et al., 2000). 21

22 2.9 DIAGNÓSTICO Observam-se as manifestações clínicas como pneumonia, artrite, mamite ou encefalite, dados epidemiológicos e manejo dos animais. Porém, por se tratar de uma doença crônica, em que muitos animais permanecem assintomáticos, o diagnóstico da MV só é confirmado após a realização de testes laboratoriais (Pinheiro, 2001). A forma respiratória deve ser diferenciada, principalmente, da adenomatose pulmonar. Apesar de haver diferenças nas lesões macroscópicas das duas doenças o diagnóstico diferencial deve ser feito pelo estudo histológico ou pelo isolamento do MVV. A forma nervosa deve ser diferenciada da listeriose, polioencefalomalacia, ataxia enzoótica por carência de cobre e abscessos do sistema nervoso central. No caso de artrites e mastites deve ser realizado o diagnóstico diferencial com agentes bacterianos (Moojen, 2001). Os ovinos infectados podem ser diagnosticados diretamente, através da detecção de proteínas ou ácido nucléico ou por isolamento do vírus, através de cultivo celular, microscopia eletrônica, reação em cadeia de polimerase (PCR), hibridização in situ, histopatologia e imunohistoquímica e indiretamente, com base na presença de anticorpos, por imunodifusão em gel de agarose (IDGA), imunofluorescência indireta (IFI) e ensaios imunoenzimáticos (ELISA) (Demartini et al., 1999; Dantas et al., 2005). Pelas características da infecção persistente, a forma mais prática de diagnóstico é a sorologia, pois a presença de anticorpos demonstra indiretamente a existência de infecção (Callado et al., 2001). A infecção pelos LVPR é caracterizada pela existência de animais soropositivos aparentemente saudáveis, sendo assim a sorologia é o meio mais frequentemente utilizado para diagnóstico laboratorial da infecção, sendo o IDGA o teste recomendado para diagnóstico e monitoração da doença (OIE, 2007). No caso das técnicas sorológicas, como IDGA e ELISA, é importante a utilização de testes diagnósticos que contenham como antígeno a glicoproteína de superfície gp135 do MVV e seu respectivo soro padrão (Moojen, 2001). O IDGA baseia-se na migração do antígeno e anticorpo através do gel de agarose. O encontro dos reagentes, em proporções ótimas, leva à formação de complexos antígeno-anticorpo insolúveis que precipitam, formando-se uma linha ou banda de precipitação visível (Tortora et al., 2000). Recomendado pela OIE, por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas, o IDGA é a forma de diagnóstico mais utilizada em todo mundo, principalmente em programas de 22

23 controle da doença que já são empregados em vários países (Moojen, 1995). Além da fácil aplicabilidade o IDGA tem alta especificidade, o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos de triagem (Varea et al., 2001). O teste IDGA pode ser utilizado para a detecção de anticorpos anti-mvv tanto no soro sanguíneo quanto no colostro de animais infectados, e a presença de anticorpos no colostro pode ser utilizada na detecção da infecção no rebanho (Alkan & Tan, 1998). Comparando-se o diagnóstico realizado através do IDGA e ELISA, verifica-se que o ELISA apresenta uma maior sensibilidade, reprodutibilidade e proporciona automação, permitindo-se testar muitas amostras rapidamente. Devido a essas características, tornou-se o método de eleição para exame de um grande número de amostras. Existem vários tipos de ELISA, como o direto, indireto, duplo sanduíche direto e o ELISA duplo sanduíche indireto (Dantas et al., 2005). Diferentemente das técnicas sorológicas apresentadas acima, os métodos moleculares buscam a detecção de proteínas ou ácidos nucléicos pertencentes ao vírus. Dentre eles pode-se destacar a PCR e o Wester-Blotting. A reação em cadeia de polimerase possui alta sensibilidade e especificidade, sendo indicado para o diagnóstico dessa enfermidade em animais de alto valor zootécnico e para aqueles que o resultado de outros testes não tenham sido conclusivos (Moojen, 2001). Vários trabalhos têm demonstrado o sucesso do uso da técnica de PCR na detecção do DNA proviral dos LVPR. A PCR permite a identificação por amplificação direta de parte do ácido nucléico viral específica de fluidos e tecidos de um animal infectado (Pinheiro, 2001). A detecção de infecção por LVPR através de PCR é indicativa de uma infecção persistente e é dependente da quantidade amplificada da sequência alvo e da especificidade do primer. A técnica de PCR também é bastante versátil e já foi adaptada para vários tipos de amostras clínicas, como sangue, leite, sêmen e outros tecidos (Barlough et al., 1994; Rimstad et al., 1993; Wagter et al., 1998; Travassos et al.,1999; Extramiana et al., 2002). Entretanto, em se tratando de animais jovens em estágios iniciais da doença, as amostras sanguíneas são mais eficientes para a detecção de DNA proviral (Wagter et al., 1998). O isolamento viral em cultivo celular representa um diagnóstico determinante do vírus, porém esta técnica é demorada, dispendiosa, e requer a implantação e manutenção de cultivos celulares especiais (Knowles, 1997). Geralmente os LVPR podem ser isolados de animais vivos pelo co-cultivo de células como leucócitos do sangue 23

24 periférico, células somáticas de leite, com células de plexo coróide ovino para MVV ou células de membrana sinovial caprina para o CAEV (Pinheiro, 2001). Os exames anátomo histopatológico e imunohistoquímico têm sido utilizados para auxiliar o diagnóstico de infecções por lentivírus de pequenos ruminantes (Pinheiro, 2001). Georgsson & Palsson (1971) fizeram um estudo histopatológico em ovinos infectados natural e experimentalmente com MVV e obtiveram como principais achados uma inflamação intersticial crônica com densa infiltração celular, hiperplasia do músculo liso no septo alveolar e hiperplasia linfóide perivascular e peribronquial. Os pulmões infectados pelo MVV podem apresentar infiltração difusa de células linfóide e macrófagos no interstício pulmonar, com acúmulo peribronquiolar e perivascular local. A glândula mamária demonstra pronunciada hiperplasia linfóide e infiltração de células mononucleares (Carrozza et al., 2003) PROFILAXIA E CONTROLE O comércio dos animais é considerado o fator de maior risco na propagação da infecção por LVPR entre os rebanhos. A transmissão por máquinas de ordenhas contaminadas, como também as roupas, calçados e equipamentos utilizados pelos tratadores são importantes fontes de infecção, com as quais não se tem muita preocupação (Peterhans et al., 2004). Após introdução dos LVPR em um rebanho, a prevalência de animais soropositivos e clinicamente afetados, bem como da intensidade das alterações são bastante variadas, dependendo de fatores relacionados à intensidade de estresse, tipo de nutrição e condições gerais de higiene (Callado et al., 2001). O diagnóstico e separação ou descarte dos animais soropositivos associado ao uso de certas práticas de manejo, especialmente das crias, e testes periódicos dos animais são os melhores meios implantados para prevenir a disseminação de LVPR (Callado et al., 2001). Nos plantéis suspeitos ou sabidamente positivos, algumas recomendações têm sido adotadas, com resultados bastante variados: separar as crias imediatamente após o nascimento, evitar o contato com secreções e isolá-las dos adultos; administrar colostro termicamente tratado de mães não infectadas ou de vacas; alimentar as crias com substitutos do leite; testar os animais a intervalos regulares e separar ou eliminar os positivos; adotar a linha de ordenha; controlar a monta com reprodutores positivos; e 24

25 usar material estéril, como seringas e agulhas, instrumentos cirúrgicos, tatuadores entre outros (Callado et al., 2001). 25

26 3 JUSTIFICATIVA A ovinocultura é uma atividade amplamente praticada, visando à produção de carne, leite e pele. O interesse pela exploração de ovinos vem aumentando nos países desenvolvidos, onde já é significativo o uso de tecnologias para aumentar a produção. No Brasil, a ovinocultura tem maior representatividade nos estados da Bahia, Ceará, Piauí e Pernambuco, Rio grande do Norte, Rio Grande do Sul, Paraná e Mato Grosso do Sul. As lentiviroses são doenças crônicas que acometem pequenos ruminantes causando prejuízos econômicos nos rebanhos. É de conhecimento a realização de pesquisas voltadas a artrite encefalite caprina (CAE) visando, principalmente, a obtenção de um diagnóstico precoce e aplicação de medidas de prevenção e controle adequadas. No tocante à MVV, em ovinos, pouco se conhece sobre sua prevalência, principalmente em rebanhos mestiços, os quais acredita serem mais resistentes a enfermidades. Na doença Maedi-Visna, a forma pulmonar é a mais importante, causando doença respiratória progressiva que afeta o desenvolvimento do animal, bem como sua produção. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo detectar o vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmão de ovinos provenientes de abatedouro na Região Metropolitana de Fortaleza, buscando uma nova alternativa diagnostica para essa doença e contribuindo para sua prevenção e controle. 26

27 4 HIPOTESE CIENTIFICA de ovinos. O vírus Maedi-Visna pode ser detectado no lavado bronco-alveolar de pulmão 27

28 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Detectar o vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar as lesões macroscópicas presentes nas amostras pulmonares; Realizar o lavado bronco-alveolar para obtenção das células de interesse; Comparar a quantidade de células somáticas presentes nas amostras do lavado bronco-alveolar de animais positivos e negativos para infecção pelo Maedi- Visna; Realizar a analise molecular do sobrenadante obtido no cultivo celular. 28

29 6 CAPÍTULO 1 Detecção do vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos Detection of Maedi Visna Virus in bronchoalveolar lavage of sheep lungs Períodico: Revista Brasileira de Medicina Veterinária (Submetido em 19 de outubro de 2012) 29

30 DETECÇÃO DO VÍRUS MAEDI-VISNA NO LAVADO BRONCO-ALVEOLAR DE PULMÕES OVINOS DETECTION OF MAEDI VISNA VIRUS IN BRONCHOALVEOLAR LAVAGE OF SHEEP LUNGS Gabrielle Rosemblit Martins 1, Maria Fátima da Silva Teixeira², Igor Ciríaco Barroso¹, Kelma Costa Souza³, Rebeca Cavalcante Marinho¹ e Rosivaldo Quirino Bezerra Junior 4 ABSTRACT. Maedi-Visna is a disease multisystemic character caused by Maedi Visna Virus, a lentivirus belonging to the Retroviridae family, that preferentially infects cells of the mononuclear phagocyte system. The infected animal may show lesions in the lungs, joints, brain and mammary glands, singly or not, but usually the animal doesn t shows symptoms, and should be resorted to laboratory tests for diagnosis. Seeking to demonstrate the presence of this virus in herds in this region, the aim of this study was to detect the presence of the Maedi-Visna Virus in bronchoalveolar lavage of sheep lungs from slaughterhouse in the Metropolitan Region of Fortaleza. For this purpose, samples of sheep lungs were collected from slaughterhouse in the region, did bronchoalveolar lavage and cultivation of the cells obtained. These samples were subjected to DNA extraction and amplification by Nested-PCR. The presence of proviral DNA was confirmed in six (10,48%) of the 58 samples analyzed, demonstrating the presence of virus Maedi-Visna in bronchoalveolar lavage, and reaffirming the importance of airway in the transmission of this pathogen. Thus, samples of bronchoalveolar lavage can be used in order to diagnose this disease, and the detection of proviral DNA a conclusive diagnosis. KEY WORDS: Pneumonia, Slaughterhouse, Nested-PCR. ¹Médico Veterinário, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, Ceará, Brasil. rmgabrielle@hotmail.com; igorcbarroso@yahoo.com.br; beca.marinho@hotmail.com mestrandos bolsistas CAPES e FUNCAP. ²Médico Veterinário, Dra. Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, Ceará, Brasil. mfteixeira@hotmail.com Orientadora, bolsista de Produtividade CNPq. ³Zootecnista, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, Ceará, Brasil. kelma_zoo@hotmail.com doutoranda bolsista FUNCAP. 4 Médico Veterinário, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, , Fortaleza, Ceará, Brasil. junior_medvet2009@hotmail.com doutorando bolsista CAPES. RESUMO. Maedi-Visna é uma doença de caráter multissistêmico causada pelo vírus Maedi-Visna, um lentivírus pertencente à família Retroviridae, que infecta preferencialmente as células do sistema fagocítico mononuclear. O animal infectado pode apresentar lesões nos pulmões, articulações, glândulas mamárias e cérebro, isoladamente ou não; porém, normalmente, o animal se apresenta assintomático, devendo-se recorrer a testes laboratoriais para seu diagnóstico. Buscando-se demonstrar a presença desse vírus nos rebanhos dessa região, o objetivo desse trabalho foi detectar a presença do vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos provenientes de abatedouro da Região Metropolitana de Fortaleza. Para tanto, foram 30

31 coletadas amostras de pulmões ovinos em abatedouro da região, realizado lavado bronco-alveolar e posterior cultivo das células obtidas. Essas amostras foram submetidas à extração de DNA e amplificação por Nested-PCR. A presença do DNA pró-viral foi confirmada em seis amostras (10,48%) das 58 analisadas, demonstrando a presença do vírus Maedi-Visna no lavado bronco-alveolar, e reafirmando a importância da via respiratória na transmissão desse patógeno. Dessa forma, amostras de lavado bronco-alveolar podem ser utilizadas visando-se diagnosticar essa doença, sendo a detecção do DNA pró-viral um diagnostico conclusivo. PALAVRAS CHAVE: Pneumonia, Abatedouro, Nested-PCR. INTRODUÇÃO Maedi-Visna (MV) é uma doença que acomete ovinos, caracterizada por infecção lenta e progressiva, causada pelo vírus Maedi-Visna (MVV), um vírus não oncogênico pertencente à família Retroviridae e ao gênero Lentivirus (Pasick, 1998). Essa denominação originou-se na Islândia, e refere-se à dispnéia associada à pneumonia intersticial progressiva (Maedi) e a desorientação (Visna) devido à meningoencefalite (Sigurdsson, 1954; Gudnadottir, 1974; Dawson, 1980). Podem ocorrer quatro formas clínicas da doença: respiratória, nervosa, articular e mamária, associadas ou não (Callado et al., 2001; Moojen, 2001). Maedi é a manifestação clínica mais comum da infecção, o animal apresenta perda de condição corporal, taquipnéia, dispnéia e emaciação. Outros sintomas como febre, tosse e corrimento nasal estão associados a uma infecção bacteriana secundária (Christodoulopoulos, 2006). Devido ao caráter crônico dessa enfermidade, são necessários testes laboratoriais para um diagnóstico preciso. Podem-se utilizar testes diretos como a reação em cadeia da polimerase (PCR), imunohistoquímica ou isolamento em cultivo celular, ou indiretos, com base na presença de anticorpos, como imunodifusão em gel de agarose (IDGA), imunofluorescência indireta (IFI) e ensaios imunoenzimáticos (ELISA) (Demartini et al., 1999; Dantas et al., 2005). A PCR possui alta sensibilidade e especificidade, sendo indicada para o diagnóstico em animais de alto valor zootécnico e para aqueles que o resultado de outros testes não tenham sido conclusivos (Moojen, 2001). Vários trabalhos têm demonstrado o sucesso do uso dessa técnica na detecção do DNA pró-viral em fluidos e tecidos de um animal infectado, como em sangue, leite, sêmen, pulmões, SNC, úbere, articulações, rins e outros tecidos (Barlough et al., 1994; Rimstad et al., 1993; Wagter et al., 1998; Extramiana et al., 2002; Capucchio et al. 2003; Preziuso et al., 2003; Angelopoulou et al., 2006; Brellou et al., 2007). O objetivo deste trabalho foi detectar a presença do vírus Maedi-Visna em amostras de lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos naturalmente infectados, através da técnica de Nested-PCR. Área de estudo MATERIAL E MÉTODOS Fortaleza é a capital do Estado do Ceará, estando localizada no litoral atlântico, altitude média de 21 m, latitude e longitude , com área absoluta de 314,14 km². É a capital de maior densidade demográfica do país, com hab./km², sendo o município mais populoso do Ceará. Seu clima é subtropical quente e 31

32 úmido, com pluviosidade de mm, temperatura média de 26 a 28 C, sendo o período chuvoso compreendido nos meses de janeiro a maio (IPECE, 2011). Amostras Foram coletadas aleatoriamente 58 amostras de pulmões de ovinos em abatedouro, localizado na Região Metropolitana de Fortaleza. Os pulmões foram coletados, após o abate, de forma asséptica, efetuando-se a oclusão da traqueia com barbante, os espécimes foram armazenados individualmente, e conservados em caixas térmicas durante o transporte ao Laboratório de Virologia da UECE (LABOVIR) para processamento e análises. Lavado bronco-alveolar Os pulmões foram submetidos a três processos de lavagem externas visando sua higienização utilizou-se água corrente, hipoclorito de sódio a 2% e água destilada. Inicialmente, foram observadas as características macroscópicas pulmonares como consistência, coloração, peso, tamanho e outras alterações patológicas visando correlacionar com as alterações encontradas em pulmões de ovinos com Maedi-Visna. O lavado bronco-alveolar foi realizado utilizando-se 250 ml de solução fisiológica estéril (solução de cloreto de sódio 0,9%), por via intra-traqueal, realizandose massagens em todos os lobos para possibilitar a eficiente penetração da solução. Após este processo o lavado foi coletado em tubo Falcon de 15 ml estéril. A amostra obtida foi filtrada em gaze estéril e submetida à centrifugação a 1500 g durante dez minutos. Após essa primeira centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células sedimentadas no fundo do tubo foram transferidas para um novo tubo Falcon de 15 ml (Adaptado de Luján et al., 1993). As amostras que apresentaram grande quantidade de hemácias foram submetidas a uma segunda centrifugação utilizando água destilada, visando à lise dessas hemácias e obtenção somente das células de interesse, em sua maioria leucócitos. Inicialmente foi realizada a contagem de células viáveis, as transparentes e com membrana bem delimitada, utilizando o corante Azul de Tripan, em câmaras de Neubauer. A contagem total foi expressa pela média da contagem dos quatro quadrantes maiores da câmara de Neubauer multiplicado pela diluição (Adaptado de Luján et al., 1993). A analise dos dados referentes à contagem de células do lavado bronco-alveolar foram realizadas no programa Excel (Microsoft Office), utilizando-se o teste t-student para comparação das médias. Após verificação da viabilidade celular nas amostras, as células foram ressuspendidas em meio essencial mínimo (MEM) acrescido de antibacteriano 1% (peninilina-estreptmicina), antifúngico 0,5% (anfotericina B) e soro fetal bovino 10%, sendo distribuidas em placas de 24 poços, e incubadas a uma temperatura de 37º C com atmosfera de 5% CO 2. Foram observadas diariamente durante um período de sete dias, após o qual foram congeladas a -20 C e descongeladas a 30 C, sendo esse procedimento repetido por três vezes. O material coletado foi armazenado em eppendorffs de 2 ml e conservados a 20 C até subsequente uso. Nested-PCR O sobrenadante celular obtido e conservado a -20 C foi descongelado e utilizado para a etapa de extração do DNA pró-viral. Uma alíquota de um ml desse 32

33 material, foi centrifugado 2000 g por 5 minutos, e o pellet obtido ressuspenso em 500 µl de PBS e centrifugado a 2000 g por 5 minutos. Após essa lavagem, um ml de tampão hipertônico foi acrescido ao pellet obtido por dois minutos a temperatura ambiente seguido por centrifugação a 1500 g por 10 minutos. O DNA celular foi extraído utilizando-se 125 µl de tampão de PCR, sendo o material incubado a 56ºC por 60 minutos com 2,5 µl de proteinase K em banho-maria. A proteinase K foi desnaturada a 95ºC por 10 minutos. O DNA extraído foi estocado inicialmente a 4 C durante 24 horas, e posteriormente armazenado a -20ºC até sua utilização (Adaptado de Castro, 1998). Para detecção do DNA pró-viral foi realizada a Nested-PCR utilizando primers para a região gag, sendo realizada em duas etapas de amplificação. Os primers utilizados para amplificar esse gene foram desenhados e confeccionados de acordo com Saltarelli et al., Os primers externos GEX5 (5 - CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3 ) e GEX3 (5 - TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3 ) foram utilizados na primeira amplificação, e os primers internos GIN5 (5 -GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3 ) e GIN3 (5 -ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC- 3 ) foram utilizados na segunda amplificação. A amplificação foi realizada utilizando-se o termociclador (Biocycler ) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por cinco minutos, seguido de desnaturação a 94º C por um minuto, anelamento dos primers a 56ºC por um minuto e extensão do DNA a 72ºC por 45 segundos com extensão final a 72ºC por sete minutos. O primeiro e segundo round da PCR foram realizados em 35 ciclos sob as mesmas condições anteriores. Para cada amplificação, um controle positivo e um controle negativo de MVV- K1514 foram utilizados em paralelo com as amostras. Após a amplificação os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio em tampão TBE. Esse experimento foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais, da Universidade Estadual do Ceará, sob o número de protocolo /57. RESULTADOS E DISCUSSÃO Detecção do MVV no lavado bronco-alveolar Para um diagnóstico definitivo dessa doença deve associar a sintomatologia, o histórico clínico, achados macroscópicos e microscópicos característicos, a testes moleculares e sorológicos que comprovem a presença do vírus ou de anticorpos contra o mesmo (Christodoulopoulos, 2006). Estudos realizados tem demonstrado a presença do MVV em vários órgãos como pulmões, SNC, úbere, articulações, rins, fígado, coração, baço, medula óssea, e na membrana nictitante (Capucchio et al. 2003; Preziuso et al., 2003; Angelopoulou et al., 2006; Brellou et al., 2007), e em diferentes tipos de células como monócitos, macrófagos, fibroblastos, células dendríticas, epiteliais, endoteliais e adipócitos (Carozza et al., 2003; Brellou et al., 2007). Corroborando com esses resultados, a presença do DNA pró-viral foi confirmada, através da técnica de Nested-PCR, em seis amostras de lavado bronco-alveolar das 58 analisadas neste trabalho, o que representa 10,34% de positividade (Figura 1), e demonstra a presença dessa infecção em propriedades da Região Metropolitana de Fortaleza. Justificando, assim, a necessidade 33

34 de implementação de medidas de controle adequadas, visando obter uma melhor produtividade e condição sanitária desses animais. Na figura 1 verifica-se duas amostras positivas isoladas de material procedente do lavado bronco-alveolar de pulmões ovinos provenientes de abatedouro da Região Metropolitana de Fortaleza, o que confirma a existência da virose no rebanho cearense, demonstrando a necessidade de implementação de medidas de controle eficazes visando impedir a disseminação da mesma. A persistência do vírus Maedi-Visna dentro das células do sistema fagocítico mononuclear como alvo primário e expressão viral somente ativada após a diferenciação do monócito a macrófago favorece a presença do vírus dentro dessas células em estado latente por um período indeterminado (Christodoulopoulos, 2006). Dessa forma, nesse experimento após obtenção dos leucócitos através do lavado broncoalveolar, e posterior cultivo, foi possível detectar a presença do material genético do vírus utilizando a amplificação da região correspondente ao gene gag, um amplicon de 190 pb, compatível com o de Maedi-Visna. Contagem de células somáticas e viabilidade celular Após separação das células do lavado bronco-alveolar, foi verificada a quantidade e a viabilidade das células obtidas. As amostras onde foi detectada a presença do MVV apresentaram um pequeno aumento na quantidade de células, com média de 2,98 x 10 7, enquanto que as amostras negativas apresentaram média de 2,40 x Porém, quando comparadas estatisticamente, através do teste de t-student, utilizando-se o programa Excel (Microsof Office), observou-se que esse resultado não foi significativamente diferente. Esse achado corrobora com o de Lujan et al. (1993), que também encontrou um leve aumento na celularidade do lavado bronco-alveolar de animais soropositivos, porém não foi significativa. Em uma analise mais detalhada, os mesmos autores, verificaram que os linfócitos e neutrófilos encontravam-se aumentados, enquanto que os macrófagos apresentavam-se em menor número, nos lavados dos animais infectados. Katsoulos et al. (2009), analisando o lavado bronco-alveolar de animais infectados pelo MVV, verificou que a porcentagem de macrófagos era significativamente menor, e a de linfócitos significativamente maior, quando comparados com o lavado de animais sadios. Analise macroscópicas dos pulmões Macroscopicamente, os pulmões os pulmões do presente estudo em que o MVV foi detectado, apresentaram-se duas a três vezes mais pesados que pulmões sadios, com coloração variando de rosa a esbranquiçado. Quanto à consistência, os pulmões com lesões mais extensas apresentaram aspecto borrachoso, e os pulmões com poucas lesões, apresentaram aspecto esponjoso, similar ao aspecto de um pulmão sadio. As principais lesões encontradas foram focos hemorrágicos, aspecto hepatizado, áreas de enfisema, e bordas esbranquiçadas (Figura 2), alterações compatíveis com as lesões causadas por esse vírus, e que corroboram com os achados de Azizi et al. (2012), que analisou 50 pulmões coletados em abatedouro, e observou que os órgãos infectados apresentavam consistência borrachosa e firme, coloração variando de rosa a branco, duas a três vezes mais pesados, lesões nos lobos diafragmáticos, aumento dos linfonodos associados, e lesões esbranquiçados com diâmetro variando de 1-2 mm. 34

35 CONCLUSÃO Amostras do lavado bronco-alveolar de ovinos naturalmente infectados foram positivos para Nested-PCR de lentivírus de pequenos ruminantes, apresentando amplicon de aproximadamente 190 pares de base e lesões macroscópicas compatíveis com as causadas por esse vírus. AGRADECIMENTOS A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro. A Universidade Estadual do Ceará por disponibilizar condições técnica e pessoal para realização deste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Angelopoulou, K.; Brellou, G.D.; Vlemmas, I. Detection of Maedi-Visna Virus in the kidneys of naturally infected sheep. Journal of Comparative Pathology, 134: , Azizi, S.; Tajbakhsh, E.; Fathi, F.; Oryan, A.; Momtaz, H.; Goodarzi, M. Maedi in slaughtered sheep: A pathology and polymerase chain reaction study in southwestern Iran. Tropical Animal Health and Production, 44: , Barlough, J.; East, N.; Rowe, J. D.; Vanhoosear, K.; Derock, E.; Bigornia, L.; Rimstad, E. Double-nested polymerase chain reaction for detection of caprine arthritisencephalitis virus proviral DNA in blood, milk and tissues of infected goats. Journal Virological Methods, 50:69-77, Brellou G.D., Angelopoulou K., Poutahidis T., Vlemmas I. Detection of Maedi-Visna Virus in the liver and heart of naturally infected sheep. Journal of Comparative Pathology, 136:27-35, Brodie, S. J.; De La Concha-Bermejillo, A.; Snowder, G. D. Current concepts in the epizootiology, diagnosis, and economic importance of ovine progressive pneumonia in North America: a rewiew. Small Ruminant Research. 27:1-17, Callado, A. K. C.; Castro, R. S.; Teixeira, M. F. S. Lentivírus de pequenos ruminantes (CAEV e Maedi-Visna): revisão e perspectivas. Pesquisa Veterinária Brasileira. 3:87-97, Capucchio M.T., Sanna E., Sanna M.P., Farigu S., Minelli R., Guarda F. Maedi-visna virus detection in ovine third eyelids. Journal of Comparative Pathology, 129:37-43, Carrozza M.L., Mazzei M., Bandecchi P., Arispici M., Tolari F. In situ PCR-associated immunohistochemistry identifies cell types harbouring the Maedi-Visna virus 35

36 genome in tissue sections of sheep infected naturally. Journal of Virological Methods, 107: , 2003 Castro, R. S. Lentivírus de pequenos ruminantes: ensaios imunoenzimáticos, perfil sorológico e inferências filogenéticas. Tese. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, p. (Disponível em: < Christodoulopoulos, G. Maedi Visna: Clinical review and short reference On the disease status in Mediterranean countries. Small Ruminant Research, 62:47-53, Dantas, T. V. M.; Araújo, S. A. C.; Silva, J. B. A.; Ricarte, A. R. F.; Teixeira, M. F. S. Formas de diagnóstico da Maedi-Visna. Ciência Animal, 15:89-97, Dawson, M., Maedi/Visna: a review. Veterinary Record. 106: , DeMartini, J. C.; Halsey, W.; Boshoff, C.; Dennis, Y.; Howell, M. D. Comparison of a Maedi- Visna virus CA-TM fusion protein ELISA with other assays for detecting sheep infected with North American ovine lentivírus strains. Veterinary Immunology and Immunopathology, 71:29-40, Extramiana, A. B,; Gonzalez, L.; Cortabarria, N.; Garcia, M.; Juste, R. A., Evaluation of a PCR technique for detectionof Maedi-Visna proviral DNA in blood, milk and tissues samples naturally infected sheep. Small Ruminante Research, 44: , Gudnadottir, M., Visna Maedi in sheep. Progr. Med. Virol. 18: , IPECE, Instituto de Pesquisa e Estratégia Econômica do Ceará. Disponível em: < Acesso em 10 de outu bro de Jones, T. C.; Hunt, R. D.; King, N. W. Patologia Veterinária. 6a ed. São Paulo, Manole. 2000, 341p. Katsoulos, P. D.; Christodoulopoulos, G.; Kontopidis, G.; Minas, A.; Tzivara, A.; Kritas, S. K. Leukocyte counts in bronchoalveolar lavage fluid obtained from normal and Maedi-Visna-infected sheep. Veterinary Clinical Pathology, 38/3: , Luján, L.; Begara, I.; Collie, D. D. S.; Watt, N. J. Phenotypic analysis of cells in bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood of maedi visna-infected sheep. Clinical & Experimental Immunology, 91: , Moojen, V. Maedi-Visna dos ovinos. In: Riet-Corrêa, F. Doenças de Ruminantes e Eqüinos. São Paulo, Varela, v.1. p ,

37 Pasick, J. Maedi-visna virus and caprine Arthritis-Encephalitis virus: Distinct species or quasispecies and its implications for laboratory diagnoses. Canada Journal Veterinary, 62: , Pinheiro, R. R. Vírus da artrite encefalite caprina: Desenvolvimento e padronização de ensaios imunoenzimáticos (ELISA e Dot-Blot) e estudo epidemiológico no Estado do Ceará. Tese Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, p. (Disponível em: < Preziuso S., Taccini E., Rossi G., Renzoni G., Braca G., Experimental Maedi Visna Virus infection in sheep: a morphological, immunohistochemical and PCR study after three years of infection. European Journal of Histochemistry, 47: , Rimstad, E., East, N.E., Torten, M., Higgins, J., Derock, E., Pedersen, N.C. Delayed seroconversion following naturally acquired caprine arthritisencephalitis virus infection in goats. American Journal Veterinary Research. 54(11): , Saltarelli, M., Querat, G., Konings, D.A., Vigne, R., Clements, J.E. Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology, 179: , Sigurdsson, B. Maedi, a slow progressive pneumonia of sheep: an epizzootiological and a pathological study. British Veterinary Journal, 110: , Wagter, L. H. A.; Jansen, A.; Bleumink Pluym, J. A.; Lenstra, L. A.; Houwers, D. J. PCR detection of lentiviral gag segment DNA in the white blood cells of sheep and goats. Veterinary Research Communication, 22: , Figura 1 - Detecção do DNA pró-viral do MVV nas amostras de lavado bronco-alveolar. Linha 1 corresponde ao marcador molecular 100pb, linha 2 controle negativo, linha 10 ao controle positivo, linha 4 e 9 as amostras positivas. 37

38 Figura 2 - Aparência macroscópica dos pulmões ovinos infectados pelo MVV. Pulmão 23 apresentando coloração esbranquiçada, aumento de tamanho, pontos hemorrágico e bordas esbranquiçadas. Pulmão 36 com coloração rosa, áreas de enfisema, pontos hemorrágicos e bordas esbranquiçadas. 38