PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO POR BACTÉRIAS LÁTICAS IMOBILIZADAS EM MEIO COMPOSTO POR RESÍDUOS DA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

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1 PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO POR BACTÉRIAS LÁTICAS IMOBILIZADAS EM MEIO COMPOSTO POR RESÍDUOS DA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS C.E.S. Oliveira 1, C.L.C. Pinho 2, R.L. Araújo 3, I.M. Ferreira 4, W.S. Cotrim 5 1-Curso de Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Ciências Extas e da Terra CEP: Mato Grosso MT Brasil Telefone: 55 (66) e- mail: (caroline.sgarbosa@gmail.com) 2-Curso de Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Ciências Extas e da Terra CEP: Mato Grosso MT Brasil Telefone: 55 (66) e- mail: (carolinacpinho@gmail.com) 3-Programa de Pós-Graduação em Ciência de Materiais Instituto de Ciências Extas e da Terra - Universidade Federal de Mato Grosso CEP: Mato Grosso MT Brasil, Telefone: 55 (66) e- mail: (araujorenata11@gmail.com) 4-Curso de Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Ciências Extas e da Terra CEP: Mato Grosso MT Brasil Telefone: 55 (66) e- mail: (ivanamarquesferreira@gmail.com) 5-Curso de Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Ciências Extas e da Terra CEP: Mato Grosso MT Brasil, Telefone: 55 (66) e- mail: (wcotrim@gmail.com) RESUMO Neste trabalho estudou-se a produção de ácido lático em reator batelada utilizando como substrato soro de leite suplementado com diferentes concentrações de extrato de levedura Saccharomyces cerevisiae (EL), água de maceração de milho e vinhaça por ação de cultura mista de células imobilizadas em alginato de cálcio de Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB- 12 e Streptococcus thermophilus. A Temperatura adotada foi de 40 C e ph inicial igual a 7 para todos os tratamentos. Foi estudado o fator concentração (0%, 2% e 4%) para o meio suplementado com EL e (0%, 5% e 10%) para ambos os meios suplementados com água de maceração de milho e vinhaça. A suplementação do soro de leite, produziu mais ácido lático que o tratamento controle, sendo observados incrementos de 61% para EL, 48% para vinhaça e 17% para água de maceração de milho. ABSTRACT In the present work studied the lactic acid production in reactor batch using as whey substrate supplemented with different yeast extract concentrations Saccharomyces cerevisiae (EL), corn steep liquor and stillage by the action of mixed culture of immobilized cells in calcium alginate in Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 and Streptococcus thermophilus. The chosen temperature was 40 C and an initial ph of 7 for all treatments. It was studied the concentration fator (0%, 2% and 4%) to the supplemented medium with EL and (0%, 5% and 10%) for both media supplemented with corn steep liquor and stillage. The addition of whey, lactic acid produces more than control, and 61% increases observed for EL, 48% to vinasse and 17% corn steep liquor. PALAVRAS-CHAVE: soro de leite; suplementação; células imobilizadas. KEYWORDS: whey; supplementation; immobilized cells.

2 1. INTRODUÇÃO O ácido lático é um composto orgânico que pode ser utilizado em vários setores industriais, desde o alimentício, passando pelas indústrias farmacêuticas até o setor ambiental na manufatura de polímeros poliláticos (PLA), de natureza biodegradável e biocompatível que podem substituir os derivados do petróleo na produção de plásticos (Abdel-Rahman et al., 2013). De acordo com Abdel-Rahman et al. (2013), os principais custos associados com a produção do ácido lático devem-se ao substrato de fermentação utilizado, geralmente um carboidrato simples e uma fonte de nitrogênio. O uso de fontes purificadas de carboidratos e nitrogênio torna quase proibitivo a operação do processo, sendo necessário o uso de fontes alternativas (Vink et al., 2007). Diante a este fato, diversos subprodutos e matérias-primas da indústria de alimentos e/ou da agroindústria têm sido empregados para a produção de ácido lático pela alta disponibilidade e baixo custo, tais como o soro de leite, água de maceração de milho, xarope de milho, levedura de destilaria e vinhaça (Moraes et al., 1991). Dentre esses, o soro de leite apresenta uma composição rica em lactose, proteínas, gorduras, vitaminas e sais minerais, atendendo a maioria dos requisitos nutricionais dos micro-organismos fermentadores (Panesar et al., 2007), a vinhaça se destaca como meio de cultivo nos processos fermentativos, em virtude do alto teor de açúcares, nitrogênio e vitaminas, sendo considerado uma fonte de carbono renovável, abundante e de baixo custo (Paton et al., 1992; Mcghie, 1993) e a água de maceração de milho (AMM) é uma excelente fonte de nitrogênio para a maioria dos micro-organismos devido a sua alta concentração de aminoácidos e polipeptídeos com consideráveis concentrações de vitaminas do complexo B (Cardinal e Hedrick, 1948). As bactérias do ácido lático (BAL) são o grupo mais largamente utilizado na produção do ácido lático, entretanto, esse grupo de micro-organismos necessita de uma suplementação do meio com fonte de aminoácidos e vitaminas lipossolúveis (Abdel-Rahman et al., 2013). Nesse sentido, o extrato de levedura, apresenta-se como uma alternativa barata para a suplementação dos substratos, pois o mesmo é rico em aminoácidos e vitaminas do complexo B (Djukic-Vukovic et al., 2012). Assim, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção de ácido lático em reator batelada com células imobilizadas de cultura mista de Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus em diferentes resíduos da indústria de alimentos (soro de leite, vinhaça e água de maceração de milho). 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1Preparo da Pré-Cultura Microbiana Para o preparo da pré-cultura microbiana, 0,08g da cultura láctica desidratada (Bio-Rich ) foi reativada em 200 ml de leite UHT, previamente aquecido a 45 C, e incubado durante 1 h a 45 C. 2.2 Imobilização das Células As células microbianas foram imobilizadas pelo método de aprisionamento em gel de alginato de cálcio (Araújo, 2015). A pré-cultura microbiana foi adicionada em suspensão de alginato de cálcio, formando uma mistura. Essa mistura foi gotejada, com auxílio de uma bureta, em solução de cloreto cálcio 0,2 M, sobre agitação e mantida assim por 30 min a 37 C. As esferas foram separadas por filtração simples e lavadas duas vezes com água destilada para remoção do excesso dos íons de cálcio.

3 2.3 Preparo do Extrato de Levedura e do Meio de Fermentação O extrato de levedura úmido foi obtido a partir da fermentação alcoólica de solução de açúcar mascavo 15% (m/m), adicionado da levedura Saccharomyces cerevisiae desidratada e fermentado por 48 h a 30 C. Esse produto da fermentação alcoólica foi centrifugado a 3500 rpm por 15 min, e armazenado em frasco de vidro hermeticamente fechado na geladeira até o momento do uso. A vinhaça foi obtida a partir da fermentação de solução de caldo-de-cana 18% (m/m), adicionado da levedura Saccharomyces cerevisiae desidratada, fermentado por 48 h a 30 C, destilada e pasteurizada a 90ºC por 3 h em banho-maria. Para a obtenção da água de maceração de milho foi adicionado em um erlenmeyer 300g de milho e 1000 g de água ultra pura com ph inicial igual a 4. Essa mistura foi levada à incubadora Shaker a 48 C durante 48 h. Posteriormente, a água de maceração foi filtrada e pasteurizada a 90 C por 3 h em banho-maria. O soro de leite foi obtido pela coagulação de leite pasteurizado, filtrado e pasteurizado a 90ºC por 3 h. Os meios de fermentação foram compostos por: soro de leite adicionado de extrato de levedura, nas concentrações 0%, 2% e 4%; soro de leite adicionado de vinhaça e soro de leite adicionado de água de maceração de milho, ambos nas concentrações 0%, 5% e 10%, baseadas no teor de sólidos solúveis presentes no soro de leite. Todas as fermentações foram padronizadas para ph inicial igual a 7, adicionadas de 16 g de esferas de alginato contendo as células imobilizadas e incubadas em estufa a 40 C por 360 min. Nos tempos 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min e 360 min uma alíquota de 50 ml era retirada para verificar o ph e a acidez titulável. Todo o experimento foi realizado com três repetições. Adotou-se delineamento inteiramente casualizado (DIC). Os dados foram analisados no software Action 2.9, através de análise de variância (ANOVA), teste de comparações múltiplas (TUKEY) adotando o nível de 5% de probabilidade. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1Soro de Leite Suplementado com Extrato de Levedura Os dados de fermentação com soro de leite suplementado com extrato de levedura são apresentados na Tabela 1. Após 60 min de fermentação os tratamentos com suplementação com extrato de levedura já apresentaram valores superiores (p>0,05) ao tratamento controle. Ao final do experimento o tratamento com 2% de suplementação com EL foi superior (p<0,05) ao tratamento controle e inferior (p<0,05) ao tratamento com 4% de suplementação, evidenciando que o aumento nos níveis de suplementação com EL promove aumento na produção de ácido lático. Segundo Mi-Young et al., (2003), o extrato de levedura satisfaz as exigências nutricionais das bactérias do ácido lático, visto que esses micro-organismos apresentam complexas exigências nutricionais para o seu desenvolvimento, favorecendo o aproveitamento das fontes de carbono e a produção de ácido lático (Reddy et al., 2008).

4 Tabela 1. Teores de ácido lático (mol.l -1 ) produzido por cultura mista de bactérias láticas (Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus), imobilizadas em esferas de alginato de cálcio, em soro de leite suplementado com 0%, 2% e 4% de extrato de levedura (EL), ao longo de 360 min de fermentação. 0% 2% 4% Tempo (min) Média ±DP Média ±DP Média ±DP 0 0,0092 a 0,0000 0,0092 a 0,0000 0,0092 a 0, ,0105 a 0,0006 0,0115 a 0,0006 0,0122 a 0, ,0112 a 0,0000 0,0132 b 0,0000 0,0136 b 0, ,0129 a 0,0006 0,0149 b 0,0006 0,0153 b 0, ,0146 a 0,0006 0,0166 b 0,0006 0,0173 b 0, ,0163 a 0,0010 0,0200 b 0,0006 0,0207 b 0, ,0200 a 0,0006 0,0292 b 0,0006 0,0302 b 0, ,0227 a 0,0006 0,0346 b 0,0010 0,0366 c 0,0000 Médias seguidas por letras iguais, na mesma linha, não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. DP: Desvio padrão 3.2Soro de Leite Suplementado com Vinhaça A suplementação do soro de leite com vinhaça foi eficiente em aumentar a produção de ácido lático, conforme pode ser observado na Tabela 2. Após 120 min de fermentação o teor de ácido lático nos tratamentos com 5% e 10% de suplementação com vinhaça foram cerca de 26% maiores (p<0,05) que o tratamento controle (0%). Ao final do experimento o teor de ácido lático foi até 48% maior (p<0,05) nos tratamentos suplementados com vinhaça que o observado no tratamento não suplementado, evidenciando o efeito positivo da suplementação da vinhaça na produção de ácido lático. Entretanto, exceto no tempo 180 min, não foram observados ganhos significativos na produção de ácido lático entre os tratamentos 5% e 10%. Suplementações superiores a 5% não apresentam ganhos significativos na produção de ácido lático. Tabela 2. Teores de ácido lático (mol.l -1 ) produzido por cultura mista de bactérias láticas (Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus), imobilizadas em esferas de alginato de cálcio, em soro de leite suplementado com 0%, 5% e 10% de vinhaça, ao longo de 360 min de fermentação. Tempo (min) 0% 5% 10% Média ±DP Média ±DP Média ±DP 0 0,0070 a 0,0000 0,0070 a 0,0000 0,0070 a 0, ,0077 a 0,0006 0,0080 a 0,0000 0,0080 a 0, ,0087 a 0,0006 0,0090 a 0,0000 0,0093 a 0, ,0090 a 0,0000 0,0113 b 0,0006 0,0113 b 0, ,0100 a 0,0000 0,0130 b 0,0000 0,0140 c 0,0000

5 240 0,0123 a 0,0006 0,0153 b 0,0006 0,0164 b 0, ,0157 a 0,0006 0,0217 b 0,0006 0,0227 b 0, ,0214 a 0,0023 0,0307 b 0,0006 0,0317 b 0,0021 Médias seguidas por letras iguais, na mesma linha, não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. DP: Desvio padrão 3.3Soro de Leite Suplementado com Água de Maceração de Milho Conforme apresentado na Tabela 3, a suplementação do soro de leite com água de maceração de milho não apresentou diferença significativa na produção de ácido lático até o tempo 240 min. Após 300 min observa-se que a suplementação contribuiu para o aumento na produção de ácido lático, sendo observado incremento de 13,5% e 23,5% nos tratamentos 5% e 10%, respectivamente, em relação ao tratamento controle (0%). Ao final do experimento, os dados demonstraram a que a suplementação do soro de leite com água de maceração de milho foi capaz de produzir cerca de 17% mais ácido lático que o soro não suplementado. Tabela 3. Teores de ácido lático (mol.l -1 ) produzido por cultura mista de bactérias láticas (Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus), imobilizadas em esferas de alginato de cálcio, em soro de leite suplementado com 0%, 5% e 10% de água de maceração de milho, ao longo de 360 min de fermentação. Tempo (min) 0% 5% 10% Média ±DP Média ±DP Média ±DP 0 0,0070ª 0,0000 0,0070ª 0,0000 0,0070ª 0, ,0083ª 0,0006 0,0083ª 0,0006 0,0083ª 0, ,0090ª 0,0000 0,0090ª 0,0000 0,0090ª 0, ,0107ª 0,0006 0,0113ª 0,0006 0,0113ª 0, ,0137ª 0,0006 0,0137ª 0,0006 0,0140ª 0, ,0170ª 0,0000 0,0174ª 0,0006 0,0177ª 0, ,0200 a 0,0010 0,0227 b 0,0006 0,0247 c 0, ,0277 a 0,0012 0,0324 b 0,0006 0,0324 b 0,0012 Médias seguidas por letras iguais, na mesma linha, não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. DP: Desvio padrão 4. CONCLUSÃO A adição do extrato de levedura, vinhaça e água de maceração de milho contribuíram significativamente para o aumento na taxa de produção de ácido lático em cultura mista de Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus.

6 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abdel-Rahman, A. M.; Tashiro, Y.; Sonomoto, K. (2013) Recent advances in lactic acid production by microbial fermentation processes. Biotechnology Advances, 31, Cardinal, E.V.; Hedrick, L.R. (1948). Microbiological assay of corn steep liquor for amino acid content. J. Biol. Chem. 172, Araújo, R. L. (2015). Produção de ácido lático em reator batelada com células livres e imobilizadas de cultura mista de Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptococcus thermophilus em soro de leite suplementado com extrato de levedura. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Engenharia de Alimentos). Universidade Federal de Mato Grosso - Campus Universitário do Araguaia, Barra do Garças. Djukic-Vukovic, A. P.; Mojovic, L.; Vukašinovic-Sekulic, M.; Rakin, M.; Nikolic, S.; Pejin, D.; Bulatovic, L. (2012). Effect of different fermentation parameters on lactic acid production from liquid distillery stillage. Food Chemistry, 134, Mi-Young, H. et al. (2003) Kinetics analysis of growth and lactic acid production in ph-controlled batch cultures of Lactobacillus casei KH-1 using yeast Extract / corn Steep liquor / glucose medium. J Biosci Bioeng, 96 (2), Moraes, I. O.; Capalbo, D. M. F.; Moraes, R. O. (1991). Multiplicação de agentes de controle biológico. In: BETTIOL, W. (Ed.). Controle biológico de doenças de plantas. Brasília: EMBRAPA Panesar, P. S., Kennedy, J. F., Gandhi, D. N., Bunko, K. (2007) Bioutilisation of whey for lactic acid production. Food Chemistry, 105, Vink, E. T. H.; Glassner, D. A.; Kolstad, J. J.; Wooley, R. J.; O Connor, R. P. (2007). The eco-profiles for current and near-future NatureWorks polylactide (PLA) production. Industrial Biotechnology, 3 (1),