PRODUÇÃO DE MALTOOLIGOSSACARÍDEOS VIA SÍNTESE ENZIMÁTICA

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1 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 1/7 PRODUÇÃO DE MALTOOLIGOSSACARÍDEOS VIA SÍNTESE ENZIMÁTICA Rabelo, M. C. 1, Honorato, T. L. 1, Gonçalves, L. R. B. 2, Pinto, G. A. S. 3 e Rodrigues, S. 1* 1 Universidade Federal do Ceará Departamento de Tecnologia de Alimentos Laboratório de Biotecnologia (GPBIO); Av Mister Hull, 2977 Bloco 858-Campus do Pici Fortaleza CE sueli@ufc.br 2 Universidade Federal do Ceará Depto de Engenharia Química Laboratório de Bioengenharia (GPBIO);Av Mister Hull, 2977 Bloco 709- Campus do Pici Fortaleza CE 3 Embrapa Agroindústria Tropical, Laboratório de Bioprocessos (GPBIO) Rua Dra. Sara Mesquita Fortaleza - CE Grupo de estudos em processos Biotecnológicos (GPBIO) RESUMO - maltooligossacarídeos com grau de polimerização entre 3 e 6 têm sido considerados como carboidratos pré-bióticos. Estes carboidratos não são metabolizados no trato digestivo sendo consumidos no intestino humano por bifidobactérias e lactobacilos, que são considerados microrganismos benéficos. Estes oligossacarídeos podem ser obtidos via síntese enzimática. Neste trabalho é apresentado o estudo da síntese enzimática de maltooligossacarídeos pré-bióiticos utilizando-se a enzima dextrana-sacarase em meio contendo sacarose e maltose como substratos. A enzima, de origem bacteriana, foi obtida da bactéria Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F via processo fermentativo com meio sintético contendo sacarose, fonte de nitrogênio e sais minerais, sendo posteriormente parcialmente purificada através da precipitação com polietilenoglicol. A influência da concentração de maltose e sacarose na concentração de maltooligossacarídeos obtida foi estudada através de um planejamento experimental compósito central. As sínteses foram realizadas à 30 o C e ph 5,2 (condições ótimas de atividade da enzima) por tempo suficiente para consumo total da sacarose. Os produtos de síntese, bem como a maltose não consumida, foram analisados através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados demonstraram que razões equimolares de maltose/sacarose no reator resultam em maiores rendimentos em maltooligossacarídeos totais em função dos substratos iniciais. INTRODUÇÃO Maltooligossacrídeos são carboidratos constituídos de uma unidade de maltose e várias unidades de glicose com aplicação potencial na indústria de alimentos como adoçante não cariogênico, uma vez que estes carboidratos não são fermentáveis pela flora oral humana (Miyake et al., 1985), e são também agentes estabilizantes de bebidas (Higashimura et al,. 2000). Além disso, há estudos indicando que os

2 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 2/7 maltooligossacarídeos estimulam o desenvolvimento de bifidobactérias (Machida et al., 1986), que são benéficas ao trato digestivo sem estimular o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis (Rodrigues, 2003). A enzima dextrana-sacarase é tradicionalmente utilizada para a síntese de dextrana em meio contendo sacarose como substrato. Entretanto, quando além de sacarose um aceptor é também utilizado como substrato, partes das unidades de glicose provenientes da hidrólise da sacarose promovida pela enzima, são desviadas da cadeia de dextrana, sendo incorporadas neste segundo substrato, formando oligossacarídeos de interesse técnico. Esta reação secundária é denominada reação do aceptor. À medida que unidades de glicose se incorporam à cadeia, são formadas as séries homólogas. Para esta reação são conhecidas séries homológas contendo até 10 unidades de glicose, sendo duas glicoses pertencentes à maltose (ligação glicosídica α -1,4) e as demais incorporadas a este carboidrato por meio da síntese enzimática (ligação glicosídica α -1,6). Estes maltooligossacarídeos, embora apresentem aplicações técnicas relevantes, são considerados de difícil síntese (Heinke et al., 1999) e não são produzidos em larga escala. A enzima dextrana-sacarase é estável numa ampla faixa de temperatura, entretanto sua faixa de estabilidade em relação ao ph do meio é restrita (ph entre 5,0 e 6,0). A enzima apresenta atividade máxima em ph 5,2 e temperatura de 30 o C (Mibielli, 2001). A enzima, de origem bacteriana, pode ser obtida a partir de diversos microrganismos e neste trabalho foi obtida da bactéria Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F, a mais estudada e utilizada industrialmente para a produção de dextrana. A enzima é extracelular e sua purificação para o processo em questão (síntese enzimática de oligossacarídeos) não requer a purificação total, o que reduz o custo do processo tornando-o economicamente interessante. A enzima apresenta estabilidade por período prolongado, quando parcialmente purificada e estocada em temperatura adequada (Mibielli, 2001). A síntese da enzima é tradicionalmente realizada via processo fermentativo com meio sintético contendo sacarose, fonte de nitrogênio e sais minerais. A sacarose é essencial para a produção da enzima, uma vez que sua expressão é indutiva, sendo o único indutor conhecido a sacarose (Alsop, 1983), entretanto o microrganismo se desenvolve em meios contendo outras fontes de carbono sem a produção da enzima (Rodrigues, 2003). Neste trabalho foi realizado o estudo da síntese de maltooligossacarísdeos a partir da reação do aceptor com a enzima dextrana-sacarase obtida do Leuconostoc mesenteroides B512F visando o desenvolvimento de um processo economicamente viável para a sua produção em larga escala. MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção do microrganismo O microrganismo Leuconostoc mesenteroides B512F foi obtido junto ao banco de microrganismos do Departamento Estadual de Agricultura dos EUA (United States Departament of Agricultural, Peoria, Illinois, NRRL Culture Collection).

3 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 3/7 Obtenção da enzima A enzima dextrana-sacarase foi obtida via processo fermentativo com Leuconostoc mesenteroides B512F utilizando sacarose (indutor da produção da enzima) como fonte de carbono segundo procedimento padrão otimizado por Guimarães et al. (1999). O meio padrão utilizado para a produção da enzima apresentava a seguinte composição: 50,0 g/l de sacarose; 20,0 g/l de extrato de levedura; 20,0 g/l de K 2 HPO 4 ; 0,20 g/l de MgSO 4.7H 2 O; 0,01 g/l de MnSO 4.7H 2 O; 0,01 g/l de FeSO 4.7H 2 O; 0,02 g/l de CaCl 2.2H 2 O e 0,01 g/l de NaCl. O microrganismo foi ativado em shaker rotatório (27 o C) e a produção da enzima foi realizada em fermentador por processo batelada alimentada (Bazan,1993). A alimentação do fermentador era constituída de uma solução concentrada de NaOH contendo sacarose. O NaOH foi utilizado para manter o ph do meio na faixa ótima de crescimento do microrganismo (6,7) enquanto a adição de sacarose visava aumentar o rendimento e evitar a falta deste nutriente. A alimentação foi interrompida em aproximadamente 6 horas de fermentação, mas o processo foi ainda mantido por mais 2 horas para que houvesse queda do ph para 5,2 e consumo de sacarose residual (Rodrigues, 2003). Ao final da fermentação as células foram removidas por centrifugação, obtendose assim a enzima bruta. Determinação da atividade enzimática A atividade enzimática da enzima dextrana-sacarase foi determinada pela quantificação de açúcares redutores pelo método de DNS (Miller, 1959). Os ensaios foram realizados em condições ótimas de síntese (ph 5,2, 30 o C). A atividade enzimática foi determinada em termos de unidade de dextrana-sacarase (UDS/ml) a 30 o C e ph 5,2, valores nos quais a enzima é estável e apresenta atividade máxima (Mibieli, 2001). A UDS nada mais é que a quantidade de enzima que converte 1 mg de sacarose em dextrana a 30 o C liberando 0,52 mg de frutose em 1 hora. A atividade enzimática foi calculada por meio de regressão linear. A atividade foi determinada para a para a enzima bruta e parcialmente purificada. Purificação da enzima A enzima foi parcialmente purificada por precipitação com polietilenoglicol (PEG 1500). O processo consistiu em adicionar lentamente ao caldo bruto (sem células) uma solução de PEG 1500 a 50 % de mesmo volume. A mistura foi então centrifugada a 12 rpm por 10 minutos. O precipitado foi re-suspenso em tampão acetato de sódio 20mM com ph ajustado para 5,2, contendo 0,05 g/l de CaCl 2. A enzima assim obtida foi estocada congelada a -20 o C. Síntese enzimática As sínteses enzimáticas foram realizadas nas condições ótimas de síntese (30 oc e ph 5,2). As concentrações de substratos (maltose e sacarose) para a síntese dos oligossacarídeos foram determinadas por planejamento fatorial e os resultados foram analisados através da análise de superfície de resposta (Barros Neto, et al., 1995). Após a síntese a dextrana foi precipitada utilizando-se 3 volumes de etanol 96% e determinada segundo o método fenol ácido sulfúrico (Dubois, et al., 1956) para a determinação de carboidratos totais. O sobrenadante foi removido para a análise por

4 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 4/7 cromatografia líquida de alta eficiëncia (HPLC). Condições iniciais de síntese A Tabela 1 apresenta as condições iniciais da síntese em termos de concentração de sacarose e maltose. Para todos os ensaios foi utilizada a mesma atividade enzimática (22 UDS/mL). Tabela 1. Concentrações de sacarose e maltose utilizadas nas sínteses. Ensaio Sacarose Maltose (mm) (mm) 1 25,000 25, , , ,000 25, , , , , , , ,500 25, , , , ,500 Análise dos produtos de síntese Os produtos obtidos com a síntese enzimática nas condições apresentadas na Tabela 1 foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Para isso foi utilizado um Cromatógrafo Líquido Varian ProStar equipado com duas bombas modelo 210, detector de índice de refração modelo 350 e forno para termostatização da coluna Eldex CH modelo 150. Os carboidratos foram separados em uma coluna Aminex HPX -87 C (300 mm x 7.8 mm) à temperatura de 85 o C. A fase móvel era constituída de água deionizada com fluxo de 0,3 ml/min. A temperatura do detector foi de 45 o C. Os ensaios foram realizados em duplicata. RESULTADOS E DISCUSSÃO A síntese foi conduzida por tempo suficiente para o consumo total da sacarose calculado com base na atividade enzimática. Os resultados, em temos de dextrana, maltooligossacarídeos bem como o rendimento em dextrana com base na sacarose consumida e de maltooligossacarídeos com base na maltose consumida são apresentados na Tabela 2. Os resultados referentes à dextrana expressos em mmol/l são baseados na glicose que foi polimedrizada. Tabela 2. Concentração de carboidratos e maltooligossacarídeos. Dext (mmol/l) Maltolig (mmol/l) Y DXT (%) Y ISOM (%) 1 0,61 14,57 1,15 39,54 2 0,75 25,11 1,41 11,85 3 1,43 15,92 0,68 21,99 4 1,09 58,87 0,52 23,80 5 0,91 12,90 1,72 10,37 6 1,30 64,05 0,62 40,06 7 1,30 13,92 0,99 25,48 8 0,80 38,75 0,60 16,88 9 1,21 38,71 0,92 27,24 Os resultados apresentados na Tabela 2 foram analisados pelos gráficos de superfície de resposta com o auxílio do software Statistica 5.0 (Statsoft). A Figura 1 apresenta a superfície de resposta obtida para a dextrana e a Figura 2 apresenta a superfície de resposta obtida para os maltooligossacarídeos em função das concentrações iniciais de sacarose e maltose.

5 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 5/7 Figura. 1 Dextrana obtida em função da concentração de maltose e sacarose inicial. é necessário um consumo prévio da maltose para a formação dos mesmos juntamente disponibilidade de sacarose não consumida no reator para o alongamento da cadeia. Os rendimentos em maltooligossacarídeos com base na maltose consumida e os rendimentos em dextrana com base na sacarose consumida são apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente. Essas Figuras apresentam o rendimento em termos de substrato consumido para cada resposta, sendo considerada somente a sacarose para dextrana, uma vez que a dextrana é proveniente somente da sacarose, e a maltose para maltooligossacarídeos uma vez que estes produtos são formados a partir da maltose. Figura 2. Maltooligossacarídeos obtidos em função da concentração de maltose e sacarose inicial. De acordo como os resultados apresentados na Figura 1, a síntese de dextrana é fortemente favorecida com o aumento da concentração de sacarose e quase não é afetada com o aumento da concentração de maltose, sendo minimizada quando baixas concentrações de sacarose são empregadas. A produção de maltooligossacarídeos é mais favorecida pelo aumento da sacarose do que pelo aumento da maltose (Figura 2). Isso se deve ao fato de que Figura 3. Rendimento em maltooligossacarídeos com base na maltose consumida.

6 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 6/7 maltose e sacarose são empregadas no reator. NOMENCLATURA Dxt Maltolig Y DXT Y Malt0olig Dextrana (mmol/l) maltooligossacarídeos (mmol/l) Rendimento em dextrana (%) Rendimento em maltooligossacarídeos (%) REFERÊNCIAS Figura 4. Rendimento em dextrana com base na sacarose consumida. O rendimento em maltooligossacarídeos decresce quando baixas concentrações de sacarose presentes no reator, mesmo quando altas concentrações de maltose são empregadas (Figura 3). Com relação ao rendimento em dextana apresentado na Figura 4, é observado que são obtidos altos rendimentos quando ocorre um aumento da concentração de sacarose e que a maltose tem pouca influência no rendimento em dextrana. CONCLUSÕES De acordo com os resultados apresentados (Tabela 2), a condição inicial do sistema que maximiza o rendimento em maltooligossacarídeos minimizando a produção de dextrana é a condição dada pelo ensaio 6 onde altas concentrações de maltose e de sacarose são utilizadas. De forma geral, os resultados apresentados na Tabela 2 indicam que o rendimento máximo em maltooligossacarídeos é obtido quando razões equimolares de maltose/sacarose são empregadas, ou seja quando quantidades iguais de ALSOP, L., Industrial production of dextran, Progress Ind. Microbiol., v.18, p.1-44, BARROS NETO, B., SCARMINIO, I. S., BRUNS, R. E., Planejamento e Otimização de Experimentos, Campinas: Editora da UNICAMP, 299 p., BAZÁN, JUAN HERALDO VILOCHE, Estudo da produção enzimática de dextrana clínica. Dissertação de Mestrado, Campinas: Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, 136 p., DUBOIS, M., GILLES, K. A., HAMILTON, P. A., REBERS, P. A. e SMITH, F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem. 28, p , GUIMARÃES, D. R. B., COSTA, F. A. A., RODRIGUES, M. I., AND MAUGERI, F., Optimization of dextran synthesis and acidic hidrolisys by surface response analysis, Brazilian J. Chem. Eng., v.16, n.2, p , june, HEINCKE, C., DEMUTH, B., JÖRDENING, H. J. AND BUCHHOL, K., Kinetics of the dextransucrase acceptor with maltose experimental results and modeling., Enzyme and Microbial

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