ESTUDO DE BIOSSURFACTANTE COMERCIAL PARA APLICAÇÃO AMBIENTAL

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1 ESTUDO DE BIOSSURFACTANTE COMERCIAL PARA APLICAÇÃO AMBIENTAL Ferreira I.N. (1).; Brasileiro P.P.F. (1) ; Rufino. R.D. (1) ; Luna J.M (. 1) ; Sarubbo. L.A. (1) isabelanatalia13@hotmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, CAPES, FACEPE. RESUMO Biossurfactantes são metabólitos produzidos por bactérias e leveduras e alguns fungos. Esses compostos, em virtude de sua compatibilidade com o meio ambiente, têm sido cada vez mais estudados. Dessa forma, o presente estudo teve como principal objetivo formular um aditivo estável, à base de biossurfactante. O líquido metabólico livre de células contendo o biossurfactante de Pseudomonas sp produzido em biorreator, foi submetido à adição de 0,2% de sorbato de potássio, a fim de testar sua estabilidade frente a diferentes variações de ph, temperatura e sal. Após formulação dos líquidos metabólicos contendo o biossurfactante produzido, as amostras foram estocadas à temperatura ambiente por 180 dias. Durante esse período foram realizados testes de tensão superficial, atividade de emulsificação e capacidade de dispersão, nos intervalos de tempo: 0, 15, 30, 70, 110 e 180 dias. A tensão superficial apresentou variações em torno de 26 a 30mN/m. A atividade de emulsificação alcançou valores de 100% com óleo de motor, e a capacidade de dispersão também apresentou índices de 100% com a proporção de 1:25 (biossurfactante/óleo). Dessa forma, pode-se concluir que o biossurfactante de Pseudomonas sp pode ser usado como coadjuvante no controle da poluição causada por derivados de petróleo, em ambientes aquáticos.

2 Palavras-chave: Tensão Superficial, Atividade de Emulsificação, Biorremediação. INTRODUÇÃO No Brasil, acidentes envolvendo hidrocarbonetos derivados de petróleo têm causado sérios problemas ambientais. Dessa forma, o desenvolvimento de procedimentos e técnicas de combate à poluição ambiental por derivados de petróleo torna-se mais importante a cada dia. Dentre as técnicas de remediação disponíveis, a biorremediação tem se destacado, embora a solubilidade reduzida dos hidrocarbonetos dificulte o acesso dos micro-organismos e a consequente biodegradação do poluente (RUFINO et al., 2013). Uma das possíveis soluções para a baixa disponibilidade dos poluentes hidrofóbicos consiste no uso de surfactantes. Esses compostos são formados por estruturas moleculares contendo porções hidrofílicas e hidrofóbicas que tendem a se distribuir nas interfaces entre as fases fluidas com diferentes graus de polaridade (óleo/água e água/óleo). Estas propriedades promovem a redução da tensão superficial e interfacial, conferindo a capacidade de detergência, emulsificação, lubrificação, solubilização e dispersão de fase. A eficiência e a efetividade são características básicas essenciais que determinam um bom surfactante. A eficiência é medida através da CMC, enquanto que a 2

3 efetividade está relacionada com os valores de tensão superficial e interfacial, os quais devem ser reduzidos ((SANTOS et al., 2013). Os biossurfactantes apresentam inúmeras vantagens sobre os surfactantes de origem química, tais como baixa toxicidade, estabilidade frente à ampla faixa de ph e temperaturas elevadas, bem como resistência a elevadas concentrações salinas (LUNA et al., 2013). Os resíduos industriais têm despertado grande interesse dos pesquisadores como alternativa para o fornecimento de substratos de baixo custo para a produção de biossurfactantes, uma vez que a escolha do substrato possa representar uma redução de até 40% do custo total do processo. Resíduos de destilaria, soro de queijo, melaço e efluente de óleo de oliva, entre outros, têm sido descritos como substratos para a produção de biossurfactantes (RUFINO et al., 2008). Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo formular um aditivo à base de biossurfactante estável para aplicação como coadjuvante da biorremediação de ambientes aquáticos. 3

4 MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo A Pseudomonas sp. isolada em área portuária e depositadas no Banco de Culturas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais (NPCIAMB) da Universidade Católica de Pernambuco foi testada como produtora do biossurfactante. Meio de crescimento do inoculo Para crescimento do inóculo foi utilizado o meio Caldo Nutritivo (CN), com a seguinte composição: Extrato de carne (5,09g), Peptona (15,0g), NaCl (5,0g), K 2 HPO 4 (5,0g), Água destilada (1,0L), ph (7,0). Meio de produção O meio mineral utilizado foi descrito por Bushnell e Hass (1941), acrescido das fontes de carbono (melaço de cana) e nitrogênio (milhocina) adicionadas nas concentrações de 3% cada. Preparação do inoculo Culturas jovens da bactéria obtidas após 24 horas de cultivo em meio AN foram transferidas para frascos de Erlenmeyer contendo 50 ml de Caldo Nutritivo (CN), o qual foi mantido sob agitação orbital de 150 rpm durante um período de horas a 28 C para obtenção de uma D.O. (Densidade Óptica) de 0,7 (correspondente a um inóculo de

5 U.F.C./mL) a 600 nm. Esta leitura foi utilizada como inóculo na concentração de 3% (v/v). Produção do biossurfactante As fermentações para produção dos biossurfactantes foram realizadas em biorreator de 50L de capacidade, contendo o meio de produção e incubados com 3% do pré-inoculo. O biorreator foi mantido sob agitação durante 48 horas, à temperatura de 28 C. Ao fim do cultivo, amostras foram retiradas para determinação da tensão superficial e do rendimento em biossurfactante isolado. Determinação da tensão superficial: a tensão superficial foi medida no líquido metabólico livre de células em tensiômetro KSV Sigma 70 (Finland) utilizando-se o anel de NUOY. A tensão superficial foi medida através da imersão do anel de platina no líquido metabólico e registrando-se a força requerida para puxá-lo através da interface arlíquido. Capacidade de dispersão A capacidade de dispersão ou agregação de manchas de petróleo foi simulada em laboratório contaminando-se amostras de água do mar com óleo de motor. Os testes foram conduzidos pela adição do líquido metabólico livre de células 10µL em 15µL do óleo de motor. Os resultados foram observados visualmente. 5

6 Atividade de emulsificação Para a determinação da atividade de emulsificação, amostras do líquido metabólico livre de células foram analisadas segundo a metodologia descrita por Cooper e Goldenberg (1987). Estabilização do líquido metabólico com propriedade surfactante O líquido metabólico do biossurfactante produzido em biorreator foi conservado de acordo com os procedimentos: Ao líquido metabólico foi adicionado a concentração de 0,2%; de sorbato de potássio. Em seguida, o líquido metabólico tratado conforme os procedimentos descritos acima foram estocados à temperatura ambiente ao longo de 180 dias para observação da estabilidade. Testes foram realizados para determinação do tempo de estocagem (0, 15, 30, 70, 110 e 180 dias) à temperatura ambiente de ºC, verificando-se a tensão superficial, a capacidade de emulsificação e a estabilidade frente a condições específicas como presença de sal (1, 3 e 5%), aquecimento (40 e 50 ºC) e variações de ph (5, 7 e 9). Testes de dispersão/agregação também serão realizados. RESULTADOS E DISCUSSÃO A tensão superficial é a força de atração existente entre as moléculas dos líquidos (RUFINO et al., 2008). O presente estudo teve como 6

7 principal objetivo avaliar o comportamento do biossurfactante produzido frente a diferentes condições de conservação. A Figura 1 apresenta as tensões superficiais do líquido metabólico produzido por Pseudomonas sp quando submetido a diferentes variações de ph( 5, 7 e 9), temperatura (40 e 50 C) e diferentes concentrações de NaCl (1, 3 e 5%). As tensões superficiais do líquido metabólico submetido a variações de ph, apresentaram as seguintes alterações: durante os 180 dias de experimento a tensão do líquido metabólico submetido a ph 5 permaneceu em torno de 26,6 mn/m. Ao ser submetido ao ph 7 o líquido metabólico apresentou tensão superficial por volta de 28mN/m. Quando submetido a ph 9 a tensão superficial aumentou para 29,5mN/m, conforme a figura 1 A. Segundo Mulligan; Gibbs (1993), a tensão superficial de um bom biossurfactante deve ser menor que 30mN/m. A atividade de emulsificação consiste na capacidade do líquido metabólico contendo biossurfactante emulsificar o óleo e permanecer estável nessa união (RUFINO et al., 2008). A Figura 2A, B e C mostra os valores da atividade de emulsificação do líquido metabólico produzido por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação, submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e variação de ph 5, 7 e 9. 7

8 Figura 1. Tensão superficial do líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação e submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e aos seguintes procedimentos: (A) diferentes variações de ph: 5, 7 e 9; (B) diferentes temperaturas: 40 e 50 C; (C) diferentes concentrações de NaCl: 1, 3, e 5%; (D) controle. A atividade de emulsificação do líquido metabólico livre de células apresentou melhores resultados com óleo de motor nos primeiros trinta dias de experimento, em todas as variações de ph, atingindo valores de até 94% de emulsificação. Pode-se observar que o líquido metabólico de ph 5 apresentou os melhores resultados para emulsificação com óleo de soja, milho e motor, conforme Figura 2A. A figura 2D, E e F apresenta os resultados do índice de emulsificação do líquido metabólico de Pseudmonas sp, submetido a 0,2% de sorbato de potássio e adição de variadas concentrações de NaCl. Os melhores resultados foram observados na menor concentração de sal, 1%, e nos primeiros trinta dias de conservação com óleo de motor, atingindo 95% 8

9 de emulsificação. Nas imagens contendo o líquido metabólico submetido a 3 e 5% de sal pode-se observar que não há atividade de emulsificação com óleo de motor no tempo 15 dias. A figura 2G e H mostra os índices de atividade de emulsificação do líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e variações de temperatura: 40 e 50 C. Assim como nas demais variações, o líquido metabólico submetido a diferentes variações de temperatura também apresentou seus melhores resultados com óleo de motor e nos primeiros trinta dias de conservação, atingindo até 96% de emulsificação. A atividade de emulsificação do líquido metabólico com óleo de soja e óleo de milho, alcançou até 60% de emulsificação. A partir de 70 dias de conservação os índices de emulsificação não ultrapassaram 50% para todos os óleos. A Figura 3 apresenta os resultados da capacidade de dispersão, com óleo de motor, nas proporções 1:2, 1:8 e 1:25 (biossurfactante/óleo) do líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp, após adição de 0,2% de sorbato de potássio e submetido a diferentes variações de ph (5, 7 e 9); temperatura (40 e 50 C) e diferentes concentrações de NaCl (1, 3 e 5%). 9

10 Figura 2. atividade de emulsificação do líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação, submetido a adição de 0,2% de sorbato e variações de: (A) ph 5; (B) ph 7; (C) ph 9; (D) NaCl 1%; (E) NaCl 3%; (F) NaCl 5%; (G) temperatura 40 C; (H) temperatura 50 C. A Figura 3A, B e C apresentam os resultados de capacidade de dispersão do biossurfactante de Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação, submetido a adição de 0,2% de sorbato e variações de ph 5, 7e 9. Pode-se observar que no tempo zero dia de experimento a capacidade de dispersão da gota de óleo não ultrapassou valores de 16%. Os melhores resultados podem ser observados entre 15 e 70 dias de experimento, alcançando valores de até 100% de dispersão com óleo de motor. Nos demais dias a capacidade de dispersão ficou entre 33 e 77%. 10

11 Ao ser submetido a diferentes concentrações de NaCl pode-se observar melhores resultados entre 15 e 70 dias de experimento nas três proporções de óleo de motor, alcançando até 100% de dispersão da gota. Vale resaltar, que em todas a concentrações de sal o tempo zero dia apresenta valores de dispersão em torno de 7 e 16%. Nos demais dias de conservação a capacidade de dispersão do biossurfactante ficou em torno de 37 e 80%, conforme Figura 3B, C e D. Figura 3. capacidade de dispersão, com óleo de motor, nas proporções 1:2, 1:8 e 1:25 (biossurfactante/óleo) do líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp, após adição de 0,2% de sorbato de potássio e submetido a diferentes variações de: (A) ph 5; (B) ph 7; (C) ph 9; (D) NaCl 1%; (E) NaCl 3%; (F) NaCl 5%; (G) temperatura 40 C; (H) temperatura 50 C. 11

12 Ao ser submetido a variações de temperatura, a capacidade de dispersão do líquido metabólico de Pseudomonas sp apresentou até 100% de eficácia aos 70 dias de experimento, nas proporções de 1:8 e 1:25 (biossurfactante/óleo). No tempo zero dia, observa-se capacidade de dispersão em torno de 7 a 10%, conforme figura 3G e H. CONCLUSÃO Os resultados mostram que independente do método de conservação utilizado, as tensões do biossurfactante de Pseudomonas sp não apresentaram alterações significativas durante 180 dias de experimento. A atividade de emulsificação e a capacidade de dispersão do biossurfactante apresentaram resultados variados, dependendo das proporções de biossurfactante/óleo utilizadas. O biopolímero produzido e utilizado em diferentes condições de conservação, apresentou-se estável dentro das condições estudadas. Sendo dessa forma, promissor para utilização em ambientes variados para o controle da poluição causada por derivados de petróleo. 12

13 REFERÊNCIAS LUNA, J.M.; RUFINO, R.D.; SARUBBO, L.A.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Characterisation, surface properties and biological activity of a biosurfactant produced from industrial waste by Candida sphaerica UCP0995 for application in the petroleum industry. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 102, p , RUFINO, R.D.; SARUBBO, L.A.; BARROS-NETO, B.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Experimental design for the production of tensio-active agent by Candida lipolytica. Journal Industrial Microbiology and Biotechnology, 35, p RUFINO, R.D; LUNA, J.M; MARINHO, P.H.C; FARIAS, C.B.B; FERREIRA, S.R.M; SARUBBO, L.A. Removal of petroleum derivativead sorbed to soil by biosurfactant Rufisan producedby Candida lipolytica. Journal of Petroleum Science and Engineering, v. 109, p , SANTOS, D.K.F; RUFINO, R.D; LUNA, J.M; SANTOS, V.A; SALGUEIRO, A.A; SARUBBO, L.A. Synthesis and evaluation of biosurfactant produced by Candida lipolytica using animal fat and corn steep liquor. Journal of Petroleum Science and Engineering, v.105, p ,