UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO

Transcrição

1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA) A INFLUÊNCIA DOS ELEMENTOS TRAÇOS, (B, Cu, Mn, Mo e Zn) NA PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDIOS POR Pseudomonas aeruginosa LBI. TULIO DE LUCCA CAPELINI Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada). Rio Claro Junho/2012

2 TULIO DE LUCCA CAPELINI A INFLUÊNCIA DOS ELEMENTOS TRAÇOS, (B, Cu, Mn, Mo e Zn) NA PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDIOS POR Pseudomonas aeruginosa LBI. Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada). Orientador: Jonas Contiero Co-orientadora: Roberta Barros Lovaglio Rio Claro 2012

3 ,+: 1(7; !" #$6152%&#7#'8()*( +,#%65#86#8-#82.# /64242$ ! % $36472% *#6276#(#554462#7# #9# 1.25#,#162#!#95# <6= >99!$ ?2> ">

4 O essencial é invisível aos olhos. Antoine de Saint-Exupéry

5 RESUMO Os biossurfactantes são metabólitos secundários que apresentam atividade de superfície, podendo ser aplicados em diferentes processos industriais, como produção de fármacos, compostos químicos, cosméticos, biorremediação de ambientes poluídos por petróleo e derivados e recuperação terciária do petróleo. A maior vantagem destes compostos quando comparado aos surfactantes sintéticos reside na sua diversidade estrutural, baixa toxicidade e alta biodegradabilidade. Apesar das inúmeras vantagens apresentadas pelos biotensoativos, eles não são tão comercialmente utilizados devido ao alto custo de produção, uma maneira de se diminuir estes custos, seria a otimização dos compostos do meio e utilização de substratos alternativos mais baratos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a influência de elementos traço na produção de ramnolipídios por de P. aeruginosa LBI a partir de duas fontes de carbono diferentes (uma hidrofóbica - óleo de soja - e outra hidrofílica - glicerina P.A.) Na primeira etapa do trabalho foi avaliado o perfil de produção de ramnolipídios em diferentes concentrações dos elementos traço. Em seguida, foram realizados fermentações para inferir a importância individual de cada elemento traço no cultivo. E ao final foi testada a adição de novos elementos aos ensaios, com o intuito de avaliar seus resultados quanto à mudança na cinética de produção dos biossurfactantes. O trabalho comprovou que os elementos boro, citrato, cobalto, cobre, manganês, molibdênio e zinco exercem influência na produção de ramnolipídios, sendo está, em alguns casos positiva, em outros, negativa. Palavras-chaves: biossurfactantes; ramnolipídios; Pseudomonas aeruginosa; elementos traço, íons.

6 ABSTRACT The biosurfactants are secondary metabolites that exhibit surface activity and can be applied in different industrial processes such as production of pharmaceuticals, chemicals, cosmetics, bioremediation of polluted environments by oil and derivatives and tertiary recovery of oil. The greatest advantage of these compounds compared to synthetic surfactants lies in their structural diversity, low toxicity and high biodegradability. Despite the numerous advantages provided by biosurfactants, they are not commercially used due to the high cost of production, a way to reduce these costs, is the optimization of the compounds of the medium and the use of cheaper alternatives substrates. Therefore, the objective of this work was study the influence of trace elements in the rhamnolipids production by P. aeruginosa LBI from two different carbon sources (a hydrophobic - soybean oil - and a hydrophilic glycerin P.A.). In the first stage of the study was evaluated the profile of rhamnolipids production at different concentrations of trace elements. Then, fermentations were carried out to infer the importance of each individual trace element in the culture. And at the end, were tested the addiction of new elements to the medium, to availed their changes in the kinetics of production of biosurfactants. The work confirmed that the elements boron, citrate, cobalt, copper, manganese, molybdenum and zinc influencing the production of rhamnolipids, being in some cases positively, and in others negative. Key words: biosurfactant; rhamnolipids; Pseudomonas aeruginosa; trace elements; ions.

7 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1: Estruturas dos principais homólogos de ramnolipídios (RL1, RL2, RL3 e RL4), produzidos por P. aeruginosa Figura 2: Principais campos de pesquisa, eventos e descobertas no campo dos ramnolipídios. Modificado de Chrzanowski, Lawniczak e Czaczyk (2012) Figura 3: Proposta das rotas metabólicas envolvidas na produção de ramnolipídios pela P. aeruginosa, tendo óleo de soja ou glicerina como fonte de carbono. Modificado de Abdel-Mawgoud et al. (2011) Figura 4: Parte da regulação gênica envolvida na biossíntese dos ramnolipídios por P. aeruginosa. Modificado de Abdel-Mawgoud et al., (2011) e Reis et al., (2011) Figura 5: CCD para verificação da produção de ramnolipídios nos cultivos com óleo (A) e glicerina (B). Ácidos Graxos (AG), Di-ramnolipídios (DiRL) e Mono-ramnolipídios (MnRL) Figura 6: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando óleo de soja como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, em diferentes concentrações (µl/l) de solução de elementos traço no meio, 50 (B), 500 (C), 1.000(D), 1.500(E), (F), 2.500(G) e (H) Figura 7: Produção de ramnolipídio (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada em diferentes concentrações de solução de elementos traço no meio... 40

8 Figura 8: Biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada em diferentes concentrações de solução de elementos traço no meio Figura 9: Consumo de óleo (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada em diferentes concentrações de solução de elementos traço no meio Figura 10: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando óleo de soja como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, com ausência de cada um dos elementos traços, boro (B), cobre (C), manganês (D), molibdênio (E) e zinco (F) Figura 11: Produção de ramnolipídio (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada na ausência de cada um dos elementos traços (B, Cu, Mn, Mo e Zn) Figura 12: Biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada na ausência de cada um dos elementos traços(b, Cu, Mn, Mo e Zn) Figura 13: Emulsão (E) presente no processamento da amostra, que impossibilitou um volume suficiente de n-hexano (H) para análise de óleo residual Figura 14: Consumo de óleo (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada na ausência de cada um dos elementos traços (B, Cu, Mn, Mo e Zn)... 47

9 Figura 15: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando óleo de soja como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, com a adição de citrato (B), cobalto (C) e ambos (D) Figura 16: Produção de ramnolipídio (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada com o acréscimo de citrato, cobalto e ambos Figura 17: Biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada com o acréscimo de citrato, cobalto e ambos Figura 18: Consumo de óleo (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo óleo de soja, cultivada com o acréscimo de citrato, cobalto e ambos Figura 19: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando glicerina P.A. como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, em diferentes concentrações (µl/l) de solução de elementos traço no meio, 50 (B), 500 (C), 1.000(D), 1.500(E), (F), 2.500(G) e (H) Figura 20: Produção de ramnolipídio (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada em diferentes concentrações de solução de elementos traço no meio Figura 21: Biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada em diferentes concentrações de solução de elementos traço no meio... 53

10 Figura 22: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando glicerina P.A. como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, com ausência de cada um dos elementos traços, boro (B), cobre (C), manganês (D), molibdênio (E) e zinco (F) Figura 23: Produção de ramnolipídio (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada na ausência de cada um dos elementos traços (B, Cu, Mn, Mo e Zn) Figura 24: Biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada na ausência de cada um dos elementos traços (B, Cu, Mn, Mo e Zn) Figura 25: Cultivo de P. aeruginosa LBI utilizando glicerina P.A. como única fonte de carbono, antes da inoculação (A) e após 96 horas, com a adição de citrato (B), cobalto (C) e ambos (D) Figura 26: Produção de ramnolipídios (mg/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada com o acréscimo de citrato, cobalto e ambos Figura 27: Cinética da produção de biomassa (g/l) da bactéria P. aeruginosa LBI em meio contendo glicerina P.A., cultivada com o acréscimo de citrato, cobalto e ambos... 58

11 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1: Micronutrientes (elementos traços) necessários aos microorganismos Tabela 2: Concentrações dos íons no meio, nas diferentes concentrações da solução traço adicionadas ao meio de cultivo Tabela 3: Concentrações dos íons traço nos meio nas diferentes condições de cultivo estabelecidas para a avaliação da influência dos elementos traços na produção de ramnolipídios por P. aeruginosa LBI Tabela 4: Concentrações dos íons traço nos meio nas diferentes condições de cultivo estabelecidas para a avaliação da influência do citrato e cobalto na produção de ramnolipídios por P. aeruginosa LBI Tabela 5: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em óleo de soja e diferentes volumes de solução de elementos traço Tabela 6: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em óleo de soja e ausência de cada um dos elementos traço Tabela 7: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em óleo de soja e adição de citrato e/ou cobalto... 48

12 Tabela 8: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em glicerina P.A. e diferentes volumes de solução de elementos traço Tabela 9: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em glicerina P.A. e ausência de cada um dos elementos traço Tabela 10: Comparação estatística entre as médias das concentrações de ramnolipídios (mg/l) obtidas ao final de 96 horas de cultivo em glicerina P.A. e adição de citrato e/ou cobalto... 57

13 SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÂO REVISÃO DA LITERATURA Surfactantes Biossurfactantes Histórico dos Ramnolipídios e P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Aplicação comercial dos biossurfactantes Funções fisiológicas Estratégias de produção de biossurfactantes Biossíntese de ramnolipídios Regulação gênica da produção dos ramnolipídios Fontes alternativas de carbono na produção de biossurfactantes Influência de elemetos traços na produção de ramnolipídios OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo... 32

14 4.2. Meio de cultura e condições de cultivo A. Meio de cultura para o pré-cultivo B. Meio de cultura para produção dos ramnolipídios C. Fontes de carbono D. Preparo do pré-inóculo e condições de cultivo Processamento das amostras Métodos Analíticos Avaliação da produção de Ramnolipidios A. Determinação da produção de Ramnolipídios Cromatografia em Camada Delgada B. Determinação da concentração de Ramnolipídios HPLC B.1. Derivatização B.2. HPLC Determinação da biomassa microbiana Determinação do óleo residual Análise Estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cultivos com óleo de soja A. Variação da concentração da solução de elementos traço no meio contendo óleo de soja... 39

15 5.2.B. Avaliação da importância de cada elemento traço para a produção de ramnolipídios a partir de óleo de soja C. Avaliação dos elementos citrato e cobalto na produção de ramnolipídios a partir de óleo de soja Cultivos com glicerina A. Variação da concentração da solução de elementos traço no meio com glicerina P.A B. Avaliação da importância de cada elemento traço para a produção de ramnolipídios utilizando glicerina P.A. como fonte de carbono C. Avaliação dos elementos citrato e cobalto na produção de ramnolipídios utilizando glicerina P.A. como fonte de carbono CONCLUSÕES PERSPECTIVAS FUTURAS REFERÊNCIAS... 64

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77