Efeito da toxicidade do NaCl na mobilidade do microcrustáceo Daphnia magna

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1 Efeito da toxicidade do NaCl na mobilidade do microcrustáceo Daphnia magna Inês Dias e Vasco Melro Laboratório de Ecotoxicologia, do Grupo de Disciplinas de Ecologia da Hidrosfera, da Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Monte da Caparica, Quinta da Torre Resumo Neste trabalho foi estudada a toxicidade do cloreto de sódio (NaCl) no microcrustáceo D. magna. Testaram se meios com diferentes concentrações de NaCl e quantificou se o efeito de cada uma na mobilidade do microcrustáceo, para um período de exposição de 48 horas. Cálculou se o CE50 48 horas (valor para o qual 50% da população é afectada) e a concentração mais elevada de NaCl para a qual não é observável qualquer efeito na mobilidade do microcrustáceo (NOEC non observe effect concentration ). Palavras chave: Daphnia magna, NaCl, toxicidade, mobilidade, CE50, NOEC. 1. Introdução A Daphnia magna, conhecida vulgarmente como pulga de água devido à sua forma de locomoção característica, é um microcrustáceo pertencente à ordem Cladocera (ver anexo de ilustrações), cujo habitat natural é a água doce rica em oxigénio (charcos e represas). A sua envergadura é variável entre 0,2 e 0,5 mm e fisionomicamente são seres possuidores de uma carapaça bivalve que lhes cobre o corpo deixando, porém, a cabeça descoberta. Nesta encontram se duas antenas que permitem a mobilidade do organismo (funcionando como remos) (Aguasca et al., 1984). Este

2 organismo alimenta se de plâncton e reproduz se assexuadamente, por partenogénese (ou seja, não necessita de parceiro para que ocorra a reprodução), ocorrendo esta por libertação dos ovos, não fecundados, para o meio líquido. A escolha deste organismo para a realização do ensaio deveuse ao facto deste ser representativo das espécies de zooplâncton de água doce, ou seja as conclusões retiradas a partir deste podem ser generalizadas para os restantes organismos da mesma espécie. O tóxico utilizado neste ensaio foi o NaCl, o qual é um composto químico formado por iões Cl (cloreto) e iões Na + (sódio). Uma vez que a espécie em questão habita locais de água doce, é esperado que ela reaja em soluções salinas, neste caso ricas em cloretos. Tendo conhecimento que a sobrevivência de organismos desta espécie é possível entre valores de 0 7 g/l (Martinez Jerónimo e Martinez Jerónimo, 2006), e sabendo que o ensaio efectuado testou a mobilidade, conclui se à priori que a gama de concentrações estaria compreendida entre estes valores. 2. Material e Métodos As dáfnias utilizadas neste trabalho eram da espécie Daphnia magna e encontravam se em estado de latência, sob a forma de efipias (ovos). Foi necessário proceder se à sua reactivação. Preparou se para isso uma solução propícia ao desenvolvimento das mesmas, que corresponde a uma água doce artificial. Colocou se num balão volumétrico de 2 L um pouco de água desionizada do tipo 2 1. De seguida misturou se 4 soluções concentradas de sais diferentes (nº1 NaHCO3; nº2 CaCl2; nº3 MgSO4; nº4 KCl), pela respectiva ordem numérica procedendo se, de cada vez que se adicionava nova solução salina à mistura, a uma homogeneização 1 Em laboratório classifica se a água em três tipos: Tipo 1 Água ultra pura obtida através de tratamento por resinas (maior qualidade); Tipo 2 Água desionizada obtida por tratamento de osmose inversa (qualidade intermédia); Tipo 3 Água destilada (menor qualidade)

3 cuidada da mesma, para evitar a formação de gradientes de concentração. Cada solução salina media um volume de 12 ml. Seguidamente procedeu se ao arejamento da água doce artificial. Com o auxílio de um arejador e de uma pipeta, saturou se a água doce artificial com O2 (Δt=15min). Este procedimento foi executado porque o micro crustáceo necessita de um meio rico em oxigénio para sobreviverem. Por fim, colocou se as efipias nesta água doce artificial rica em oxigénio, no interior de uma placa de Petri, dentro de uma câmara de incubação, a 22ºC, com uma intensidade luminosa de 6000 lux. A eclosão ocorreu num período de 72 horas. Tal como foi explicado anteriormente, as dáfnias são organismos que habitam ecossistemas de água doce. Um dos objectivos deste trabalho foi o de avaliar o efeito do sal na mobilidade destes organismos, tendo o NaCl sido o tóxico escolhido. Foi necessário preparar se uma solução mãe de elevada concentração desta substância. Para isso, procedeu se à pesagem de 10,0038 g deste sal (NaCl Panreac Química San) numa balança de precisão. De seguida, dissolveu se o sal com água doce artificial, num balão de 100 ml. A concentração de NaCl esperada era de 100 g/l. Titulou se um volume da solução mãe de NaCl com nitrato de prata, na presença de cromato de potássio, para determinar a sua clorosidade (teor em iões cloreto na solução). Quando, durante a titulação, se atinge a coloração pêssego, significa que deixam de existir iões Cl para reagir com os iões Ag +, dando se a titulação como concluida 2. Recorreu se a uma solução de AgNO3, cuja concentração inicial era de 0,2 mol/l (titulante), para titular 10 ml da solução de NaCl de 100g/L, à qual se adicionou 10 gotas do indicador (KCrO3, coloração amarela) e mais 10 ml de água desionizada. Diluiu se a solução mãe de NaCl de 1:10, tendo se pipetado 5 ml da solução mãe para um balão volumétrico de 50 ml e perfeito o restante com água desionizada. De seguida, pipetou se 10 ml desta 2 NaCl + AgNO3 = AgCl

4 solução diluída para um erlenmeyer. Verificou se que foi necessário um volume de 8 ml de AgNO3, até se atingir o ponto de mudança de cor do indicador. A adição do titulante à amostra levou à formação de um precipitado branco correspondente ao AgCl. Após a complexação de todos os iões cloreto com a prata, verificou se que a solução ganhou uma coloração alaranjada, correspondente à reacção da prata com o cromato de potássio. Este ponto indicou o final da reacção de complexação do cloreto e, consequentemente, o final da titulação. O teor de cloretos foi cálculado através da seguinte expressão: Concentração em cloretos (g/l) = [(Vtitulante amostra Vtitulante branco)xconc. titulantexm (Cl )]/Vamostra em que, Vtitulante amostra: Volume de titulante gasto na amostra (em ml) Vtitulante branco: Volume de titulante gasto no branco (em ml) Conc. titulante: Concentração do titulante (em mol/l) M (Cl ): Massa molar do ião cloreto (em g/mol) Vamostra: Volume da amostra (em ml) O teor de cloretos desta solução era de 58,72 g/l. A concentração de NaCl era de 93,42 g/l (ver anexo de cálculos 1). Era esperada uma concentração de NaCl de 100 g/l. Houve, no entanto, uma variação nesse valor. Os factores que podem ter condicionado essa variação são os seguintes: a) A concentração do cloreto de sódio sólido, a partir do qual a solução mãe foi preparada, era de 99,5% e não de 100%; b) O cloreto de sódio podia conter alguma humidade pelo facto de se encontrar em utilização há já alguns meses; c) Erros de pesagem e medição do volume de água nos balões volumétricos; d) Erros de medição de volume cometidos na titulação; e) Erro relacionado com a detecção do ponto final da titulação. Seguidamente preparam se as soluções de cloreto de sódio com diferentes concentrações, que iriam ser testadas no ensaio de mobilidade das dáfnias. Estas soluções foram preparadas a partir da solução mãe, através do processo de diluições em série. Os balões contendo estas soluções de cloreto de sódio foram designados por

5 C1, C2, C3, C4 e C5. A partir da solução mãe de cloreto de sódio retirou se 9 ml para o balão C1, e perfez se com água desionizada, ficando assim este balão com a solução mais concentrada (concentração estimada de 8,4 g/l). De seguida, deu se início ao processo das diluições em série: transferiu se 10 ml da solução C1 para o balão C2 e perfez se com água desionizada; transferiu se 10 ml da solução C2 para o balão C3 e perfez se com água desionizada; e assim sucessivamente até ao balão C5 (concentração estimada de 0,00084 g/l). Duas horas antes do início do ensaio, procedeu se à alimentação das dáfnias com a microalgaspirulina. Posteriormente, deu se início à preparação do ensaio através da distribuição das soluções de cloreto de sódio pelos recipientes de ensaio. Os recipientes de ensaio consistiam em cinco células de plástico por cada concentração de cloreto de sódio. Em cada célula foram colocados 10 ml de cada uma das soluções da cloreto de sódio. A Fig. 1 exemplifica uma placa de teste. Concentrações estimadas de cloreto de sódio C0 (branco) C1 (8,4 g/l) C2 (0,84 g/l) C3 (0,084 g/l) C4 (0,0084 g/l) C5 (0,00084 g/l) Células de lavagem das dáfnias Replicados A B C D Fig. 1. Diagrama representativo da placa de teste utilizada no ensaio com as dáfnias

6 As linhas de cada placa de teste correspondem a uma concentração de cloreto de sódio. As colunas de cada placa (A a D) correspondem a um replicado, excepto a primeira coluna que foi utilizada para efectuar a lavagem das dáfnias na concentração de NaCl respectiva. A necessidade de se utilizar uma coluna para a lavagem dos organismos, deve se ao facto destes provirem de um meio de cultura (água doce artificial) que não continha cloreto de sódio. Se fosse efectuada a transferência directa dos organismos deste meio de cultura para cada uma das células contendo as soluções de cloreto de sódio, poder se ia provocar a diluição destas soluções. A passagem das dáfnias por células contendo as soluções de NaCl ensaiadas, permite reduzir o efeito de diluição do cloreto de sódio. Para cada uma das células de lavagem foram transferidas 20 dáfnias (Fig. 2). Concentrações estimadas de cloreto de sódio Células de lavagem das dáfnias C0 (branco) 20 Replicados A B C D C1 (8,4 g/l) 20 C2 (0,84 g/l) 20 C3 (0,084 g/l) 20 C4 (0,0084 g/l) 20 C5 (0,00084 g/l) 20 Fig. 2. Diagrama representativo da placa de teste utilizada no ensaio com as dáfnias, contendo 20 organismos em cada uma das células de lavagem De cada uma das células de lavagem, foram posteriormente transferidas 5 dáfnias para cada uma das células de teste (A a D) que continham a mesma concentração de cloreto de sódio (Fig. 3).

7 Concentrações estimadas de cloreto de sódio C0 (branco) Células de lavagem das dáfnias 0 5 Replicados A B C D C1 (8,4 g/l) 20 C2 (0,84 g/l) 20 C3 (0,084 g/l) 20 C4 (0,0084 g/l) 20 C5 (0,00084 g/l) 20 Fig. 3. Diagrama representativo da transferência das dáfnias das células de lavagem para as células de teste Após a transferência de todas as dáfnias das células de lavagem para as células de teste, as placas foram cobertas com parafilme e tapadas com uma tampa de plástico para reduzir a evaporação dos meios. As placas foram depois colocadas numa câmara termostatizada, a 22ºC, durante 48 horas, na ausência de luz. Ao fim de 24 h e 48 h de exposição das dáfnias às diferentes concentrações de cloreto de sódio, procedeu se à observação dos movimentos das dáfnias, em todas as células de teste. Durante a observação, provocaram se ligeiras perturbações no meio em que as dáfnias se encontravam para promover a sua locomoção. As dáfnias eram consideradas imóveis se num período de 15 segundos, após a perturbação, não apresentavam mobilidade. Este ensaio consistiu no teste preliminar, no qual foi ensaiada uma gama alargada de concentrações de cloreto de sódio (8,4 g/l a 0,84 mg/l).

8 Com base nos resultados obtidos neste teste preliminar, foi realizar um ensaio definitivo, no qual se testou uma gama de concentrações mais estreita (0,84 a 0,084 g/l). Os procedimentos efectuados no ensaio definitivo foram idênticos aos descritos anteriormente para o ensaio preliminar. 3. Resultados e Discussão No Quadro 1 apresentam se os volumes de nitrato de prata (titulante) utilizados na titulação das soluções de cloreto de sódio, que foram usadas no teste preliminar, bem como as concentrações efectivas e estimadas de cloretos nestas mesmas soluções. Quadro 1. Concentrações efectivas e estimadas de cloretos nas soluções de NaCl ensaiadas no teste preliminar Solução de NaCl Desvios Volume de amostra 100 ((a)/(b))*100 Conc. do titulante C1 Vamostra=5 ml [AgNO3]=0,2mol/L C2 Vamostra=5 ml [AgNO3]=0,0141mol/L C3 Vamostra=10 e 5 ml [AgNO3]=0,0141mol/L C4 Vamostra=20 ml [AgNO3]=0,0141mol/L C5 Vamostra=20 ml [AgNO3]=0,0141mol/L Volumes de nitrato de prata 4ml 7,3ml 4,6ml e 2,4ml Concentração efectiva de cloretos (a) Concentração estimada de cloretos (b) 5,7 g/l 3 8,4 g/l 32,14% 0,73 g/l 5 0,84 g/l 13,10% 0,073 g/l 4 0,084 g/l 13,10% 6,3ml 0,0073 g/l 6 0,0084 g/l 13,10% 6,2ml 0,00073 g/l 6 0,00084 g/l 13,10% 3 Valores obtidos laboratorialmente, através de testes de clorosidade, tendo em conta a fórmula ( Vtitulante x [ ] titulante x M(Cl) / Vamostra) 4 Valores estimados matematicamente.

9 Como é possível se observar pela análise da tabela, o valor da [AgNO3] (titulante), variou da primeira solução para as restantes, devido ao facto desta se encontrar muito concentrada, ou seja se se utilizasse a mesma [ ] de titulante para todas as soluções chegava a uma certa altura que bastava uma única gota de titulante para que se atingisse o final da titulação, tornando o teste inconclusivo. Por outro lado, as soluções a partir da concentração C3 foram demasiado difíceis de titular, devido ao facto de se tratarem de soluções demasiado diluídas, isto é com um teor muito pobre em cloretos, que mesmo com a utilização do titulante mais diluído que se tinha à disposição em laboratório cuja [ ] = 0,0141 mol/l, não foi possível achar se valores concludentes. Decidiu se então, achar a [Cl ] na segunda amostra e a partir dessa, uma vez que as seguintes eram diluições consequentes, dividir se o valor obtido por 10, obtendo então matematicamente os restantes valores. Note se que em C2, a diferença do valor estimado e do valor real é bastante reduzida, o que faz desta solução a mais viável. Um dos factores que se colocou em causa, para justificar o facto de existir estas oscilações, era o facto da água utilizada durante as titulações não se encontrar totalmente desionizada (isto é, sem quaisquer iões, para o caso o ião em questão era o cloreto), logo resolveu se titular essa mesma água e obteve se um valor de 0,20ml de titulante gasto, o que justifica uma ligeira oscilação nos valores. Tabela de contagem das Daphnias imóveis []>> Branco(C0) C5 C4 C3 C2 C1 Exposição(h) A B C D Total 0/20 0/20 0/15 0/15 0/19 1/19 0/20 2/20 14/20 20/20 20/20 20/20 Efeito% 0% 0% 0% 0% 0% 5,3% 0% 10% 70% 100% 100% 100% Com os resultados obtidos após 48h de exposição do organismo em meios com diferentes concentrações de NaCl, chega se à conclusão de que a gama utilizada foi demasiado elevada,

10 verificando que o CE50 encontra se algures entre a solução C2 e C3. Então, após o ensaio preliminar e de acordo com os resultados obtidos, concluiu se que a gama de [ ] mais adequadas a utilizar era, tendo em conta a sugestão do protocolo: C1 = 0,84 g/l C2 = 0,56 x 0,84 = 0,47 g/l C3 = 0,32 x 0,84 = 0,26 g/l C4 = 0,18 x 0,84 = 0,15 g/l C5 = 0,10 x 0,84 = 0,084 g/l (factores sugeridos no protocolo) Titulações de ensaio definitivo V.estimado V.real Volumes [Cl ] Volumes [Cl ] C1 V.a =4,9ml [AgNO3] = 0,0141mol/L 0,84g /L 6,35ml 0,65 g/l 5 C2 V.a =20ml [AgNO3] = 0,0141mol/L C3 V.a =20ml [AgNO3] = 0,0141mol/L C4 V.a =20ml [AgNO3] = 0,0141mol/L C5 V.a =20ml [AgNO3] = 0,0141mol/L 0,47 g /L 0,26 g /L 0,15 g /L 0,084 g /L 18,3ml 0,45 g/l 5 13ml 0,32 g/l 5 9ml 0,12 g/l 6 8,2ml 0,065 g/l 6 Tabela de contagem das Daphnias imóveis []>> Branco(C0) C5 C4 C3 C2 C1 Exposição(h) A B C D Total 0/19 0/19 0/20 0/20 0/19 1/19 0/20 2/20 4/20 5/20 8/20 11/20 Efeito% 0% 0% 0% 0% 0% 5,3% 0% 10% 20% 25% 40% 50%

11 Com a obtenção destes valores finais foi possível o cálculo do CE50 e do NOEC, realizando para isso o seguinte gráfico: Efeito do tóxico NaCl na mobilidade do microcrustáceo D. magna Inibição da mobilidade após 48h (%) y = 144,49x + 78, R 2 = 0, ,600-0,500-0,400-0,300-0,200-0,100 0,000 log [NaCl] Donde, conhecendo a equação da recta, ou seja o seu declive e a sua ordenada na origem, sabendo que o valor de inibição procurado era 50%, conclui se que o CE50 48h = 0,634 g/l e consequentemente calculando o valor para o qual a inibição é de 0% obtêm se o NOEC = 0,286 g/l (ver cálculos em anexo 2) Conclusão Tal como era esperado e através da análise do gráfico obtido, é possível concluir que a gama de concentrações utilizada foi adequada ao estudo que se pretendia, uma vez que foi possível estimar os valores de CE50 e NOEC, a partir dos quais, se conclui que a espécie Daphnia magna é sensível a concentrações acima 0,286 g/l e 50% da população é afectada (neste caso, perda total de mobilidade, estágio pré morte) quando a concentração de NaCl atinge os 0,634 g/l.

12 Agradecimentos Inês Dias Primeiramente, gostaria de agradecer ao professor Nuno Lapa, responsável pelo estágio, e ao professor Rui Barbosa, pertencente à sua equipa, por toda a atenção com que me receberam e por toda a ajuda e disponibilidade que demonstraram ao longo deste estágio. Sem eles não teria sido possível, de todo, a realização deste projecto; À colega de trabalho Maria por nos ter ajudado na pesquisa da informação necessária, também muito importante para o relatório de final de estágio; À Ceren, também estagiária (mas noutro projecto), pela boa disposição que nos transmitiu durante todo o tempo de estágio; À prof. Ana Luísa Fernando por ter colaborado na resolução de pequenos problemas relacionados com o estágio; Ao sofisticado equipamento tecnológico que nos disponibilizou para a observação microscópica, juntamente com a possibilidade de captar algumas imagens inéditas dos organismos estudados; E por fim, mas não menos importante, ao meu colega de estágio, Vasco Melro por toda a sua imprescindível colaboração e empenho nas tarefas realizadas. Vasco Melro Em primeiro lugar a todo o Grupo de Disciplinas de Ecologia da Hidrosfera, da Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, que facilitou a minha adaptação a este novo mundo de conhecimentos. Aos colegas de trabalho com quem contactei directamente em laboratório pelos bons momentos, e pelo incentivo, Inês (pela amizade, companhia e ajuda durante estes 12 dias), Maria e Ceren (obrigado por enriqueceres o meu vocabulário turco). Aos professores que durante esta duas semanas foram incansáveis no apoio prestado: Engenheiro Rui Barbosa (pelo apoio matemático), Engenheiro João Morais (pelos grandes planos da Daphnia), Professora Doutora Ana Luísa Fernando (pelo apoio burocrático na

13 cantina da universidade) e Professora Doutora Benilde (pelo conselho). E por fim, à individualidade que possibilitou toda esta experiência e que me transmitiu um leque bastante vasto de conhecimentos nestas duas meras semanas, Engenheiro Nuno Lapa, o meu muito obrigado. Referências Bibliográficas Aguasca, M., et all, História Natural, Barcelona (España) Edições Zairol 5, Martinez Jerónimo, Fernando; Martinez Jerónimo, Laura, 2006, Chronic effect of NaCl salinity on a freshwater strain of Daphnia magna, México, Ecotoxicology and Environmental Safety 67,

14 Anexo de Cálculos 1. 8 x 0,2 x 35,45 = 56,72 g cloretos/l 35,45g Cl 1mol 56,72g Cl 1,59mol 23g Na 1mol 36,7g Na 1,59mol [NaCl] =56, ,7 = 93,42 g/l 2. y = 144,49x + 78,637 m = 144,49 b = 78,637 y = 50 x = CE50 = 0,634 o mesmo raciocínio para o cálculo do NOEC, substituindo o y por 0.

15 Anexo de ilustrações Plano da Daphnia magna, obtido por microscópio