ESTUDO DA ESTABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE PRODUZIDO EM BIORREATOR PARA BIORREMEDIAÇÃO

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1 ESTUDO DA ESTABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE PRODUZIDO EM BIORREATOR PARA BIORREMEDIAÇÃO Brasileiro, P. P. F. (1) ; Souza Filho, G. L. (1) ; Silveira, G. N. M. (1) ; Rocha e Silva, N. M. P. (1) ; Campos, J. M. (1) ; Luna, J. M. (1) ; Rufino, R. D. (1) ; Santos, W. A. (1) e Sarubbo, L. A. (1) ppfbrasileiro@hotmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, UNICAP, ANEEL, CAPES, CGTI, TERMOPE e FACEPE RESUMO Os surfactantes microbianos vieram para substituir os usuais dispersantes químicos, devido às eficazes propriedades tensoativas, baixas toxicidades e aos elevados rendimentos apresentados por essas biomoléculas. Nesse intuito, o trabalho teve o objetivo de avaliar a estabilidade do biossurfactante produzido pela levedura Candida guilliermondii produzida em biorreator (50 L), contendo 4,0% de melaço, 2,5% de milhocina e 2,5% de óleo de soja residual, durante 144 horas, sob concentração de 10 4 células/ml e agitação de 90 rpm. O líquido metabólico, centrifugado e filtrado, foi aquecido por vapor fluente e acrescido de aditivo químico para a manutenção de suas propriedades surfactantes. Ademais, condições de aquecimento, potencial hidrogeniônico e salinidade foram aplicadas para perceber os melhores resultados de aplicação do biotensoativo. Os parâmetros para mensurar a qualidade do biossurfactante foram as tensões superficiais e os índices de emulsificação e dispersão durante 120 dias. Ao final do processo, os resultados mais expressivos do biossurfactante foram tensão superficial de 27,64 mn/m, capacidade emulsificante de 100,0% em óleo motor e dispersante de 92,9%. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação do biossurfactante em água marinha.

2 Palavras-chave: Candida guilliermondii, Tensões Superficiais, Índices de Emulsificação. INTRODUÇÃO O ser humano almeja o lucro proveniente do petróleo, contudo não promove os procedimentoseficazes de segurança para o transporte desse composto hidrofóbico. Por esse motivo, vários acidentes petrolíferos ocorreram e alastraram um desequilíbrio na fauna e flora marinhas, como no Golfo do México, em 2010, por 1,5 km de extensão com o derramamento de 800 milhões de litros de petróleo. Os cientistas tentam remediar esses desastres ambientais com os surfactantes químicos, produtos petroderivados que também possuem uma elevada toxicidade e tornam o ambiente ainda mais letal (ZHOU et al., 2013). Em base ao problema citado, pesquisas estão sendo desenvolvidas para substituir os substratos empregados na produção desse agente tensoativo por resíduos e sub-produtos industriais, os quais precisam degradados por micro-organismos com potencial biotecnológico. O resultado dessa fermentação são biomoléculas com semelhantes ou melhores propriedades, rendimentos elevados e baixas toxicidades. Esse bioproduto é denominado de biossurfactante: o biorremediador do petróleo. 2

3 Esses produtos microbiológicos podem ser compostos por várias estruturas orgânicas, dentre elas glicolipídeos, lipopeptídeos, complexos proteínas-polissacarídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos e lipídeos neutros (GAUTAM; TYAGI, 2006) e apresentam dois segmentos principais na molécula, um hidrofílico e outro hidrofóbico, sendo, portanto, denominados de anfifílicos (MARCHANT; BANAT, 2012). Os surfactantes microbianos possuem diversas propriedades como as baixas tensões superficial e interfacial. Aquela permite avaliar o grau de umectação de um líquido em uma superfície, enquanto que esta indica o nível de penetrabilidade de um composto polar em um apolar. Essas duas propriedades caracterizam um biotensoativo e influenciam as demais propriedades como as capacidades emulsificante, dispersante, entre outras (DALTIN, 2011). A estabilidade é um fator essencial para viabilizar a produção em larga escala, principalmente, de um produto biotecnológico que demora a ser produzido perante a urgência da aplicação em um desastre petrolífero. Todo o óleo precisa ser retirado do oceano em cerca de 24 horas após o derramamento. Logo, a durabilidade precisa ser elevada com a finalidade de utilização imediata(marchant; BANAT, 2012). Os biossurfactantes vieram para inovar e substituir os dispersantes químicos pelas várias aplicações, pelo baixo custo e pelos imensuráveis bens ambientais da biodegradabilidade e da baixa toxicidade. 3

4 O presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento do biossurfactante produzido por Candida guilliermondii em biorreator, sob algumas das diversas propriedades apresentadas e sob condições específicas, no decorrer do tempo e na manutenção do biossurfactante por vapor fluente e adição de um sal químico como aditivo. MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo e substratos A levedura Candida guilliermondii (UCP 995), depositada no Banco de Culturas do Núcleo de Pesquisas Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco foi utilizada como produtora do biossurfactante. A repicagem desse organismo microbiano ocorreu a cada 30 dias, em tubos de ensaio contendo o meio sólido de Yeast Mold Agar (YMA). Como fontes de energia, para a produção do biossurfactante, foram utilizados a milhocina, o melaço e o resíduo industrial da refinaria de óleo de soja (SANTOS et al., 2013). Meios de manutenção e de crescimento do inóculo e de produção do biossurfactante A levedura foi mantida através da mistura sólida de YMA, composta por: extrato de malte (0,3%), extrato de levedura (0,3%), D-glicose (1,0%), triptona (0,5%), ágar bacteriano (2,0%) e água destilada q.s.p. 4

5 (100 ml). Os componentes foram esterilizados em autoclave a 121 C por 20 min. A exclusão do ágar propiciou à mistura o estado líquido e foi denominada de Yeast Mold Broth (YMB), indicando o meio de crescimento da levedura. O meio de produção foi composto pelo acréscimo de 4,0% de milhocina e 2,5% de melaço do volume inicial, o ph foi ajustado para 5,5, acrescentou-se 2,5% de resíduo de óleo de soja e todo o meio foi autoclavado a 121 C por 20 min. Preparação do inóculo e produção do biossurfactante O inóculo tornou-se padrão pela transferência da C. guilliermondii para um tubo de ensaio, contendo o meio YMA, com a finalidade de se obter uma cultura jovem, em temperatura ambiente (25 C). Logo após, as leveduras foram transferidas assepticamente até um frasco com YMB estéril. Por fim, o Erlenmeyer do YMB foi posto à agitação na máquina incubadora shaker durante 24 horas, a 200 rpm e a 28 C. Para a produção do biossurfactante em biorreator de 50 L de capacidade volumétrica, após o crescimento do inóculo em meio YMB, foi realizada uma diluição seriada para a contagem das células por mililitro e calculado o volume para alcançar a concentração de 10 4 células/ml. Esse volume determinado foi inserido em 20 L do meio de produção, selecionado em shaker, estéril, sob agitação mecânica de 90 rpm, durante 144 horas e à temperatura de 28 ºC. 5

6 Estabilização do biotensoativo e determinação das propriedades surfactantes O líquido metabólicoobtido pelo biorreator foi centrifugado a 4500 rpm durante 15 min e filtrado à vácuo, para a retirada das células. O biossurfactante também passou por uma filtração simples devido à baixa agitação oferecida pela máquina piloto industrial no momento da produção do biossurfactante. A estabilização do surfactante microbiano ocorreu pelo prévio aquecimento a 80 C em um banho-maria durante 30 min, sendo essa técnica conhecida como vapor fluente. Após o tempo citado, 0,2% do sal sorbato de potássio foi adicionado e o líquido dividido em vidros de armazenamento, em triplicata, para a verificação das propriedades surfactantes nos períodos de 0, 15, 30, 45, 90 e 120 dias. Em cada um desses dias, foram alteradas as condições de potencial hidrogeniônico para 6, 8 e 10; adicionadas percentagens de salinidade 1, 3 e 5% do volume a ser estudado e aquecidas as amostras durante 30 min a 40 e 50 C. Para avaliar as propriedades surfactantes, foram mensuradas as tensões superficiais e os índices de emulsificação e dispersão. s tensões foram medidas pelo método do anel DU NUOY no tensiômetro KSV Sigma 70 (Finland). A superficial foi mensurada pela força limite (mn/m) para suspender o anel de platina no líquido 6

7 metabólico livre de células até a interface ar-líquido e a interfacial entre o biossurfactante e o hidrocarboneto n-hexa-decano. Para a determinação das emulsões, foram colocados em tubos de ensaio, 2 ml do biossurfactante acoplados isovolumetricamente a três compostos apolares: óleos motor, de milho ede soja a 25 C e 1 atm. Esses recipientes foram agitados em vórtex durante 2 minutos e deixados, durante 24 horas, em repouso. O índice de emulsificação foi calculado pela razão entre a altura da emulsão e a altura total da mistura, sendo o valor multiplicado por 100 (COOPER; GOLDENBERG, 1987). A capacidade de dispersão e agregação do óleo motor foi simulada em placa de Petri (14 cm de diâmetro), contendo 100 ml da água do mar, coletada nas proximidades do sistema de captação do gerador de energia da Termelétrica Pernambuco. Uma quantidade desse óleo foi colocada no centro da placa, adicionando posteriormente diferente proporçõesdo surfactante microbiano: 1:1, 1:2 e 1:8 (v/v) (biossurfactante/óleo motor).os valores foram medidos pela percentagem do diâmetro do halo, formado com a adição do biossurfactante, pelo da placa, e o teste de agregação foi apenas visual (MORIKAWA et al, 2000). 7

8 RESULTADOS E DISCUSSÃO Conservação das propriedades do biossurfactante produzido em biorreator pelo método de vapor fluente com sorbato A redução das tensões superficial e interfacial é considerada como principal parâmetro para detecção de um composto tensoativo em um determinado meio (RAY, 2007). Em adição à tensão superficial ou interfacial, a estabilidade de emulsões óleo/água também é muito utilizada como um indicador de atividade superficial, embora a habilidade de uma molécula em formar uma emulsão estável nem sempre esteja associada à redução da tensão superficial (MUKHERJEE, 2006). Nesse trabalho, foram verificadas as tensões superficiais nos períodos de 0, 15, 30, 45, 90 e 120 dias e nas condições de ph, salinidade e aquecimento. Após esse período e de acordo com a figura 1, evidenciaram-se a redução das tensões superficiais, a partir dos 45 dias, de 34,00 mn/m para faixas de 30,00 mn/m, o que significa uma maior umectação e uma conservação eficaz do biossurfactante produzido em biorreator. As melhores condições foram obtidas em ph 6, salinidade de 5% e aquecimento a 50 C, com as respectivas tensões superficiais em todos os períodos de 30,44; 32,13 e 31,54 mn/m. Com esses dados, o método 8

9 de conservação superou o prazo estimado para delimitar uma validade ao biossurfactante, reduzindo as tensões superficiais em vez de apenas mantê-las. Figura 1. Tensões superficiais do biossurfactante do biorreator sob vapor fluente com sorbato de potássio a 0,2%, durante 120 dias, sob variação de ph, NaCl, aquecimento e com o controle das condições. Nos índices de emulsificação em óleo motor, figura 2-A, foram percebidas severas reduções nas percentagens do ph diante do controle do biossurfactante. Esse acontecimento foi de encontro ao ocorrido nas figuras 2-B, com óleo de soja, e 2-C, com óleo de milho. Os melhores resultados foram nas emulsificações do óleo motor com três índices máximos (100%) e determinação das condições mais viáveis com ph 10, salinidade 5% e aquecimento a 50 C. Essas condições também se destacaram como mais estáveis em óleo de soja. No óleo de milho, as 9

10 emulsões foram melhores em ph 10, salinidade 1% e aquecimento a 50 C. Figura 2. Índices de emulsificação do biossurfactante do biorreator sob vapor fluente com sorbato a 0,2%, durante 120 dias, sob variação de ph, NaCl, aquecimento e com controle das condições, nos óleos: (A) motor, (B) de soja e (C) de milho. Nos índices das dispersões, os percentuais foram elevados apenas frente às alterações de ph, com um valor máximo de 92,9%, aos 120 dias com ph 8 e na proporção 1:1 (v/v) de biossurfactante para óleo motor. As melhores condições foram observadas nas dispersões 1:1 e 1:8 (v/v), ph 8, a salinidade 1% e aquecimento a 40 C. A dispersão 1:2 (v/v) diferiu apenas na salinidade de 3%. 10

11 Figura 3. Índices de dispersões do biossurfactante do biorreator sob vapor fluente com sorbato a 0,2%, durante 120 dias, sob variação de ph, NaCl, aquecimento e com o controle, nas proporções de biossurfactante/óleo (v/v): (A) 1:1, (B) 1:2 e (C) 1:8. CONCLUSÃO As tensões superficiais foram reduzidas em cerca de 4mN/m, tornando o processo de conservação muito eficiente. As emulsificações obtiveram os melhores resultados no óleo motor, principalmente com a alteração da salinidade e com o aquecimento. Os índices de dispersão foram elevados apenas com alteração dos potenciais hidrogeniônicos nas três proporções estudadas; 11

12 As melhores condições foram os potenciais 8 ou 10, preferindo-se um ph 8 por estar próximo ao do mar; a salinidade de 1 ou 5%; ou o aquecimento a 50 C. Mais pesquisas na área de biossurfactantes precisam ser desenvolvidas para o aprimoramento da aplicação desse bioproduto. REFERÊNCIAS COOPER, D. G.; GOLDENBERG, B. G. Surface-Active Agents from two Bacillus Species. Applied and Enviromental Microbiology, v. 53, p , DALTIN, D. Tensoativos: química, propriedades e aplicações. São Paulo: Blucher, GAUTAM, K. K.; TYAGI, V. K. Microbial Surfactants: a review. Journal of Oleo Science, v. 55, p , MARCHANT, R.; BANAT, I. M.; Microbial biossurfactants: challenges and opportunities for the future exploitation. Trends in Biotechnology, v. 30, p , MORIKAWA, M et al. A study on the structure-function relationship of lipopeptide biosurfactants. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1488, p , MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends in Biotechnology, v. 24, p , RAY, J. C. et al. Mesoporus alumina (I): Comparasion of synthesis schemes using anionic, cationic, and non-ionic surfactants. Microporous and Mesoporous Materials, v. 100, p ,

13 SANTOS, D. K. F. et al. Synthesis and evaluation of biosurfactant produced by Candida lipolhytica using animal fat and corn steep liquor. Journal of Petroleum Science and Engineering, v. 105, p , ZHOU, Z. et al. Characterization of oil components from Deepwater Horizon oil spill in the Gulf of Mexico using fluorescence EEM and PARAFAC techniques. Marine Chemistry, v. 148, p ,