APLICAÇAO DOS BIOSSURFACTANTES NA REMOCAO DE CONTAMNANTES EM AGUA MARINHA

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1 APLICAÇAO DOS BIOSSURFACTANTES NA REMOCAO DE CONTAMNANTES EM AGUA MARINHA A Resultados Parciais do projeto de pós-doutorado. Financiamento: CAPES-FACEPE, TERMOPE. Juliana Moura de Luna 1, Raquel Diniz Rufino 1, Leonie Asfora Sarubbo 2 1 Pós-Doutorandas (PNPD), UNICAP e Centro de Ciências e Tecnologia, UNICAP [Rua do Príncipe, 526, CEP: , julianamouraluna@gmail.com]. Bolsistas CAPES/FACEPE. 2 Professora e Pesquisadora do Centro de Ciências e Tecnologia, UNICAP. Resumo A produção de biossurfactante tem sido intensivamente estudada nos últimos anos, uma vez que estes agentes são biodegradáveis e possuem aplicação em diversos setores industriais, além de serem ecologicamente compatíveis e promissores na remoção de poluentes hidrofóbicos em ambientes marinhos e terrestres. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi determinar a toxicidade dos biossurfactantes produzidos por Candida sphaerica (L) e Candida lipolytica (R), utilizando concentrações dos biossurfactantes (1/2CMC, CMC e 2xCMC) foram utilizadas para testes de toxicidade para diferentes sementes de hortaliças e o micro-crustáceo Artemia salina. Testes utilizando água do mar suplementada ou não com petróleo foram realizados para determinar o comportamento da microbiota autóctone frente a diferentes concentrações dos biossurfactantes. Os resultados obtidos demonstraram que os biossurfactantes L e R, independente das concentrações utilizadas, não apresentaram toxicidade frente às diferentes sementes utilizadas, ao micro-crustáceo e a microbiota autóctone da água do mar coletada da região do Porto de SUAPE/PE. Valores acima de 80% foram observados para o Índice de Germinação (IG) das sementes. Os biossurfactantes apresentaram resultados promissores para aplicação na remediação de ambientes aquáticos contaminados por petróleo. Palavras-chave: Biossurfactantes, Candida sphaerica, Candida lipolytica

2 Introdução As refinarias são grandes geradoras de poluição. Elas consomem enormes quantidades de água e de energia, produzem muitos despejos líquidos, liberam diversos gases nocivos para a atmosfera e produzem resíduos sólidos de difícil tratamento e disposição. Em decorrência de tais fatos, a indústria de refino de petróleo, pode ser, e é muitas vezes, uma grande degradadora do meio ambiente, pois tem potencial para afetar o mesmo em todos os níveis ecológicos: ar, água e solo (GONZINI et al., 2010). A contaminação por petróleo e derivados normalmente é tratada através de metodologias físicas, químicas ou biológicas. Entretanto, as novas diretrizes de recuperação de águas e solos têm restringido o uso de produtos químicos (MUTHUSAMY et al., 2008). Dentre as técnicas de remediação disponíveis, a biorremediação tem se destacado, embora a solubilidade reduzida dos hidrocarbonetos dificulte o acesso dos microrganismos e a conseqüente biodegradação do poluente (CALVO et al., 2009). A utilização de compostos surfactantes torna-se uma alternativa atrativa na remoção de contaminantes hidrofóbicos gerados pela indústria de petróleo (LUNA et al., 2013). Os surfactantes são compostos anfipáticos que se particionam, preferencialmente, na interface entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade, apresentando várias aplicações industriais (RUFINO et al., 2011). A grande maioria dos surfactantes disponível comercialmente é sintetizada a partir de derivados de petróleo. Entretanto, a necessidade de preservação ambiental e as legislações de controle do ambiente têm levado pesquisadores à procura por produtos naturais como alternativas aos produtos existentes. Nesse contexto, destacam-se os surfactantes de origem microbiológica, os biossurfactantes, produzidos principalmente por bactérias e leveduras (CORTIS; GHEZZEHEI, 2007). Neste sentido, os biossurfactantes produzidos por Candida sphaerica (L) e Candida lipolytica (R) foram submetidas a testes de toxicidade, para avaliar a possível aplicação na biorremediação de ambientes contaminados por poluentes hidrofóbicos. MATERIAL E METODOS Micro-organismos: as leveduras Candida sphaerica (UCP 0995) e Candida lipolytica (UCP 0998) foram utilizadas como microorganismos produtores dos biossurfactantes.

3 Meios de Produção: para a produção do biossurfactante de C. sphaerica (Biossurfactante L) foi utilizado o meio contendo 9% de resíduo de refinaria de óleo de soja e 9% do resíduo milhocina (LUNA et al., 2011). A produção do biossurfactante de C. lipolytica (Biossurfactante R) foi realizada em meio mineral suplementado com 6% de resíduo de refinaria de óleo de soja e 1% ácido glutâmico (RUFINO et al., 2010). Produção dos biossurfactantes: foi realizada sob agitação orbital de 200 rpm, à temperatura de 27ºC. O biossurfactante L foi produzido durante 144 horas, enquanto que o biossurfactante R foi obtido após 72 horas. Teste de fitotoxicidade: a fitotoxicidade dos biossurfactantes foi avaliada em ensaio estático através da germinação da semente e do crescimento da raiz de repolho (Brassica oleracea), de acordo com (TIQUIA et al., 1996). Soluções teste dos biossurfactantes isolados foram preparadas em água destilada em diferentes concentrações (1/2CMC, CMC, 2x CMC). No decorrer de cinco dias de incubação no escuro, a germinação das sementes, o crescimento da raiz ( 5 mm) e o índice de germinação (IG) foram calculados. Teste de toxicidade com Artemia salina: a toxicidade dos biossurfactantes isolados foi avaliada utilizando-se larvas de camarão (micro-crustáceo Artemia salina) como indicador. As larvas foram usadas após 24 horas de incubação. Soluções dos biossurfactantes em sal marinho sintético (33 mg/l) em diferentes concentrações (1/2xCMC, 1xCMC, 2xCMC ) foram usadas (SILVA et al., 2010). O sal marinho sintético foi utilizado como controle. Aplicação do biossurfactante como agente de biorremediação: as determinações microbiológicas para avaliar o potencial dos biossurfactantes como agentes de biorremediação foram realizadas segundo as normas oficiais do Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater (APHA, 1998). Inicialmente coletaram-se amostras de água do mar (220 ml). Em seguida, 1% de petróleo foi adicionado aos frascos, juntamente com soluções dos biossurfactantes isolados (1/2CMC, CMC e 5x CMC), os quais foram incubados a 150 rpm durante 1, 5, 12, 20 e 30 dias a 27ºC. Nos

4 intervalos de tempo estabelecidos realizaram-se amostragens das soluções para contagem de micro-organismos pela técnica do Número Mais Provável (NMP). Diluições decimais foram realizadas (1/10 e 1/1000) com as amostras utilizando água de diluição tamponada a ph 7,2. RESULTADOS E DISCUSSAO Teste de fitotoxicidade O índice de germinação (IG), que combina as medidas da germinação relativa das sementes e o crescimento relativo das raízes foi utilizado para avaliar a toxicidade dos biossurfactantes R e L frente a diferentes sementes Brassica oleracea var. Captata L.- Coração de Boi (1), Brassica oleracea var. Captata L.-Chato de Quintal (2), Lactuca sativa L., Solanum gilo. A tabela 1 apresenta os resultados de fitotoxicidade para o biossurfactante R produzido por Candida lipolytica. Considerando que um IG de 80% tem sido utilizado como indicador da ausência da fitotoxicidade (TIQUIA et al., 1996), os resultados obtidos indicaram que as soluções testadas não apresentaram efeito inibitório sobre a germinação das sementes e sobre o elongamento das raízes do Brassica oleracea var. Captata L.- Coração de Boi (1), uma vez que IG de 136% foi obtido para a solução do biossurfactante isolado na maior concentração utilizada 2xCMC (60 mg/l). Os testes realizados para a semente do Brassica oleracea var. Captata L. - Chato de Quintal (2) apresentaram valores de IG de 113%, 108,9% e 84% para as concentrações de 1/2CMC, CMC e 2xCMC, respectivamente. O Solanum gilo apresentou um IG de 112,5% quando testado frente à concentração de 2xCMC, já o Lactuca sativa L. obteve valores de 86% e 87% para as concentrações de CMC e 2xCMC, respectivamente. Tabela 1 Resultados do Teste de fitotoxidade do biossufactante R Sementes/Concentração Brassica oleracea var. Captata L. (1) 1/2CMC CMC 2XCMC %G %CR IG %G %CR IG %G %CR IG 70 4,

5 Brassica oleracea var. Captata L. (2) , Solanum gilo ,5 112,5 Lactuca sativa L , , A tabela 2 apresenta os resultados de fitotoxicidade para o biossurfactante L produzido por C. sphaerica. Os resultados obtidos apresentaram IG de 165%, 220% e 238% para o Brassica oleracea var. Captata L. - Coração de Boi (1), 131%, 102% e 95% para o Brassica oleracea var. Captata L -.Chato de Quintal (2), 100%, 120% e 150% para o Solanum gilo, 125%, 138% e 1675 para o Lactuca sativa L., nas concentrações de ½ CMC, CMC e 2xCMC respectivamente. Foi possível visualizar, também, o crescimento de raízes primárias e secundárias para todas as soluções testadas para o biossurfactante L. Tabela 2 Resultados do Teste de fitotoxidade do biossufactante L Sementes/Concentração Brassica oleracea var. Captata L. (1) Brassica oleracea var. Captata L.(2) 1/2CMC CMC 2XCMC %G %CR IG %G %CR IG %G %CR IG Solanum gilo Lactuca sativa L Teste de toxicidade com Artemia salina Os biossurfactantes R e L não apresentaram toxicidade frente ao micro-crustáceo Artemia salina independentes das concentrações utilizadas (1/2 CMC, CMC e 2xCMC).

6 Em estudos realizados por (SILVA et al., 2010) para o biossurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa os testes de toxicidade frente à Artemia salina demonstraram que o biossurfactante provocou 100 e 50% de letalidade quando testado em elevadas concentrações, de 700 e 525 mg/l, respectivamente, enquanto que não houve letalidade para as demais concentrações testadas nem para o líquido metabólico livre de células. Aplicação dos biossurfactantes como agentes de biorremediação Os resultados apresentados nas Figuras 1 e 2 demonstraram que os biossurfactantes R e L atuaram como agentes solubilizantes do petróleo presente nos cultivos, visto que as bactérias autóctones apresentaram um aumento no seu crescimento durante os 30 dias de cultivo. O que pode estar relacionado à facilitação de acesso nutricional das bactérias ao petróleo existente nos meios. No controle contendo apenas água do mar pode-se observar que a fase de declínio das bactérias ocorreu em torno dos 5 dias de cultivo. Já para os biossurfactantes R e L após os 5 dias de cultivo observou-se um aumento na quantidade de células viáveis, fazendo com que a fase de declínio ocorresse apenas após 12 dias. Os resultados dos testes de aplicação dos biossurfactantes R e L como agentes de biorremediação mostram que quanto maior a concentração dos biossurfactantes maior o crescimento das bactérias autóctones presentes na água do mar. Figura 1 Desenvolvimento de bactérias autóctones da água do mar frente a diferentes concentrações do biossurfactante R com petróleo Cels/mL Tempo (dias) Controle (Agua do mar) Agua do mar + 1/2CMC Agua do mar + CMC Agua do mar + 5xCMC Figura 2 Desenvolvimento de bactérias autóctones da água do mar frente a várias concentrações do biossurfactante L com petróleo

7 Cels/mL Controle (Agua do Mar) Agua do Mar + 1/2CMC Agua do Mar + CMC Agua da Mar + 5xCMC Tempo (dias) CONCLUSÃO 1 Os resultados obtidos demonstraram que os biossurfactantes L e R, independente das concentrações utilizadas, não apresentaram toxicidade frente às diferentes sementes utilizadas e ao micro-crustáceo e a microbiota autóctone da água do mar coletada da região do Porto de SUAPE/PE. 2 Os biossurfactantes apresentaram resultados promissores para aplicação na remediação de ambientes aquáticos contaminados por petróleo. REFERÊNCIAS APHA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18. ed., Washington: APHA, CALVO, C.; MANZANERA, M.; SILVA-CASTRO,G.A.; UAD, I.; GONZÁLEZ- LOPÉZ, J. Application of Bioemulsifiers in Soil Bioremediation Processes: Future Prospects. Science Of The Total Enivironment, v. 407, p , CORTIS, A.; GHEZZEHEI, T. A. On the transport of emulsions in porous media. Journal of Colloid and Interface Science, v. 313, p. 1-4, GONZINI, O.; PLAZA, A.; DI PALMA, L.; LOBO, M. C. Electrokinetic remediation of gasoil contaminated soil enhanced by rhamnolipids. Journal of Applied Electrochemistry, p , v. 40, 2010.

8 LUNA, J.M.; RUFINO, R.D.; ALBUQUERQUE, C.D.C.; SARUBBO, L.A.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Economic optimized medium for tenso-active agent production by Candida sphaerica UCP0995 and application in the removal of hydrophobic contaminant from sand. International Journal of Molecular Sacience, v. 12, p , LUNA, J. M., RUFINO, R. D., SARUBBO, L. A., CAMPOS-TAKAKI, G. M., Characterization, surface properties and biological activity of a biosurfactant produced from industrial waste by Candida sphaerica UCP0995 for application in the petroleum industry. Colloids and surface B: Biointerfaces, p. 36, MUTHUSAMY, K.; GOPALAKRISHNAN, S.; RAVI, T,K.; SIVACHIDAMBARAM, P. Biosurfactants: properties, commercial production and application. Current Science, v. 94, p , RUFINO, R.D. Produção otimizada do biossurfactante Rufisan por Cândida lipolytica e aplicações biotecnológicas, Tese. Universidade Federal de Pernambuco, Doutorado em Biologia de Fungos. 156 p RUFINO, R.D.; RODRIGUES, G.I.B.; CAMPOS-TAKAKI, G.M.; SARUBBO, L.A.; FERREIRA, S.R.M. Application of a Yeast Biosurfactant in the Removal of Heavy Metals and Hydrophobic Contaminant in a Soil Used as Slurry Barrier. Applied and Environmental Soil Science, v. 2011, p.1-7, SILVA, S.N.R.L., FARIAS, C.B.B., RUFINO, R.D., LUNA, J.M., SARUBBO, L.A. Glycerol as substrate for the production of biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa UCP0992. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces, v.79, p , TIQUIA, S.M.; TAM, N.F.Y.; HODGKISS, I.J. Effects of composting on phytotocicity of spent pig-manure sawdust litter. Environmental Pollution, v.93, p , 1996.