UTILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTIVOS COM BAIXO CUSTO NA PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES TOTAIS

Transcrição

1 UTILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTIVOS COM BAIXO CUSTO NA PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES TOTAIS USE OF LOW COST CULTURE MEDIA IN THE PRODUCTION OF TOTAL BIOSURFACTANTS Frederico Alves Lima (1) Larysse Caixeta Ferreira (2) Eloizio Júlio Ribeiro (3) Miriam Maria de Resende (4) Alan Willian Vilela Pomella (5) Resumo Biossurfactantes são moléculas de origem microbiana que possuem importante ação na redução tensão superficial. Dentre os biossurfactantes mais efetivos estão os lipopeptídeos produzidos por bactérias do gênero Bacillus. Variou-se as concentrações de extrato de levedura, xarope de glicose e cloreto de cálcio em cultivos bateladas. O meio de cultivo contendo extrato de levedura, xarope de glicose e cloreto de cálcio nas concentrações (g/l) de 20, 30 e 2 respectivamente, apresentou melhor desempenho. Nesta concentração, o microrganismo foi capaz de reduzir a tensão superficial de valores acima de 50 para 30 mn/m, ter um crescimento celular de 1,52 x 10 9 CFU/mL e consumir o maior percentual de carboidratos, entre as composições de meio de cultura estudadas. Palavras-chave: Produção de Biossurfactante, Bacillus amyloliquefaciens, meio de cultivo alternativo. Abstract Biosurfactants are molecules of microbial origin that have superficial action. Among the most effective are the lipopeptide biosurfactants produced by Bacillus. The concentrations of yeast extract, glucose syrup and calcium chloride were varied in batch cultures. The culture medium containing yeast extract, glucose syrup and calcium chloride in the concentrations (g/l) of 20, 30 and 2, respectively, presented the best performance. In these concentrations, the microorganism was able to reduce the value of superficial tension above 50 to 30 mn/m, cell growth of 1.52 x 10 9 CFU/mL and consume the highest percentage of carbohydrates, between the medium compositions of culture studied. Keywords: biosurfactants prduction, Bacillus amyloliquefaciens, alternative culture media. 1 Introdução Os biossurfactantes, ou surfactantes de origem microbiana, são geralmente sintetizados pelo crescimento aeróbico de microorganismos que podem ser derivados da fermentação por bactérias, fungos ou leveduras em meio de cultura. Os principais grupos são 1 (Mestre) em Engenharia Química pela Universidade Federal de Uberlândia. Endereço eletrônico: alveslimafrederico@gmail.com 2 (Mestre) em Engenharia Química pela Universidade Federal de Uberlândia. Endereço eletrônico: larysse_caixeta@hotmail.com 3 (Doutor) em Engenharia Química pela Universidade Federal de Uberlândia. Endereço eletrônico: ejribeiro@ufu.br 4 (Doutor) em Engenharia Química pela Universidade Federal de São Carlos. Endereço eletrônico: mresende@ufu.br 5 (Gerente) na empresa Laboratório de BioControle Farroupilha S.A., Lallemand. Endereço eletrônico: alan@grupofarroupilha.com

2 glicolípidos, lipopéptidos, fosfolípidos, ácidos graxos, lípidos neutros e biossurfactantes poliméricos (RAMIRÉZ et al. 2015). O potencial de aplicação de um biossurfactante é baseado em suas propriedades funcionais que incluem emulsificação, separação, solubilização, desmulsão, redução da viscosidade líquida e redução da tensão superficial. Essas propriedades são aplicadas em vários campos da indústria de alimentos, bebidas, papel, têxteis, farmacêuticos, cosméticos e, especialmente, na indústria agrícola (MULLIGAN et al. 2001). Portanto, diante da vasta aplicação dos Bacillus amyloliquefaciens, o objetivo deste trabalho é analisar principalmente a produção de biomassa celular e biossurfactantes totais em meios de cultura de baixo custo. 2 Material e Métodos 2.1 Microrganismo utilizado Para a realização deste trabalho foi utilizado uma a bactéria Bacillus amyloliquefaciens cepa IT45. Este microrganismo foi registrado pelo National Germplasm Repository e fornecido pelo Laboratório de Biocontrole Farroupilha Lallemand, localizado na cidade de Patos de Minas MG. 2.2 Fermentação em mesa agitadora A fermentação foi realizada em mesa agitadora industrial. Os meios de cultura analisados foram Tr1, Tr2 e Tr3, as concentrações (g/l) de xarope de glicose, extrato de levedura e cloreto e cálcio para o primeiro foi de 10, 10 e 2; para o segundo foi de 30, 10 e 2; e para o terceiro foi de 30, 20 e 2. Os meios de cultivos foram distribuídos em garrafões com capacidade de 5 L, contendo 500mL de volume final para a realização dos ensaios. Ajustou-se o ph do meio de cultivo a ser fermentado para 6,50 ± 0,15 e esterilizou-se a 121,5ºC por 25 minutos. Adicionou-se aos meios de cultivo 1 ml de suspensão bacteriana referente a fase de ativação, contendo concentração igual a 1,5 x 10 8 UFC/mL. Depois de preparado, os garrafões foram incubados por 48 horas a temperatura de 30ºC e agitação de 200 rpm. 2.3 Métodos analíticos Viabilidade celular A viabilidade celular foi realizada por contagem microbiana em placa, estimando o número de colônia de células viáveis, isto é, capazes de se reproduzir em uma amostra. A metodologia foi desenvolvida pela EMBRAPA.

3 2.3.2 Tensão superficial e Biossurfactantes totais O método utilizado foi o descrito por DU NÖUY (1925), com o tensiômetro modelo K6 (Krüss GmbH, Humburgo, Alemanha), à temperatura ambiente. A concentração de biossurfatante foi calculada usando caldo fermentado livre de células pelo método gravimétrico descrito por ZHI et al. (2017). 3 Resultados e Discussão 3.1 Avaliação do crescimento celular e consumo de substrato frente a variação das fontes de carboidrato e nitrogênio. Para cada tratamento foram amostrados 4 pontos sendo eles nos tempos 0, 12, 24 e 48 horas. A Figura 2 mostra a cinética de crescimento celular e a variação do ph no processo fermentativo. Figura 2 Cinética de crescimento celular (UFC/mL) e ph para os diferentes meios de cultivo. Pode-se observar que o tratamento 1 teve o menor desempenho, uma vez que apresentou o menor crescimento celular de 5,8 x 10 8 UFC/mL, maior açúcar residual em torno de 69% e apresentou maior variação no ph. Este pior desempenho pode ser explicado pela limitação na concentração de xarope de glicose, uma vez que este produto apresenta baixo percentual de açúcares de fácil absorção. Os tratamentos 2 e 3 foram semelhantes, o crescimento celular foi 1,52 x 10 9 CFU/mL e 1,33 x 10 9 CFU/mL, açúcar residual de 54 e 52 (%) para os tratamentos 2 e 3, respectivamente. O ph para estes tratamentos teve uma pequena variação, variou de 6,5 até 6,8 nestas 48 horas de processo fermentativo. O alto valor percentual de açúcar residual pode ser explicado pela falta de produção de enzimas responsáveis pela quebra dos polissacarídeos, ou seja, o microrganismo para estes tratamentos consume somente açúcares de fácil absorção, como: glicose, maltose e maltotriose, por exemplo, presente no xarope de glicose.

4 YAN et al. (2017) estudando a produção de Surfactina por duas cepas de Bacillus amyloliquefaciens a partir de resíduos de grão de destilação (DGS) como substrato, tiveram bons rendimentos da biomassa. Avaliando o efeito da razão de inoculação das cepas MT45 e X82 eles observaram que a concentração celular final aumentou com aumento da quantidade de X82 no inoculo, variando de 5,1 x 10 8 para 12,6 x 10 8 UFC/mL. 3.2 Cinética de produção de Biossurfactantes Totais frente a variação das fontes de carboidratos e nitrogênio. A Figura 4 (A), mostra a cinética de produção de surfactantes de origem microbiana. O tratamento de maior destaque foi o Tr3, apresentando produção de biossurfactantes totais em torno de 4,30 g/l. O tratamento Tr1 apresentou menor destaque com a produção de 2,62 g/l depois de 48 horas de processo. Acredita-se que baixa produção do bioproduto pode estar associada a este baixo crescimento celular devido à baixa concentração do xarope de glicose. Figura 4 (A) Cinética de produção de Biossurfactantes totais (g/l). (B) Cinética da redução na tensão superficial (mn/m) para os diferentes meios de cultivo. A Figura 4 (B), mostra a cinética da redução da tensão superficial. O tratamento Tr3 reduziu a tensão superficial de valores acima de 50 mn/m para 30 mn/m. Essa redução significativa na tensão superficial evidencia a produção de superficiais agentes durante a fermentação. A diminuição pode ser explicada pelos metabolitos secundários produção, como biosurfactantes, por exemplo. RADHIKA et al. (2014) utilizando B. amyloliquefaciens USTBb com meio de sal mineral (MSM) e condições do processo de 180 rpm e temperatura de 37º C foi capaz de reduzir a tensão superficial de 62 para 28 mn/m, depois de 48 horas de processo. A mínima tensão superficial foi observada no meio da fase exponencial de crescimento celular (24 horas), depois deste período não houve mudanças significantes em tal valor.

5 4 Conclusões O meio de cultivo que teve melhor desempenho foi o tratamento 3 (Tr3), apresentando extrato de levedura, xarope de glicose e cloreto de cálcio nas concentrações (g/l) de 20, 30 e 2, respectivamente. Nesta concentração, o microrganismo foi capaz de reduzir a tensão superficial de valores acima de 50 para 30 mn/m, ter um crescimento celular de 1,52 x 10 9 CFU/mL e consumir o maior percentual de carboidratos, entre as composições de meio de cultura estudadas. 5 Agradecimentos Os autores agradecem o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação do Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e do Laboratório de Biocontrole Farroupilha - Lallemand pela parceria. Referências DU NOÜY, P.L. An Interfacial Tensiometer for Universal Use. The Journal of General Physiology, v. 7, p , MULLICAN, C.N.; YONG, R.N.; GIBBS, B.F. Surfactant-enchanced remediation of contaminated soil: a review. Engineering Geology, v. 60, p. 371, RADHIKA, C., YAO, J., MASAKORALA, K., JAIN, A.K., KUMAR, R. Enhanced production and characterization of biosurfactant produced by a newly isolated Bacillus amyloliquefaciens USTBb using response surface methodology. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 3, 66 80, RAMIRÉZ IM, TSAOUSI K, RUDDEN M, MARCHANT R, ALAMEDA EJ, ROMÁN MG, BANAT IM. Rhamnolipid and surfactin production from olive oil mill waste as sole carbon source. Bioresour Technol, v.198, p , YAN, Z.; QUN, W.; YAN, C. Production of surfactin from waste distiller`s grains by co-culture fermentation of two Bacillus amyloliquefaciens staims. Bioresource Technology, v. 235, p , ZHI, Y.; WU, Q.; XU, Y. Genome and transcriptome analysis of surfactin biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens MT45. Sci. Rep. 7, 40976,