UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ANDERSON CARVALHO DE FARIAS LEVANTAMENTO SOROLÓGICO E ISOLAMENTO DE MAEDI-VISNAVÍRUS EM OVINOS NATURALEMNTE INFECTADOS NO ESTADO DO PARÁ, BRASIL FORTALEZA 2015

2 2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Sistema de Bibliotecas Farias, Anderson Carvalho de. Levantamento sorológico e isolamento de MaediVisna vírus em ovinos naturalmente infectados no estado do Pará, Brasil [recurso eletrônico] / Anderson Carvalho de Farias CD-ROM: il.; 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico com 46 folhas, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm). Dissertação (mestrado acadêmico) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof.ª Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira. Coorientação: Prof. Dr. Luiz Fernando de Souza Rodrigues. 1. Lentivírus. 2. IDGA. 3. Cultivo celular. 4. PCR. I. Título.

3 LEVANTAMENTO SOROLÓGICO E ISOLAMENTO DE MAEDI-VISNAVÍRUS EM OVINOS NATURALMENTE INFECTADOS NO ESTADO DO PARÁ, BRASIL 3

4 4 ANDERSON CARVALHO DE FARIAS LEVANTAMENTO SORÓGICO E ISOLAMENTO DE MAEDI-VISNA VÍRUS EM OVINOS NATURALMENTE INFECTADOS NO ESTADO DO PARÁ, BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientadora: Profª. Drª. Maria Fátima Silva Teixeira FORTALEZA 2015

5 5 A Deus autor da vida, único digno de toda honra glória e louvor. À minha amada mãe, meu maior tesouro nessa terra.

6 6 AGRADECIMENTOS A Deus que, através do dom da vida, deu-me a oportunidade de glorificar o Seu nome. Sempre me conduzindo por veredas de justiça. À minha mui amada mãe, Maria Carvalho de Farias, que é meu bem mais precioso, meu exemplo, meu porto seguro, que fez e sempre fará tudo para me ver feliz. À minha família que amo, pelo apoio e carinho que sempre dedicaram a mim, principalmente meus irmãos Márcio (IN MEMORIAN), Andréa, Marcos e minha prima Eliana. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo apoio financeiro. À Prof.ª Dr.ª Maria Fátima da Silva Teixeira, por ser muito mais que uma orientadora, uma segunda mãe. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). À Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), através do Projeto PROCAD/Casadinho. Ao Prof. Dr. Luiz Fernando de Sousa Rodrigues pelo apoio, carinho e co-orientação. À toda a equipe do Labovir pelo carinho com que me receberam e todo apoio durante a realização deste trabalho, em especial meu amigo Ronaldo, um verdadeiro irmão que o Senhor me presenteou. À irmã Fátima que abriu as portas de sua casa há dois anos para me acolher mesmo sem nunca ter me visto na vida. O Senhor é fiel para recompensá-la! À Igreja de Cristo Ministério Apostólico Nova Terra que me acolheu com tanto carinho e se tornou minha família. À minha amiga biomédica Flávia do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da UFRA, assim como as colegas médicas veterinárias residentes deste laboratório pelo apoio e dedicação na execução deste trabalho.

7 7 À toda equipe do Centro de Pesquisa de Caprinos e Ovinos do Pará (CPCOP) por todo suporte dado na realização deste trabalho. À equipe do Laboratório de Microbiologia da UFRA, pela disponibilidade em ceder sua infraestrutura para realização de algumas etapas deste trabalho. A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para o sucesso deste projeto, o meu muito obrigado!

8 8 RESUMO Com o aumento da demanda de carne ovina pelos países em desenvolvimento, a ovinocultura tem se expandido em várias partes do mundo, inclusive no Brasil. Atualmente, essa atividade tem crescido bastante na Região Norte do País também, sendo o estado do Pará o maior produtor da região. Entre os entraves para essa expansão destaca-se a Maedi-Visna, uma doença multissistêmica, crônica de notificação obrigatória de acordo com a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causada pelo Maedi-Visna vírus (MVV), que pode causar pneumonia, artrite, encefalite, emagrecimento progressivo e óbito. O diagnóstico pode ser feito pela imunodifusão em gel de agarose (IDGA), teste recomendado pela OIE, isolamento em cultivo celular e PCR, entre outros métodos. Devido à inexistência de tratamentos ou vacina efetivos, até o momento, a melhor forma de combate à enfermidade é através da prevenção e controle. Diante da importância da doença e das escassas informações sobre a situação das lentiviroses nos rebanhos da região norte do País, o objetivo deste trabalho foi realizar o primeiro levantamento sorológico de Maedi-Visna vírus no estado do Pará, bem como o primeiro isolamento deste lentivírus advindo de animais naturalmente infectados da região Norte do Brasil. Para tanto, foram coletadas 340 amostras de sangue de ovinos de quatro propriedades da mesorregião nordeste do estado do Pará e testadas pelo IDGA, obtendo-se cinco animais positivos, coletaram-se, então, leucócitos de dois destes animais. Estas células, foram então cocultivadas em membrana sinovial ovina. Realizou-se também Nested-PCR de sobrenadantes dos cultivos. Verificou-se no levantamento sorológico uma prevalência de 1,47% de positividade para MVV. Observou-se efeito citopático característico de lentivírus de pequenos ruminantes no cultivo celular e ainda se detectou a presença do DNA pró-viral de MVV através da Nested-PCR. Concluiu-se que o MVV circula no Estado do Pará, necessitando-se, portanto, tomar medidas de prevenção e controle mais efetivas nos rebanhos ovinos paraenses. Palavras-chave: Lentivirus. IDGA. Cultivo celular. PCR.

9 9 ABSTRACT With increasing demand for sheep meat by developing countries, sheep industry has expanded in various parts of the world, including Brazil. Nowadays, this activity has also been increased so much in Northern region of the country, due to Pará State is the largest producer in the region. Among obstacles to this expansion highlights Maedi-Visna, a multisystem disease, chronic notifiable according to World Organization for Animal Health (OIE), caused by Maedi-Visna lentivirus virus (MVV), which can cause pneumonia, arthritis, encephalitis, progressive weight loss and death. Diagnosis can be made by immunodiffusion in agarose gel (AGID) test recommended by WOAH, isolation in cell culture and PCR, among other methods. In the absence of effective treatment or vaccine so far, the best way to fight against disease is by preventing and control. Considering the importance of the disease and little information on the situation of lentiviruses in herds in the northern region of the country, the goal of this study was first serological survey for MVV in Pará State and at the prospect of positive animals, first isolation of this lentivirus arising from naturally infected animals of northern Brazil. So, they were collected 340 samples of sheep serum from four mesoregion northeastern properties in Pará State and tested by AGID, resulting in five positive animals. They were collected leukocytes from two of these animals and cultured in sheep synovial membrane. They were also held nested PCR supernatants from the samples culture. From serological survey a prevalence of 1.47% positivity for MVV. It was observed a characteristic cytopathic effect of lentiviral small ruminants in cell culture and it has been detected the presence of proviral DNA MVV by nested PCR. So, MVV circulation in Pará State needs, therefore, make better prevention and control of Pará sheep herds. Keywords: Lentivirus. AGID. Cell cuture. PCR.

10 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Detecção do DNA pró-viral do MVV nas amostras de sobrenadantes de cultivos celular de leucócitos de animais naturalmente infectados no estado do Pará Figura 1. Isolamento a partir de co-cultivo de leucócitos infectados em MSO. (A) Apresentando lise celular e efeito citopático característico de infecção por LVPR (seta); (B) Apresentando efeito citopático (seta)...34 Figura 2 Detecção do DNA pró-viral de MVV em sobrenadantes de cultivos celulares de animais naturalmente infectados no Estado do Pará. Linha 1: marcador molecular; linha 2: controle negativo; linha 3: sobrenadante do animal 1, 7 dias após o início do cultivo; linha 4: sobrenadante do animal 1, 63 dias após o início do cultivo; linha 5: sobrenadante do animal 2, 7 dias após o início do cultivo; linha 6: sobrenadante do animal 2, 34 dias após o início do cultivo e linha 7: controle positivo... 34

11 11 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Distribuição de frequência de ovinos positivos para Maedi-Visna vírus no teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) no Estado do Pará,

12 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIEV Anemia Infecciosa Equina BIV Vírus da Imunodeficiência Bovina CAEV Artrite Encefalite Caprina CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais DNA Ácido Desoxirribonucleico dutpase Difosfatase ECP Efeito Citopático EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Ensaio imunoenzimático env Gene que codifica as proteínas do envelope viral FAO Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação FIV Vírus da imunodeficiência Felina gag Gene viral que codifica as proteínas internas do vírus gp Glicoproteína HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IDGA Imunodifusão em Gel de Agarose IFI Imunofluorescência Indireta LABOVIR Laboratório de Virologia LTR Long Terminal Repeats LV-IFN Interferon Induzido pelo Lentivírus LVPR Lentivírus de Pequenos Ruminantes MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento MEM Meio Essencial Mínimo Mg Magnésio MSO Membrana Sinovial Ovina MV Maedi-Visna MVV Maedi-Visna Vírus OIE Organização Mundial da Saúde Animal ORFs Open Reading Frames PCR Reação em Cadeia de Polimerase PBS Solução salina fosfatada PNSCO Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos pol Gene que codifica as enzimas virais PPO Pneumonia Progressiva Ovina PS Penicilina e Estreptomicina rev Gene de regulação viral RNA Ácido Ribonucleico RPMI Roswell Park Memorial Institute SFB Soro Fetal Bovino SIV Vírus da Imunodeficiência Símia tat Gene de regulação viral vif Gene de regulação viral

13 13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA MAEDI-VISNA HISTÓRICO AGENTE ETIOLÓGICO EPIDEMIOLOGIA PATOGENIA SINAIS CLÍNICOS CARACTERÍSTICAS ANATOMO-HISTOPATOLOGICAS DIAGNÓSTICO PREVENÇÃO E CONTROLE JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPITULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS... 37

14 14 1 INTRODUÇÃO A ovinocultura tem sido desenvolvida em praticamente todos os continentes. A ampla difusão da espécie ovina se deve principalmente a seu poder de adaptação a diferentes climas, relevos e vegetações (VIANA, 2008). Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) a demanda da carne pelos países em desenvolvimento é crescente diante do crescimento demográfico e variações de preferências e hábitos alimentares (FAO, 2007). No Brasil a atividade apresenta um grande crescimento e conta com uma produção de quase 17 milhões de cabeças (IBGE, 2012). De acordo como o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) cada brasileiro consome, em média, 0,7kg de carne ovina por ano, o que coloca esse tipo de alimento na 5ª posição entre as carnes tradicionais (BRASIL, 2014). Porém, para a manutenção dessa situação, é extremamente importante a priorização de políticas sanitárias que permitam a regulamentação do comércio dos produtos, tanto no mercado interno quanto no externo (ARO; POLIZER e PENA, 2007; EMBRAPA, 2004). Neste contexto, o MAPA desenvolveu o Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos (PNSCO), que visa o fortalecimento da cadeia produtiva dessas espécies, pela adoção de ações de vigilância e defesa sanitária animal (BRASIL, 2004). Diversos fatores interferem na produção de ovinos, dentre os quais a Maedi-Visna (MV), uma enfermidade de notificação obrigatória de acordo com a lista da OIE (Organização Mundial da Saúde Animal) e que se encontra difundida nos rebanhos ovinos de vários países, sendo motivo de restrição no comércio internacional de produtos oriundos desta espécie animal (GIANGASPERO et al., 2011, MEKONNEN; SIRAK; CHACKA, 2010). A MV é uma doença causada por um lentivírus da família Retroviridae, sendo uma infecção multissistêmica com evolução crônica e sinais clínicos muitas vezes inaparentes. Os animais infectados podem apresentar pneumonia, artrite, a forma nervosa paralítica, desenvolver um quadro de emagrecimento progressivo, com consequente debilidade e vir a óbito (SIGURDSSON, 1954; SHEFFIELD et al., 1980; RAMÍREZ et al., 2012). Por se tratar de uma doença crônica, em que muitos animais permanecem assintomáticos, o diagnóstico da MV é feito pela observação de sinais clínicos associados à realização de testes laboratoriais (MOOJEN, 2001). Entre os métodos laboratoriais diretos destacam-se isolamento do vírus através de cultivo celular, microscopia eletrônica, reação em cadeia de polimerase (PCR) e imunohistoquímica. Entre os indiretos, com base na presença de anticorpos, tem-se a imunodifusão em gel de agarose (IDGA), que é o recomendado pela OIE,

15 15 ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e imunofluorescência indireta (IFI) (DeMARTINI et al., 1999; MOOJEN, 2001; DANTAS et al., 2005). Por não existir vacina ou tratamento eficaz para qualquer forma da MV, até o momento, a profilaxia constitui-se a forma mais adequada para a manutenção da sanidade dos rebanhos. Assim sendo, o diagnóstico e separação ou descarte dos animais soropositivos, associado ao uso de certas práticas de manejo, especialmente das crias, são os melhores meios implantados para prevenir a disseminação de lentivírus de pequenos ruminantes (CALLADO et al., 2001). Desta feita, as investigações epidemiológicas tornam-se essenciais para avaliar a prevalência e risco da disseminação da enfermidade no País. Portanto, este trabalho teve como objetivo realizar o primeiro levantamento sorológico de Maedi-Visna vírus no estado do Pará, bem como o primeiro isolamento deste lentivírus advindo de animais naturalmente infectados da região Norte do Brasil. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 MAEDI-VISNA Conhecida com diferentes denominações como Zwoergerziekte na Holanda (DE BÔER, 1975; HOUWERS, 1985), Jaagsiekte na África do Sul (VERWOERD et al., 1983) e Doença Pulmonar de Montanha ou Pneumonia Progressiva Ovina (PPO) nos Estados Unidos (CUTLIP; LAIRD, 1976), a Maedi-Visna é uma enfermidade que atinge preferencialmente os ovinos, caracterizada por uma infecção lenta e progressiva. A denominação Maedi-Visna, tem origem na Islândia, Maedi que significa dispneia, associada à pneumomia intersticial progressiva e Visna que significa prostação associada à meningoencefalite. Inicialmente, acreditava-se tratar-se de doenças distintas, porém, após o estabelecimento de suas etiologias verificou-se que se trata do mesmo patógeno sendo responsável por manifestações histopatológicas e clínicas distintas, denominando-se, então, Maedi-Visna (GUDNADOTTIR, 1974; DAWSON, 1980; QUINN et al., 2005; THORMAR, 2013). 2.2 HISTÓRICO O termo vírus lento ou lentivirus foi criado por Sigurdsson (1954) ao estudar o vírus Maedi-Visna (MVV), referindo-se às infecções causadas por retrovírus que desenvolvem infecções crônicas de evolução lenta, persistente, progressiva e degenerativa. Desta maneira o

16 16 MVV foi o primeiro lentivirus a ser isolado e caracterizado (SIGURDSSON, 1954; STRAUB, 2004; THORMAR, 2013). Apesar de existirem relatos anteriores de doenças com sintomatologia semelhante à da MV na África do Sul (MITCHELL, 1915) e Estados Unidos da América (MARSH, 1923), somente após um surto ocorrido na Islândia entre os anos de 1939 e 1952, em que morreram 150 mil animais e 650 mil foram sacrificados para controle da doença é que ela recebeu maior atenção (SIGURDSSON, 1954; STRAUB, 2004). No Brasil, os primeiros relatos dessa doença em ovinos ocorreram em 1988 e 1989 (DAL PIZZOL et al., 1989). A presença do vírus foi confirmada pelo posterior isolamento do vírus de ovinos (MOOJEN et al., 1996; MILCZEWSKI et al., 1997; ALMEIDA, 2003). 2.3 AGENTE ETIOLÓGICO O MVV é um vírus não oncogênico pertencente à família Retroviridae e ao gênero Lentivirus (PASICK, 1998; ICTV, 2014). Neste gênero estão inclusos vários outros vírus de importância veterinária e humana, como os vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV), da Anemia Infecciosa Equina (AIEV), da Doença de Jembrana e os das Imunodeficiências Humana (HIV), Bovina (BIV), Felina (FIV), Símia (SIV) (PRITCHARD; DAWSON, 2000), bem como o Lentivirus Puma (ICTV, 2014). Devido à grande similaridade entre o MVV e o vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e da capacidade de infectarem tanto ovinos quanto caprinos estes dois vírus têm sido denominados Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR)(PRITCHARD; DAWSON, 2000; RÁCZ, 2005). Os MVVs são pleomorfos, esferóides, envelopados, com nm de diâmetro, com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas duas moléculas idênticas de RNA, lineares, de cadeia simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg 2+ e proteínas do nucleocapsídeo. A forma do nucleocapsídeo é cilíndrica e não icosaédrica como nos outros retrovírus (CLEMENTS; PAYNE, 1994; GONDA et al., 1986). O genoma deste vírus é composto por genes codificantes para proteínas estruturais (gag e env), genes de regulação (tat, rev e vif) e genes codificantes para enzimas virais (pol). O gene gag codifica grupos específicos de antígenos, entre eles a matriz, capsídeo e nucleocapsídeo, enquanto o gene env codifica a glicoproteína de superfície responsável pela ligação do antígeno ao receptor celular. O gene pol codifica a transcriptase reversa, enzima responsável pela transcrição do RNA viral para uma cópia de DNA proviral, que irá integrar-

17 17 se ao genoma da célula hospedeira. Este último gene ainda codifica as enzimas integrase e dutpase (PEPIN et al., 1998; SOUZA et al., 2012). Os genes de regulação tat, rev e vif são referenciados como fases abertas de leitura ( open reading frames - ORFs) e codificam proteínas não estruturais responsáveis pela regulação da replicação viral. O DNA proviral resultante da transcrição reversa apresenta duas regiões terminais não codificadoras ( long terminal repeats ou LTR ) que são necessárias para a integração do provírus ao genoma celular (PEPIN et al., 1998; BORDERÍAS, 2004; SOUZA et al., 2012). O vírus apresenta ainda duas importantes proteínas: a glicoproteína de envelope gp135 e a nucleoproteína p28, que induzem a formação de anticorpos nos animais infectados (BRELLOU et al., 2007). 2.4 EPIDEMIOLOGIA Atualmente a MV ocorre em todos os principais países produtores de ovinos com exceção da Islândia, onde foi erradicado em 1965, após uma campanha de controle e erradicação executada durante 30 anos (PÉTURSSON, 1994), Austrália e Nova Zelândia, onde a doença nunca foi relatada (GREENWOOD et al., 1995; RADOSTITS et al., 2002). Os primeiros relatos da presença de MVV no Brasil datam de 1988 e 1989 em propriedades do Rio Grande do Sul com histórico de importação de ovinos vindos de países onde a doença já havia sido relatada. Nestas foram avaliadas 267 amostras de soro ovino pela técnica de IDGA, demonstrando que 10,48% dos animais eram positivos (DAL PIZZOL et al., 1989). Atualmente, tem-se relatos de anticorpos contra o MVV encontrados em ovinos nos estados do Rio Grande do Sul (DAL PIZZOL et al., 1989; RIBEIRO, 1993; FERNANDES et al., 2011), Paraná (SOTOMAIOR; MILCZEWSKI, 1997), Rio Grande do Norte (Da SILVA, 2003), Ceará (ALMEIDA et al., 1999; ARAÚJO; DANTAS; TEIXEIRA, 2004; PRIMO et al., 2006), Pernambuco (OLIVEIRA et al., 2006; COSTA et al., 2007), Bahia (MARTINEZ et al., 2009; MARTINEZ et al., 2011), Espírito Santo (BARIONI et al., 2009), São Paulo (LOMBARDI et al., 2009; LARA et al., 2013), Sergipe (D ALENCAR et al., 2008; MENDONÇA et al., 2013), Minas Gerais (MARQUES, 2006). Na região Norte do País, verificou-se uma prevalência de 0,9% (MOURA SOBRINHO et al., 2008) e 1,62% (MAZZINGHY, 2013) em Tocantins e 0% no Amazonas (LIMA, 2011).

18 PATOGENIA Os LVPR podem ser transmitidos tanto horizontal quanto verticalmente. A transmissão horizontal ocorre pela inalação de exsudatos respiratórios contendo vírus ou células infectadas. A vertical ocorre, principalmente, pela ingestão de leite e colostro contendo macrófagos infectados (ZINK; JOHNSON, 1994). Existe também a hipótese de transmissão sexual. Blacklaws et al. (2004) sugerem que a presença do vírus no sêmen pode ser devido à excreção de células epiteliais epididimais. Os resultados destes estudos mostraram que a infecção corrente ou inflamação nos testículos induz a liberação do MVV no sêmen. Após detectar o DNA proviral do lentivírus no sêmen de reprodutores infectados, Gregory et al. (2011), também sugerem a via sexual como provável via de disseminação do vírus principalmente devido à transmissão por monta natural ou pela utilização do sêmen contaminado na inseminação artificial. Estes vírus afetam, principalmente, os pulmões, úbere, articulações e cérebro, porém já foram identificados em gânglios linfáticos, baço, medula óssea, rins, pulmão e terceira pálpebra (EXTRAMIANA et al., 2002; CAPUCCHIO et al., 2003; PREZIUSO et al., 2003; ANGELOPOULOU et al., 2006). Os lentivírus adentram o organismo dos hospedeiros por via oral ou respiratória, alcançam a circulação, desenvolvendo mecanismos para sobrevivência frente à ação do sistema de defesa (CORTEZ-ROMERO et al., 2012). Os alvos celulares primários da infecção por MVV são as células da linhagem monocítico-fagocitária, nestas o vírus integra o seu DNA ao genoma celular. Entretanto, a expressão do gene viral só é ativada quando há maturação de monócitos a macrófagos (GENDELMAN et al., 1986; KENNEDY et al., 1987). Neste processo de diferenciação, quando os monócitos migram do sangue para o tecido, pode haver a ativação da transcrição, com produção de proteínas virais e vírions. Após a conversão em macrófagos, eles desenvolvem o papel de disseminadores do vírus por todo o organismo do hospedeiro pelo contato com outras células (GENDELMAN et al., 1985; VAN DER MOLEN; VECHT; HOUWERS, 1985). O MVV persiste dentro dos macrófagos e pode permanecer em estado latente por um período indeterminado (CHRISTODOULOPOULOS, 2006). A MV é caracterizada por uma proliferação linfóide e infiltração intersticial mononuclear dos órgãos afetados (BENAVIDES et al., 2006). A modulação da eficiência de genes virais é realizada por anticorpos antivirais e citocinas específicas como interferon induzido pelo lentivírus (LV-IFN), produzidas durante a replicação do vírus (NARAYAN et

19 19 al., 1992; ZINK; NARAYAN, 1989), contribuindo dessa forma para uma intensa inflamação vista nos tecidos afetados (ZINK; JOHNSON, 1994). A indução da resposta imunológica é variável e não protege contra a infecção (CALLADO; CASTRO; TEIXEIRA, 2001). Muitos ovinos permanecem portadores assintomáticos durante toda sua vida e de acordo com Christodoulopoulos (2006) somente uma porcentagem de 25-30% dos animais soropositivos desenvolvem os sinais clínicos. 2.6 SINAIS CLÍNICOS A maioria dos casos de MVV apresenta-se de forma subclínica, causando perdas econômicas significativas. A infecção se caracteriza por longo período de incubação e curso clínico demorado, lentamente progressivo, resultando em uma doença degenerativa crônica, multissistêmica (BRODIE, et al., 1998). Os sinais clínicos geralmente manifestam-se em animais adultos, normalmente com idades acima de três anos (DAWSON, 1987; MOOJEN, 2001), embora em rebanhos com grande número de animais com menos de um ano possa ser observado a ocorrência clínica da doença (ZINK; JOHNSON, 1994). A doença pode se apresentar sob quatro formas clínicas: respiratória, nervosa, articular e mamária, estas podem apresentar-se juntas ou separadas. A forma mais comum é a respiratória, na qual os ovinos podem apresentar tosse, dispnéia (após exercícios físicos), taquipnéia, consolidação pulmonar, som úmido à auscultação, comprometimento do estado geral e quadros secundários de pneumonia, decúbito e morte (DAWSON, 1987; CALLADO; CASTRO; TEIXEIRA, 2001; MOOJEN, 2001). A ocorrência de perda de lã, febre e corrimento nasal não são sinais de Maedi, a menos que infecção bacteriana secundária esteja presente (CHRISTODOULOPOULOS, 2006). O sistema nervoso é raramente acometido, apesar de ter sido comum no surto ocorrido na Islândia (BRODIE et al., 1998). Foi relatado em ovinos adultos geralmente como complicação da forma respiratória (ISHIZUKA et al., 2005), nestes casos os animais podem apresentar incoordenação, andar em círculos, postura anormal da cabeça, nistagmo, paresia gradual do membro posterior que progride para paralisia e morte. O apetite continua normal, porém ocorre perda de peso (MOOJEN, 2001). 2.7 CARACTERÍSTICAS ANATOMO-HISTOPATOLÓGICAS

20 20 Os principais e mais afetados órgãos-alvo da infecção viral, pulmão e cérebro, podem apresentar diversas alterações macro e microscópicas derivadas da infiltração e proliferação de células mononucleares (MOOJEN, 2001). Durante a necropsia observa-se pneumonia grave, com ausência de colabamento dos pulmões à abertura do tórax. Os pulmões podem apresentar-se expandidos, de forma que são observadas impressões marcadas das costelas na superfície pleural. Os pulmões ainda assumem aspecto pálido e pesado e os linfonodos traqueobrônquicos podem se apresentar aumentados (McGAVIN; ZACHARY, 2009). Microscopicamente, estas lesões são caracterizadas pela infiltração e acúmulo de linfócitos e macrófagos dentro do septo alveolar, caracterizando uma pneumonia intersticial difusa e crônica (BRODIE et al., 1998; JONES; HUNT; KING, 2000; MOOJEN, 2001; CFSPH, 2007). No sistema nervoso, a lesão típica observada é uma meningoleucoencefalite não supurativa com desmielinização secundária (MOOJEN, 2001). Num exame geral, o cérebro e medula espinhal usualmente aparecem normais. Histologicamente, infiltração inflamatória linfoplasmocítica das leptomeninges, frequentemente envolvendo o cérebro e medula espinhal, e formação nodular linfocítica no plexo coróide são observados no início e como características patológicas subclínicas da doença. O vírus pode infectar muitos outros tecidos, causando artrite linfocítica, mastite linfofolicular e vasculite (CONSTABLE et al., 1996; McGAVIN; ZACHARY, 2009). 2.8 DIAGNÓSTICO Inicialmente, podem-se fazer observações clínicas que se concentram na ocorrência de pneumonia, artrite, mastite, encefalite, emagrecimento crônico. Dados epidemiológicos e o manejo dos animais também devem ser observados. Porém, por se tratar de uma doença crônica, em que muitos animais permanecem assintomáticos, o diagnóstico da MV só é confirmado após a realização de testes laboratoriais (MOOJEN, 2001). Deve-se diferenciar a forma respiratória, principalmente, da adenomatose pulmonar. Apesar de haver diferenças nas lesões macroscópicas das duas doenças o diagnóstico diferencial deve ser feito pelo estudo histológico ou pelo isolamento do MVV. A forma nervosa deve ser diferenciada da listeriose, polioencefalomalacia, ataxia enzoótica por carência de cobre e abscessos do sistema nervoso central. No caso de artrites e mastites deve ser realizado o diagnóstico diferencial com agentes bacterianos (MOOJEN, 2001). Pode-se fazer o diagnóstico direto dos animais infectados através da detecção de proteínas ou ácido nucléico, através de cultivo celular, microscopia eletrônica, reação em cadeia

21 21 de polimerase (PCR), hibridização in situ, histopatologia e imunohistoquímica ou ainda por isolamento do vírus. Indiretamente, o diagnóstico pode ser feito com base na presença de anticorpos, por imunodifusão em gel de agarose (IDGA), imunofluorescência indireta (IFI) e ensaios imunoenzimáticos (ELISA) (DeMARTINI et al., 1999; MOOJEN, 2001; DANTAS et al., 2005). Pelas características da infecção persistente, a forma mais prática de diagnóstico é a sorologia, pois a presença de anticorpos demonstra indiretamente a existência de infecção (CALLADO et al., 2001). No caso das técnicas sorológicas, como IDGA e ELISA, é importante a utilização de testes diagnósticos que contenham como antígeno a glicoproteína de superfície gp135 do MVV e seu respectivo soro padrão (MOOJEN, 2001). O teste de IDGA é o método recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para diagnóstico da enfermidade. Por se tratar de um método de alta especificidade, fácil aplicabilidade, sem exigência de equipamentos e instalações sofisticadas, a técnica é aplicada mundialmente como método de triagem e monitoramento das fases iniciais em programas de controle da doença (KNOWLES, 1997; DANTAS et al., 2005). Além disso, pode ser utilizado para a detecção de anticorpos anti-mvv tanto no soro sanguíneo quanto no colostro de animais infectados (ALKAN; TAN, 1998). O isolamento viral em cultivo de células tem sido um dos métodos laboratoriais de diagnóstico mais utilizado em virologia. Constituindo-se uma técnica bastante sensível, no entanto, apresenta algumas restrições, pois necessita de implantação de cultivos celulares especiais, além de não detectar os vírus que não causam efeito citopático (ECP) em cultivos celulares (KNOWLES, 1997; PINHEIRO; ANDRIOLI; GOUVEIA, 2001). O tipo de amostra, o tecido usado, a carga viral no momento da coleta, as propriedades biológicas e a composição genética do vírus também podem influenciar no isolamento viral (PETERHANS et al., 2004). Geralmente os LVPR podem ser isolados de animais vivos pelo co-cultivo de células como leucócitos do sangue periférico, células somáticas de leite, células de plexo coróide ovino para MVV ou células de membrana sinovial caprina para o CAEV (PINHEIRO; ANDRIOLI; GOUVEIA, 2001). Os métodos moleculares buscam a detecção de proteínas ou ácidos nucléicos pertencentes ao vírus. Dentre eles pode-se destacar a PCR e o Western-Blotting. No caso dos LVPR, a PCR é particularmente importante, pois possui alta sensibilidade e especificidade, sendo indicada para o diagnóstico dessa enfermidade em animais de alto valor zootécnico e para a identificação de animais que apresentam soroconversão tardia ou para aqueles que os resultados de outros testes não tenham sido conclusivos (MOOJEN, 2001). Porém, parece não

22 22 haver relação entre o título de anticorpos e a detecção do vírus por PCR no sangue e nem todas as amostras positivas aos testes sorológicos são também positivas no PCR (PINHEIRO; ANDRIOLI; GOUVEIA, 2001). A reação em cadeia de polimerase tem sido utilizada em alguns laboratórios de forma mais restrita, pois é um teste oneroso, porém, de utilidade para esclarecer resultados inconclusivos (MOOJEN, 2001). 2.9 PREVENÇÃO E CONTROLE Até o momento não existe vacina ou tratamento eficaz para qualquer forma da MV, sendo a profilaxia a forma mais adequada para a manutenção da sanidade do rebanho. De maneira geral, a profilaxia é baseada em testes sorológicos sensíveis e específicos, aliados à medidas higiênico-sanitárias que evitem a propagação do agente. O diagnóstico precoce é fundamental para a prevenção e controle da enfermidade e não deve ser baseado em sintomatologia clínica, já que a enfermidade pode se apresentar na forma assintomática ou ter apresentação clínica tardia (LIMA, 2011). Os programas de controle geralmente baseiam-se na realização periódica de testes sorológicos no rebanho, manejo do rebanho para reduzir a exposição dos animais negativos ao vírus, descarte de animais soropositivos e aleitamento artificial dos recém-nascidos, descartando o leite ou colostro dos positivos (PINHEIRO; GOUVEIA; ALVES, 2001). Neste contexto, o cadastramento de estabelecimentos, controle do trânsito de animais, certificação de estabelecimentos livres da enfermidade por meio da exigência de diagnósticos soronegativos estão entre as estratégias de atuação de combate às lentiviroses de pequenos ruminantes estabelecidas pelo Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos (BRASIL, 2004). Portanto, as investigações epidemiológicas tornam-se essenciais para avaliar a prevalência e risco da disseminação da enfermidade no país.

23 23 3 JUSTIFICATIVA Na região Norte do Brasil tem-se intensificado a criação de pequenos ruminantes, sobretudo ovinos com um rebanho de cabeças, destacando-se o Estado do Pará como o maior produtor da Região com um efetivo de cabeças (IBGE, 2012). No entanto, desconhece-se o panorama sorológico para os lentivírus e outros agentes que acometem os rebanhos paraenses. Nesse contexto, pretende-se fazer um levantamento sorológico do rebanho ovino para Maedi-Visna, o que trará informações preciosas para a implementação de medidas de prevenção e controle por parte dos órgãos de defesa. Este projeto teve um caráter inovador, porquanto constitui o primeiro levantamento sorológico para a Maedi-Visna realizado no Estado do Pará, bem como o primeiro isolamento do vírus Maedi-Visna de animais naturalmente infectados na Região Norte do Brasil. Com real probabilidade prospectiva de realização do primeiro estudo filogenético de LVPR isolado da Região.

24 24 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA Existe a presença do vírus Maedi-Visna nos rebanhos ovinos do Estado do Pará.

25 25 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Realizar o primeiro levantamento sorológico de Maedi-Visna vírus no estado do Pará, bem como o primeiro isolamento deste lentivírus advindo de animais naturalmente infectados da região Norte do Brasil. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar a presença de anticorpos contra o vírus Maedi-Visna pelo teste de triagem IDGA; Isolar cepas de Maedi-Visna vírus advindas de amostra sanguíneas de animais soropositivas no teste de IDGA através de co-cultivo celular; Comparar dois protocolos de transporte de leucócitos e isolamento viral em co-cultivo celular; Realizar PCR do sobrenadante de co-cultivo celular de leucócitos de animais soropositivos.

26 26 6 CAPÍTULO 1 Primeiro levantamento e isolamento de Maedi-Visna Vírus em ovinos naturalmente infectados no Estado do Pará, Brasil First survey and isolation of Maedi-Visna virus in sheep naturally infected in the state of Pará, Brazil Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira (Submetido em 08 de junho de 2015).

27 27 Primeiro Levantamento e Isolamento de Maedi-Visna vírus em ovinos naturalmente infectados no Estado do Pará, Brasil 1 Anderson C. Farias 2*, Maria F. S. Teixeira 2, Luiz F. S. Rodrigue 3, Ronaldo P. Dias 2, Gabrielle R. Martins 2, Flávia C. M. O. 4, Francisco B. P. Moura 2, Juliana N. D. Rodrigues 5. ABSTRACT.- Anderson C. Farias 2, Maria F. S. Teixeira 2, Luiz F. S. Rodrigue 3, Ronaldo D. 2, Gabrielle R. 2, Flávia C. M. O. 4, Bergson P. Moura 2, Juliana N. D. Rodrigues 5. [ First survey and isolation of Maedi-Visna virus in sheep naturally infected in the in Pará State, Brazil.] Primeiro levantamento e isolamento de Maedi- Visna vírus em ovinos naturalmente infectados no Estado do Pará, Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0): Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Silas Munguba, 1700, Fortaleza CE, CEP , Brazil. anderson_medvet@yahoo.com.br 1 Sheep industry experiences a significant growth in Brazil northern, and Pará State is the largest producer in the region. Interference from diseases like lentivirose Maedi-Visna (MV) depreciate herds causing pneumonia, arthritis, encephalitis, progressive weight loss and death. Diagnosis is made by serology, isolation in cell culture and PCR. There is no effective treatment or vaccine, the best way to combat it is through prevention and control. Due to scarcity information on the situation of lentiviruses in herds in the northern region of the country, it aimed to carry out the first serological survey and isolation of MVV arising from naturally infected in Pará State. Therefore, They were collected 340 blood samples sheep from four northeastern mesoregion properties from Pará State and tested by AGID. It was obtained five positive animals. Leukocyte from two of these animals were co-cultured in sheep synovial membrane of supernatants and performed nested PCR. There was a prevalence of 1.47% positivity for MVV. It observed a characteristic cytopathic effect of lentiviral small ruminants in cell culture and detected the presence of proviral DNA MVV by nested PCR. It was concluded that MVV is circulating in Pará State, needing to establish effective measures of prevention and control. INDEX TERMS: Lentiviral, AGID, cell culture, PCR. RESUMO.- A ovinocultura experimenta um expressivo crescimento na região Norte do Brasil, sendo o Pará o maior produtor da região. A interferência de doenças como a lentivirose Maedi-Visna (MV) depreciam o rebanho causando pneumonia, artrite, encefalite, emagrecimento progressivo e óbito. O diagnóstico é feito por sorologia, isolamento em cultivo celular e PCR. Não existe tratamento ou vacina efetivos, a melhor forma 1 Recebido em... Aceito para publicação em... 2 Programa de Pós-gradução em Ciências Veterinárias, Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Silas Munguba, 1700 Fortaleza CE CEP , Brasil *Autor para correspondência: anderson_medvet@yahoo.com.br; demais s: mfteixeira@hotmail.com, ronaldodias01@yahoo.com.br, rmgabrielle@hotmail.com, bergsonpmoura@hotmail.com 3 Instituto de Saúde e Produção Animal, Centro de Pesquisa em Caprinos e Ovinos do Pará (CPCOP), Universidade Federal Rural da Amazônia, Av. Tancredo Neves, 2501 Belém- PA, CEP , Brasil. E- mail: luizvet.ufra@gmail.com 4 Biomédica MSc., Laboratório de Patologia Clínica, Hospital Veterinário, Universidade Federal Rural da Amazônia. Universidade Federal Rural da Amazônia, Av. Tancredo Neves, 2501 Belém- PA, CEP , Brasil. flaviacmoliveira@hotmail.com 5 Bolsista de inciação científica (CNPq), Centro de Pesquisa em Caprinos e Ovinos do Pará(CPCOP), Universidade Federal Rural da Amazônia, Av. Tancredo Neves, 2501 Belém- PA, CEP , Brasil. E- mail: julianarodrigues@veterinaria.med.br

28 28 de combate é através da prevenção e controle. Diante das escassas informações sobre a situação das lentiviroses nos rebanhos da região norte do País, objetivou-se realizar o primeiro levantamento sorológico e isolamento de MVV advindo de animais naturalmente infectados no estado do Pará. Para tanto, foram coletadas 340 amostras de sangue de ovinos de quatro propriedades da mesorregião nordeste do estado do Pará e testadas pelo IDGA. Obteve-se cinco animais positivos. Leucócitos de dois destes animais foram cocultivados em membrana sinovial ovina, dos sobrenadantes foi realizado Nested-PCR. Verificou-se uma prevalência de 1,47% de positividade para MVV. Observou-se efeito citopático característico de lentivírus de pequenos ruminantes no cultivo celular e detectou-se a presença do DNA pró-viral de MVV através da Nested-PCR. Concluiu-se que o MVV é circulante no Estado do Pará, necessitando-se estabelecer medidas efetivas de prevenção e controle. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Lentivirus, IDGA, cultivo celular, PCR. INTRODUÇÃO A ovinocultura tem sido desenvolvida em praticamente todos os continentes. Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) a demanda da carne de ovinos pelos países em desenvolvimento é crescente diante do crescimento demográfico e variações das preferências e dos hábitos alimentares (FAO, 2007). No Brasil a atividade apresenta um grande crescimento e conta com uma produção de quase 17 milhões de cabeças (IBGE, 2012). Na região Norte do Brasil tem-se intensificado a criação de pequenos ruminantes, sobretudo ovinos com um rebanho cabeças, destacando-se o estado do Pará como o maior produtor da região com um efetivo de cabeças (IBGE, 2012). Diversos fatores interferem na produção de ovinos, dentre os quais a Maedi-Visna (MV), uma enfermidade de notificação obrigatória de acordo com a lista da Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) e que se encontra difundida nos rebanhos ovinos de vários países, sendo motivo de restrição no comércio internacional de produtos oriundos desta espécie animal (GIANGASPERO et al. 2011, MEKONNEN et al. 2010). A MV é uma doença causada por um lentivírus da família Retroviridae, do gênero Lentivírus, sendo uma infecção multissistêmica com evolução crônica e sinais clínicos muitas vezes inaparentes. Os animais infectados podem apresentar pneumonia, artrite, a forma nervosa paralítica, desenvolver um quadro de emagrecimento progressivo, com consequente debilidade e vir a óbito (SIGURDSSON 1954, SHEFFIELD et al. 1980, RAMÍREZ et al. 2012). Devido à grande similaridade entre o MVV e o vírus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) e da capacidade de infectarem tanto ovinos quanto caprinos estes dois vírus têm recebido o termo Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR)(RÁCZ 2005). Por se tratar de uma doença crônica, em que muitos animais permanecem assintomáticos, o diagnóstico da MV é feito pela observação de sinais clínicos associados à realização de testes laboratoriais (MOOJEN 2001). Entre os métodos laboratoriais destacam-se a de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) que é o teste recomendado pela OIE. Por ser um método de alta especificidade, fácil aplicabilidade, sem exigência de equipamentos e instalações sofisticadas, a técnica é aplicada mundialmente como método de triagem e monitoramento da doença em programas de controle (CUTLIP et al. 1977). Pode-se ainda realizar outros métodos diagnósticos, dentre os quais o isolamento do vírus através de cultivo celular, e técnicas moleculares como a reação em cadeia de polimerase (PCR) (KNOWLES 1997, DANTAS et al. 2005). Até o momento não existe vacina ou tratamento eficaz para qualquer forma da MV, sendo a profilaxia a forma mais adequada para a manutenção da sanidade do rebanho. Assim sendo, o diagnóstico para identificação de animais positivos e subsequente separação e descarte destes, associado ao uso de certas práticas de manejo, especialmente das crias são os melhores meios implantados para prevenir a disseminação da doença (CALLADO et al. 2001). Diante da importância dessa enfermidade e das escassas informações sobre os rebanhos ovinos da região norte do País, principalmente no que concerne às lentiviroses, o objetivo deste trabalho foi realizar o primeiro levantamento sorológico para Maedi-Visna vírus (MVV) no Estado do Pará, bem como o primeiro isolamento deste lentívirus advindo de animais naturalmente infectados da Região Norte do Brasil. MATERIAL E MÉTODOS Para a investigação da presença da infecção pelo MVV foram coletadas 340 amostras de sangue de ovinos, da raça Santa Inês, com idade mínima de um ano, de ambos os sexos, provenientes de quatro propriedades da mesorregião nordeste do estado do Pará.

29 A partir da contenção física dos ovinos e antissepsia adequada, as amostras sanguíneas foram coletadas através da venopunção da jugular externa para obtenção dos soros, os tubos contendo sangue foram centrifugados a 1600xg por 10 minutos, os soros foram separados por aspiração, acondicionados em tubos tipo eppendorf e congelados a -20 C até o subsequente uso. Os soros dos animais foram transportados ao Laboratório de virologia da UECE (LABOVIR) para realização do teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA), utilizando-se o kit comercial Biovetech para detecção de anticorpos contra o MVV. A técnica foi executada de acordo com as recomendações do fabricante, tendo sido realizadas leituras 24 e 48h depois, observando-se linhas esbranquiçadas de precipitação ou identidade formadas a partir de reação antígeno-anticorpo. Dois animais soropositivos foram submetidos à nova coleta de sangue, visando-se obter leucócitos infectados para isolamento do vírus em cultivo celular. Este isolamento foi realizado através de co-cultivo destes leucócitos infectados em membrana sinovial ovina (MSO). Para tanto, foram executados dois protocolos de obtenção e transporte de leucócitos. No primeiro protocolo, foram coletados 10 ml de sangue do animal positivo em tubos a vácuo contendo anticoagulante (EDTA), centrifugados a 35,5xg por 10 minutos. A capa leucocitária obtida foi ressuspendida em solução de cloreto de amônio (0,84%) para lisar os eritrócitos, e centrifugada a 35,5xg por cinco minutos, desprezando-se em seguida o cloreto de amônio. O pellet obtido foi ressuspendido em 10 ml de solução salina estéril, centrifugado a 35,5xg por cinco minutos, sendo desprezada a solução salina. Por fim, o pellet de macrófagos foi ressuspendido em 1mL de solução salina estéril, congelados e transportados em tubos tipo eppendorfs à temperatura de -20 C. Posteriormente, estes foram descongelados e adicionados a uma garrafa de cultivo A25 (capacidade de 25 cm 2 ) pré-formada contendo monocamada de células de MSO. A garrafa foi incubada durante 60 minutos em estufa a 37 C e 5% de CO2. Após o período de incubação, adicionou-se meio essencial mínimo (MEM) contendo 2% de penicilina e estreptomicina UI (PS), e 5% de soro fetal bovino (SFB) - meio de manutenção celular (Adaptado de Costa et al. 2007). No segundo protocolo, as primeiras etapas foram executadas semelhantes ao protocolo um, porém utilizou-se PBS em vez da solução salina estéril. Após desprezar-se a PBS, o pellet de leucócitos foi ressuspendido em 10 ml de meio RPMI acrescido de SFB a 10% e PS a 2%, sendo transportados à temperatura ambiente. Toda a suspensão leucocitária em RPMI foi transferida para uma garrafa A25, colocada em estufa a 37 C e 5% de CO2 e incubada por sete dias. Sendo realizada uma troca do meio RPMI 24h após o início do cultivo para retirar o excesso de células em suspensão. Após uma semana de cultivo, o sobrenadante de leucócitos foi desprezado e a garrafa foi lavada por três vezes com PBS. A esta, foram acrescentadas células de MSO, na concentração de 3 x 10 4 células cm -2 em meio de manutenção celular (Adaptado de Costa et al. 2007). Em ambos os protocolos as garrafas foram examinadas frequentemente ao microscópio invertido, para observação de efeito citopático (ECP), caracterizado pela fusão nuclear com formação de sincícios e lise celular. A cada sete dias de cultivo, coletava-se o sobrenadante, o qual era armazenado a -20 C, sendo acrescentado novo meio de manutenção celular. As passagens ocorriam a cada 21 dias. No momento da tripsinização as garrafas eram ampliadas na proporção de 1:2. Quando da formação de nova monocamada uma das garrafas era corada com May Grunwald e Giemsa e examinada ao microscópio invertido (Adaptado de Costa et al. 2007). Duas amostras de sobrenadante celular de cada co-cultivo foram descongeladas e utilizadas para a etapa de extração do DNA pró-viral. Uma alíquota de 1mL desse material foi centrifugada a 2000xg por 5 minutos, e o pellet obtido, foi ressuspendido em 500 μl de PBS e centrifugado a 2000xg por 5 minutos. Após essa lavagem, 1mL de tampão hipertônico foi acrescido ao pellet obtido por dois minutos a temperatura ambiente seguido por centrifugação a 1500xg por 10 minutos. O DNA celular foi extraído utilizando-se 125 μl de tampão de PCR, sendo o material incubado a 56 C por 60 minutos com 2,5 μl de proteinase K em banho-maria. A proteinase K foi desnaturada a 95 C por 10 minutos. O DNA extraído foi estocado inicialmente a 4 C durante 24 horas, e posteriormente armazenado a -20 C até sua utilização (Adaptado de Castro, 1998). Para a confirmação molecular da presença do agente viral foi realizado Nested-PCR, que constou de duas etapas de amplificação utilizando primers para a região gag. Os primers utilizados foram desenhados e confeccionados de acordo com Saltarelli et al. (1990), sendo os externos GEX5 (5- CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3) e GEX3 (5-TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3) utilizados na primeira amplificação e os internos GIN5 (5-GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3) e GIN3 (5- ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC-3) utilizados na segunda amplificação. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador (Biocycler ), constituindo-se de um ciclo inicial para desnaturação das fitas de DNA de 94 C / 5 minutos; seguidos de 35 ciclos: 94 C / 1 minuto, 56 C / 1 minuto, 72 C / 45 segundos; com extensão final a 72 C / 7 minutos. As amostras 29

30 30 amplificadas e os controles positivo e negativo, juntamente com o marcador molecular, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em TBE (Tris, borato e EDTA 0,1X), coradas com brometo de etídio e visualizadas em transiluminador de luz ultravioleta (Feitosa et al. 2011). Para a análise estatística dos dados foi o utilizado o teste Qui-Quadrado (X 2 ), adotando-se o nível de significância de 5%. Este trabalho foi realizado de acordo com os princípios éticos na experimentação animal, submetido e aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) com o seguinte número de protocolo: /2014. RESULTADOS Das 340 amostras de soro sanguíneo avaliadas para a presença de anticorpos anti-mvv pela prova de Imunodifusão em gel de agarose, cinco mostraram-se positivas, representando uma prevalência de 1,47%. Dos cinco animais infectados apenas um era do sexo masculino. À análise estatística, verificou-se associação significativa entre a ocorrência de MVV e o sexo dos animais testados (Quadro 1). Essa é a primeira detecção da presença de anticorpos para o lentivírus ovino no Pará. A análise dos co-cultivos celulares realizados a partir dos dois protocolos revelou pouca lise celular nas primeiras semanas de cultivo (Figura 1A) e surgimento de ECP característico da infecção por LVPR (formação de sincícios) (Figura 1A, 1B) a partir da terceira passagem. Depois da sétima passagem uma das amostras mostrou-se bastante lítica. A confirmação dos isolamentos foi feita pela detecção do DNA proviral de MVV, através de Nested-PCR de duas amostras de sobrenadante dos co-cultivos (Figura 2). Não houve diferenças significativas entre os protocolos utilizados. DISCUSSÃO A frequência de animais soro reagentes ao MVV no presente estudo (1,47%) foi maior do que as encontradas em outros estados da região Norte do Brasil, como no levantamento feito por Lima (2011), no Amazonas, onde não foi encontrado nenhum animal positivo, bem como no realizado por Moura Sobrinho et al., (2008) no Tocantins no qual verificaram prevalência de 0,9%. No entanto, Mazzinghy (2013) encontrou 1,62% de animais positivos também no estado de Tocantins. Em comparação com levantamentos realizados em outras regiões do País, o resultado do presente trabalho é superior aos encontrados por Souza et al. (2007) -0,5% - e Martinez et al. (2011)- 0,34%- na Bahia; maiores também do que os 0,3% descritos por Lara et al. (2013), 0% relatados por Rosa et al. (2009) e por Gregory et al. (2013) no estado de São Paulo; superior também aos relatos de Salaberry et al. (2010) no município de Uberlândia, Minas Gerais que também não verificaram soropositividade para o vírus. Porém, foi inferior aos resultados de Dal Pizzol et al. (1989) - 10,5% - e Ribeiro (1993) - 19,0% - no Rio Grande do Sul; Sotomaior et al. (1997) 86,7% - no Paraná; Da Silva (2003) - 21,3% - no Rio Grande do Norte; Fernandes et al. (2003) - 2,8% - e Lombardi et al. (2009) - 2,7% - em São Paulo e Andrade (2007) - 4,95% - no Rio de Janeiro. Quando comparados a estudos feitos apenas com animais da raça Santa Inês o resultado deste levantamento mostrou-se superior aos observados por Costa (2007) na região do Sertão de Pernanbuco e Mendonça et al. (2013) em Sergipe, que encontraram frequências de animais positivos de 1,07% e 0,11%, respectivamente. No entanto, foi menor do que os encontrados por Araujo et al. (2004) - 4,93% - em Fortaleza; Oliveira (2006) - 3,8% - no Agreste de Pernambuco e Barioni et al. (2009) - 7,33% - no Espírito Santo. A análise estatística dos resultados, no presente estudo, demostra que as fêmeas apresentaram maior tendência à positividade para MVV. De acordo com Fernandes et al. (2003) o maior tempo de permanência das fêmeas no rebanho, por permanecerem juntas na mesma baia, são fatores que contribuem para disseminação do vírus entre as fêmeas, ao passo que, os machos reprodutores geralmente são mantidos em baias separadas. Porém, segundo Crawford & Adams (1981), não existem fatores relacionados ao sexo que predisponham a infecção pelos LVPR. Christodoulopoulos (2006) também acredita que sexo não influencia diretamente na susceptibilidade à infecção do MVV. Os achados do isolamento em cultivo celular (formação de sincícios ECP) foram compatíveis com relatos de outros isolamentos de LVPR (Narayan et al. 1980, Chebloune et al. 1996, Marchesin et al. 1997, Castro et al. 1998, Almeida 2003, Lima 2004). Assim como no isolamento realizado por Costa et al. (2007), os isolados do presente estudo mostraram-se pouco líticos nos primeiros meses de cultivo. Os resultados deste trabalho demonstram que o vírus Maedi-Visna é circulante no Estado do Pará. Necessitando-se, portanto, que se tomem medidas de prevenção e controle mais efetivas, bem como a realização de mais estudos sobre a enfermidade na Região para se impedir sua proliferação e com isso permitir que a atividade da ovinocultura continue se expandindo nesta região. Demonstrou-se também ser

31 31 possível a realização de isolamento do MVV por meio de leucócitos infectados transportados congelados em solução salina estéril, o que poderia diminuir os custos com meios de transportes como o RPMI. Agradecimentos.- À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pela concessão de bolsa de mestrado. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). À Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), através do Projeto PROCAD/Casadinho (Ações integradas para o incremento da pesquisa em saúde e produção animal na Amazônia) aprovado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) que tem como parceiros os programas de pós-graduação das universidades UFRA, UECE e UNESP (Jaboticabal-SP). REFERÊNCIAS Almeida N.C Isolamento e identificação do vírus Maedi/Visna através de microscopia eletrônica de transmissão de animal comprovadamente soropositivo pelo IDGA f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. Andrade C. J. Soroprevalência do lentivírus de pequenos ruminantes em rebanhos ovinos e caprinos de microrregiões do Estado do Rio de Janeiro, Brasil Tese (Doutorado em Produção Animal) Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias Universidade Estadual do Norte Fluminense. Araújo S.A., Dantas T.V.M. & Teixeira M.F.S Levantamento sorológico de Maedi-Visna em ovinos de abatedouro da Região Metropolitana de Fortaleza-CE. In: Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, São Luis, MA. Resumos Barioni G., Pereira L.V., Beltrame M.A.V., Tesoline P. & Gumieiro M.V Soroprevalência de Maedi- Visna em ovinos da raça Santa Inês nos municípios da grande Vitória - ES. In: Congresso Brasileiro de buiatria, 2009, Belo Horizonte, MG. Anais. Belo Horizonte, p Callado A. K. C., Castro R. S. & Teixeira M. F. S Lentivírus de pequenos ruminantes (CAEV e Maedi- Visna): revisão e perspectivas. Pesq. Vet. Bras. 21: Castro R.S Lentivírus de pequenos ruminantes: ensaios imunoenzimáticos, perfil sorológico e influência filogenéticas f. Tese (Doutorado) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte. Chebloune Y., Karr B., Sheffer D., Leung K. & Narayan, O Variations in lentiviral gene expression in monocyte-derived macrophages from naturally infected sheep. J Gen Virol. 77: Christodoulopoulos, G Maedi Visna: Clinical review and short reference On the disease status in Mediterranean countries. Small Rumin. Res. 62: Costa L. S. P., Lima P. P. Callado A. K. C., Nascimento S. A. & Castro R. S Lentivírus de pequenos ruminantes em ovinos Santa Inês: Isolamento, identificação pela PCR e inquérito sorológico no Estado de Pernambuco. Arq. Inst. Biol. São Paulo. 74: Crawfor T. D. & Adams D. S Caprine arthrits-encephaliktis: clinical features and presence of antibodies em selected goat population. J Am Vet Med Assoc. 178: Cutlip R. C., Jackson T. A & Laird G. A Immunodiffusion test for ovine progressive 337 pneumonia. Am J Vet Res. 7: Da Silva J.B.A. Levantamento sorológico pelo teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) da lentivirose ovina em rebanhos do Rio Grande do Norte, Brasil f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. Dal Pizzo M., Ravazzolo A. P., Gonçalves I. P. D., Hötzel I., Fernandes J. C. T. & Moojen V Maedi-Visna: evidência de ovinos infectados no Rio Grande do Sul, Brasil, Arquivos da Faculdade de Veterinária, UFRGS. 17:65-76.

32 32 Dantas T. V. M., Araújo S. A. C., Silva J. B. A., Ricarte A. R. F. & Teixeira M. F. S Formas de diagnóstico da Maedi-Visna. Ciênc. Anim. 15: FAO. Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação. Estatísticas FAO, Disponível em: < Acesso em: 10 de agosto de Feitosa A.L.V.L., Teixeira M.F.S., Pinheiro R.R., Pinheiro A.A., Azevedo D.A.A. & Alves S.M Primeiro Isolamento De Lentivírus de Pequenos Ruminantes em caprino naturalmente infectado em rebanho do Rio Grande do Norte, Brasil. Arq. Inst. Biol., São Paulo. 78: Fernandes M.A., Araújo W.P. & Castro R.S Prevalência da infecção pelo vírus Maedi-Visna em ovinos da microrregião Grande São Paulo, Estado de São Paulo. Ciência Veterinária nos Trópicos. 6: Giangaspero M., Osawa T., Orusa R., Frossard J., Naidu. B., Robetto, S., Tatami S., Takagi E., Moriya H., Okura N. & Kato K Epidemiological survey for visna-maedi among sheep in northen prefectures of Japan. Vet. Ital. 47: Gregory L., Lara M.C.C.S.H., Kiraly A.C.M., Hasegawa M.Y., Rizzo H., Henriques L.C.S., Rossi R.S. & Castro R.S Pesquisa de anticorpos contra maedi-visna em ovinos nas microrregiões de Botucatu, Campinas, Piedade e São Paulo, Estado de São Paulo. Arq. Inst. Biol. São Paulo. 80: IBGE- Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Pesquisa Pecuária Municipal Sistema IBGE de Recuperação Automática- SIDRA. Disponível em: <ftp://ftp.ibge.gov.br/producao_pecuaria/producao_da_pecuaria_municipal/2012/tabelas_pdf/tab 17.pdf >. Acesso em 10 julho Knowles D. P. Laboratory diagnostic test for Retrovirus infections of small ruminants Vet Clin North Am Food Anim Pract. 13: Lara M.C.C.S.H., Villalobos E. M. C., Cunha E. M. S., Chiebao D., Gabriel F. H., Paulin L., Castro V., Nassar A. F. C., Piatti R., Okuda L., Romaldini A. H. C. N., Federsoni I. S. P., Lucchese Filho A., Felício A. L. A., Pino F. A., Azevedo S. S. & Cardoso M. V Inquérito sorológico de lentiviroses de pequenos ruminantes (Maedi-Visna e artrite-encefalite caprina) no estado de São Paulo. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 50: Lima P.P., Rocha M.A., Stancek D., Gouveia A.M.G. & Oliveira G.D.R Vírus da Artrite Encefalite Caprina: Isolamento e Caracterização Parcial do Gene gag. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 56: Lima N.S. Incidência de maedi-visna na população de ovinos (Ovis aries) em propriedades rurais da região metropolitana de Manaus- AM f. Dissertação (Medicina Veterinária)- Escola Superior Batista do Amazonas- Manaus. Lombardi A.L., Nogueira A.H.C., Feres F.C., Paulo H.P., Castro R.S., Feitosa F.L.P., Cadioli F.A., Peiró J.R., Perri S.H.V., Lima V.F.M. & Mendes L.C.N Soroprevalência de Maedi-Visna em ovinos na região de Araçatuba, SP. Arq Bras Med Vet Zootec. 61: Marchesin D.M., Moojen V., & Ravazzolo A.P Caracterização molecular do gene gag de amostras do vírus da artrite-encafalite caprina (CAEV) isoladas de animais naturalmente infectados no Rio Grande do Sul, Brasil. Pesqui. Vet. Bras. 18: Martinez M. P., Costa J. N., Souza T. S., Lima C. C. V., Neto O. C. N. & Pinheiro R. R Prevalência sorológica da maedi-visna em rebanhos ovinos da microrregião de juazeiro. Ciênc. Anim. Bras. 12: Mazzinghy C. L. Soropositividade para Maedi-Visna em ovinos. Araguaína, Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical), Universidade Federal do Tocantins.

33 33 Mekonnen G. A., Sirak A. & Chacka H Sero-epidemiological study on Maedivisna in selected áreas of Ethiopia. Ethiop. Vet. J. 14: Mendonça C.E.D., Barros S. L. B., Mendonça M. A. D., Guimarães V. A. A. & Pinheiro R. R Arq. Inst. Biol. São Paulo. 80: Moojen V. Maedi-visna dos ovinos. In: Riet-Correa F., Schild A.L., Mendez M.D.C. & Lemos R.A.A Doenças de Ruminantes e Equinos. 2. ed. São Paulo: Varela, São Paulo p. Moura Sobrinho P.A., Fernandes C.H.C., Ramos T.R.R., Campos A.C., Costa L.M. & Castro R.S Prevalência e fatores associados à infecção por lentivírus de pequenos ruminantes em ovinos no estado do Tocantins. Ciênc. Vet. Tróp. 11: Narayan O., Clements J.E., Strandberg J.D., Cork L.C. & Griffin D.E Biological characterization of vírus causing leukoencephalitis and arthritis in goats. J. Gen. Virol. 50: Oliveira M. M. M., Castro R. S., Carneiro K. L., Nascimento S. A., Callado A. K. C., Alencar C. S. A. & Costa L. S. P Anticorpos contra lentivírus de pequenos ruminantes em caprinos e ovinos em abatedouros do Estado de Pernambuco. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, 58: Rácz M. L Nomenclatura e classificação dos vírus. In: Trabulsi L. R. & Alterthum F. Microbiologia. São Paulo: Atheneu Ramírez H., Reina R., Bertolotti L., Cenoz A., Hernández M., Román B.S., Glaria I., Andrés X., Crespo H., Jáuregui P., Benavides J., Polledo L., Pérez V., García-Marín J., Rosati S., Amorena B. & Andrés A Study of compartmentalization in the visna clinical forof small ruminant lentivirus infection in sheep. BMC Vet Res. 8:1-12. Ribeiro L.A Risco da introdução de doenças exóticas pela importação de ovinos. Boletim do Laboratório Regional de Diagnóstico. 13: Rosa E.P., Amorim R.M., Ferreira D.O.L., Chiacchio S.B. & Modolo J.R Soroprevalência da pneumonia progressiva ovina Maedi-Visna na região de Botucatu, SP. Ciência Animal Brasileira. 10: Saltarelli M., Querat G., Konings D.A., Vigne R. & Clements J.E Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology, 179: Salaberry S.R.S., Lara M.C.C.S.H., Piatti R.M., Nassar A.F.C. & Castro J.R. E.C., Guimarães, Lima-Ribeiro, A.M.C Prevalência de anticorpos contra os agentes da Maedi-Visna e Clamidofilose em ovinos no município de Uberlândia, MG. Arq. Inst. Biol. São Paulo. 77: Sigurdsson B Maedi, a slow progressive pneumonia of sheep: an epizzootiological and a pathological study. Brit. Vet. J. 110: Sheffield W. D., Narayanj D., Strandberg J. D. & Adams J Visna-Maedi-Like Disease Associated with an Ovine Retrovirus Infection in a Corriedale Sheep. Vet Pathol. 17: Sotomaior C. & Milczewski V Relato de um rebanho ovino infectado pelo vírus Maedi-Visna no estado do Paraná. In: Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, 25. Gramado. Anais Gramado [s.n] p.179. (Resumo). Souza T.S., Costa J.N., Martinez P.M. & Pinheiro R.R Estudo sorológico da Maedi-Visna pelo método da imunodifusão em gel de ágar em rebanhos ovinos de Juazeiro, Bahia, Brasil. Rev. Bras. Saúde Prod. Anim. 8:

34 34 Quadro 1. Distribuição de frequência de ovinos positivos para Maedi-Visna vírus no teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) no Estado do Pará, IDGA Positivos Negativos Sexo Nº de animais n % n % Machos Fêmeas , ,78 Total , ,53 P=0,02; Teste Qui-Quadrado(X 2 ). Figura 1. Isolamento a partir de co-cultivo de leucócitos infectados em MSO. (A) Apresentando lise celular e efeito citopático característico de infecção por LVPR (seta); (B) Apresentando efeito citopático (seta). Figura 2. Detecção do DNA pró-viral de MVV em sobrenadantes de cultivos celulares de animais naturalmente infectados no Estado do Pará. Linha 1: marcador molecular; linha 2: controle negativo; linha 3: sobrenadante do animal 1, 7 dias após o início do cultivo; linha 4: sobrenadante do animal 1, 63 dias após o início do cultivo; linha 5: sobrenadante do animal 2, 7 dias após o início do cultivo; linha 6: sobrenadante do animal 2, 34 dias após o início do cultivo e linha 7: controle positivo.