D(-) LACTIC ACID PRODUCTION BY Sporolactobacillus nakayamae: OPTIMIZATION OF FERMENTATION PARAMETERS

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1 PRODUÇÃO DE D(-) ÁCIDO LÁTICO POR Sporolactobacillus nakayamae: OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS DE FERMENTAÇÃO D(-) LACTIC ACID PRODUCTION BY Sporolactobacillus nakayamae: OPTIMIZATION OF FERMENTATION PARAMETERS Susan Michelz Beitel (1) Daiane Cristina Sass (2) Luciana Fontes Coelho (3) Jonas Contiero (4) Resumo O ácido lático é um dos mais importantes ácidos orgânicos que está sendo extensivamente utilizado numa série de aplicações industriais e biotecnológicas. S. nakayamae, uma bactéria ácido láctica homofermentativa, produtora de D(-) ácido lático com elevada pureza óptica, foi usada neste estudo. Alguns parâmetros de fermentação foram estudados com o objetivo de otimizar o processo de produção de ácido lático. Tais parâmetros compreendem: variação de temperatura, ph, e agitação. As fermentações foram realizadas em biorreator Infors HT Multifors 2, contendo 0,27 L de meio GYP modificado. O ph da fermentação foi controlado por adição de NaOH 10N e a fermentação foi conduzida por 48 horas. As concentrações de ácido láctico e sacarose foram determinadas por cromatografia líquida (HPLC). S. nakayamae produziu 107,67 g/l de D(-) ácido lático a partir de açúcar cristalizado, sais e extrato de levedura a 35 C, ph 6,0, 125 rpm. Os resultados indicam que S. nakayamae é um promissor produtor de D(-) ácido láctico. Palavras-chave: Fermentação submersa. Ácido lático. Sporolactobacillus nakayamae. Abstract Lactic acid is one of the most important organic acid which is being extensively used in a range of industrial and biotechnological applications. S. nakayamae a homofermentative lactic acid bacterium D( ) lactic acid producer with high optical purity was used in this study. Some fermentation parameters were studied in order to optimization the lactic acid production process. These parameters comprise: a range of temperature, ph and agitation. Fermentations were carried on bioreactor Infors HT Multifors2, containing 0,27 L modified GYP medium. The ph of the fermentation was controlled by addition of NaOH 10N, the fermentation was carried for 48 hours. Lactic acid and sucrose concentration was determined 1 Doutoranda em Microbiologia Aplicada pela UNESP-Rio Claro. Endereço eletrônico: susan_mibe@hotmail.com 2 Doutora em Química pela USP. Docente da UNESP- Rio Claro. Endereço eletrônico: daiane_sass@hotmail.com 3 Doutora em Microbiologia Aplicada pela UNESP- Rio Claro. Endereço eletrônico: lufonco@yahoo.com.br 4 Doutor em Engenharia de alimentos pela UNICAMP. Docente da UNESP Rio Claro. Endereço eletrônico: jconti@rc.unesp.br

2 by high performance liquid chromatography system. S. nakayamae has produced 107,67 g/l of D(-) lactic acid from crystallized sugar, salts and yeast extract at 35 C, ph 6.0, 125 rpm. The results indicate that S. nakayamae is a promising new D(-) lactic acid producer. Keywords: Submerged Fermentation. Lactic acid. Sporolactobacillus nakayamae. 1 Introdução O ácido lático (ácido 2-hidroxipropanóico) é um ácido orgânico, uma das menores moléculas opticamente ativas que pode se apresentar sob duas formas enantioméricas, D(-) ou L(+). Pode ser manufaturado por síntese química tendo como base a lactonitrila, ou obtido através de processos fermentativos (NARAYANAN et al., 2004). O ácido lático é um produto amplamente empregado nos mais diversos setores da indústria, como o têxtil, farmacêutico, indústria química entre outros (ALTAF et al., 2006). Diante da expressiva aplicabilidade industrial do D(-) ácido lático e da necessidade de se desenvolver processos de produção economicamente mais competitivos, este estudo tem como objetivo estabelecer as melhores condições para a produção de D(-) ácido lático pelo micro-organismo S. nakayamae através de modificações dos parâmetros da fermentação. 2 Material e Métodos Micro-organismo e Inóculo O micro-organismo S. nakayamae utilizado no trabalho é um bacilo gram +, homofermentativo produtor de D(-) ácido lático e formador de esporos. Está armazenado em meio GYP (Glucose-Yeast-Peptona) e glicerol 30 %, na proporção de 1:1 (v/v) à -80 C. O micro-organismo foi crescido por aproximadamente 24 horas à 35 C, ou até atingir Densidade Óptica (DO 600 ) de 2,5. O volume de inóculo foi 10% do volume total de cultivo. Condições de cultivo As fermentações foram realizadas em reator Multifors 2, com volume de trabalho inicial de 300 ml, e injeção automática de base (NaOH 10N) para controle do ph. Variaramse as condições de cultivo, que são apresentas a seguir. Amostras coletadas ao final da fermentação (48 horas) foram utilizadas para quantificação de D(-) ácido lático e sacarose residual.

3 Efeito de diferentes temperaturas na produção de D(-) Ácido lático Neste experimento foram estudadas diferentes temperaturas no processo fermentativo (31 ºC, 33 ºC, 35 ºC, 37 ºC e 39 ºC). O ph foi mantido em 6.0 e agitação de 100 RPMs. O meio de cultivo utilizado foi composto por 110 g/l açúcar cristal, 35 g/l extrato de levedura Bionis e 7,5 ml/l solução de sais GYP. Produção de D(-) ácido lático utilizando diferentes phs O efeito do ph para produção do ácido lático foi estudado na faixa de 5.0 a 7.0 com intervalo de 0,5 unidades. Os phs foram mantidos por adição automática intermitente de NaOH 10N, a temperatura do processo foi de 35 ºC e a agitação de 100 RPMs. O meio de cultivo utilizado foi composto por 110 g/l açúcar cristal, 35 g/l extrato de levedura Bionis e 7,5 ml/l solução de sais GYP. Produção de D(-) ácido lático pelo S. nakayamae sob diferentes agitações Diferentes agitações foram avaliadas durante o processo de produção de ácido lático por fermentação, sendo elas 0, 50, 75, 100, 125, 150 RPM. As fermentações foram conduzidas nas seguintes condições: temperatura 35 ºC, ph 6.0 e 10% de volume de inóculo. O meio de cultivo utilizado foi composto por 110 g/l açúcar cristal, 35 g/l extrato de levedura Bionis e 7,5 ml/l solução de sais GYP. Quantificação do ácido lático e da sacarose Ao final da fermentação, as alíquotas coletadas foram centrifugadas à 7000x g por 10 minutos, e o sobrenadante apropriadamente diluído e filtrado por membrana de acetato celulose, foi utilizado para quantificação do ácido lático e sacarose. Foi empregado o cromatógrafo líquido de alto desempenho, equipado com coluna Rezex ROA (300 x 7,8 mm) da Phenomenex, eluída com H 2 SO 4 0,005N como fase móvel, fluxo de 0,6 ml/min, volume de injeção de 5 µl e temperatura de 65 C. 3 Resultados e Discussão

4 Produção de D(-) ácido lático utilizando diferentes temperaturas Verifica-se que, quando a fermentação foi conduzida à temperatura de 35 ºC, uma concentração mais elevada de ácido lático (99,43 g/l) é produzida em comparação às outras temperaturas avaliadas. Foi possível observar que temperaturas mais elevadas são inibitórias para o desenvolvimento do micro-organismo e produção do ácido lático, apresentando 29,23 g/l de ácido lático à 39 ºC. Chang et al (2008) reporta em seu estudo a temperatura ótima de crescimento de várias espécies do gênero Sporolactobacillus, sendo 30 ºC para as espécies terrae e nakayamae subsp racemicus, e 37 ºC para vineae, inulinus, kofuensis e nakayamae subsp nakayamae. Produção de D(-) ácido lático utilizando diferentes phs Níveis mais elevados de ácido lático (99,43 g/l), e baixos de sacarose residual (3,45) foram verificados em ph 6.0.Máxima produtividade e rendimento foram verificados em ph 6.0 apresentando os valores de 2,07 g/l.h e 0,91 g/g, respectivamente. Quando não utilizado o controle de ph, a produção de ácido lático foi reduzida (27,04 g/l) e o ph final da fermentação foi 3.0, indicando que o ácido lático inibe o crescimento bacteriano devido ao declínio do ph do meio. Resultados similares foram reportados por Lima et al (2011) ao estudar a produção de D (-) ácido lático por Lactobacillus sp. LMI8, neste estudo a produção também foi reduzida na ausência de controlador de ph, e o ph ótimo de produção (52,37 g/l) foi 6.0. Produção de D(-) ácido lático pelo S. nakayamae sob diferentes agitações Após 48 de fermentação verificou-se que na condição de agitação de 125 RPM houve produção de ácido lático mais elevada (107,67 g/l), nesta condição não foi detectada sacarose residual. Os valores produtividade (2,24 g/l.h) e rendimento (0,98 g/g) também foram mais elevados nesta condição. Agitações menores, e até ausência de agitação, induziram uma menor produção de ácido lático, assim como menor produtividade. Uma maior agitação apresenta a vantagem de melhor solubilidade dos componentes do meio, permitindo um maior contato entre os nutrientes disponíveis para o micro-organismo. 4 Conclusões

5 O micro-organismo S. nakayamae foi capaz de produzir altos níveis de D(-) ácido lático. Entre as condições estudadas neste trabalho, maiores agitações (125 RPM) em ph 6.0 e temperatura de 35 ºC, proporcionaram uma produção mais elevada de D(-) ácido lático, apresentando baixo teor de sacarose residual ao final do processo, facilitando a posteiror purificação do meio fermentado. Os resultados demonstram que S. nakayamae é uma linhagem promissora para produção de D(-) ácido lático. 5 Agradecimentos/Apoio financeiro Braskem, FAPESP, CNPq Referências ALTAF, M.; NAVEENA, B.J.; VENKATESHWAR, M.; KUMAR, E.V.; REDDY, G. Single step fermentation of starch to L(+) lactic acid by Lactobacillus amylophilus GV6 in SSF using inexpensive nitrogen sources to replace peptone and yeast extract optimization by RSM. Process Biochem. v.41, n.2, p , CHANG, Y.-H.; JUNG, M.Y.;Park,I.-S.; Oh, H.M. Sporolactobacillus vineae sp. nov., a spore-forming lactic acid bacterium isolated from vineyard soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. v.58, n.10, p , LIMA, C.J.B.; COELHO, L.F.; CONTIERO, J. The use of response surface methodology in optimization of lactic acid production: Focus on medium supplementation, temperature and ph control. Food Technol Biotech. v.48, n.2, p , NARAYANAN, N.; ROYCHOUDHURY, P.K.; SRIVASTAVA, A. L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization. Eletron. J. Biotechno. v. 7, n.2, p , 2004.