ESTUDO DO BIOSSURFACTANTE POR Candida guilliermondii NA BIORREMEDIAÇÃO DO PETRÓLEO

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1 ESTUDO DO BIOSSURFACTANTE POR Candida guilliermondii NA BIORREMEDIAÇÃO DO PETRÓLEO A Resultados Parciais do Projeto de Iniciação Científica (PIBIC-UNICAP). Financiamento: CNPq, TERMOPE, UNICAP. Pedro Pinto Ferreira Brasileiro 1 ; Juliana Moura de Luna 2 ; Raquel Diniz Rufino 2 ; Leonie Asfora Sarubbo 3 1 Graduando em Engenharia Química, UNICAP e Centro de Ciências e Tecnologia. CEP , [ppfbrasileiro@hotmail.com]. Bolsista PIBIC/CNPq; 2 Pós-Doutorandas (PNPD), UNICAP e Centro de Ciências e Tecnologia, UNICAP. Bolsistas CAPES/FACEPE; 3 Professora e Pesquisadora do Centro de Ciências e Tecnologia, UNICAP. Resumo Os surfactantes microbianos são candidatos em potencial a remediadores de cargas petrolíferas nos oceanos, refletindo a alta biodegrabilidade, a elevada emulsão entre meios imiscíveis, a estabilidade, entre outros benefícios. Nesse sentido, o trabalho teve o objetivo de avaliar o biossurfactante produzido pela levedura Candida guilliermondii como agente de remediação de derivados de petróleo em água marinha. Os experimentos foram conduzidos ao longo de 90 dias para verificar a tensão superficial do biossurfactante pelas metodologias de tindalização fracionada, sorbato de potássio e vapor fluente com sorbato. Houve destaque para baixas tensões no vapor fluente e sorbato a 1%, embora a do sorbato a 0,2%, por apresentar bons resultados, foi escolhida para variar o ph e medir a tensão superficial e o índice de emulsificação. Após formidáveis resultados, como uma emulsão de 99,0%, foi realizado um estudo comparativo das propriedades básicas do biossurfactante entre uma shaker e um biorreator. Essa analogia funcionou para elevar o rendimento de 8,5 g/l, no instrumento de laboratório, a 32,0 g/l, na máquina industrial, além de manter as propriedades surfactantes. Os resultados demonstram a possibilidade da formulação de um agente surfactante eficiente para aplicação no derramamento de petroderivados. Palavras-chave: Remediadores, Estabilidade, Tensão Superficial.

2 INTRODUÇÃO No dia 15 de julho de 2010, encerrava-se o maior acidente petrolífero, a nível mundial, ocorrido no Golfo do México. Nesse, houve o derramamento de 750 milhões de litros de petróleo, alastrando um desequilíbrio na fauna e flora marinhas por 1,5 Km de extensão (MASCARELLI, 2010). Com a finalidade de tentar solucionar o fato, cientistas utilizaram 3 milhões de litros de agentes químicos, nos quais a mistura de hidrocarbonetos se dispersou, contudo tais compostos remediadores, surfactantes, possuem uma severa desvantagem, a alta toxicidade (MASCARELLI, 2011). O argumento ideal, em estudo, para retrucar essa consequência ambiental é o uso de micro-organismos com a capacidade de deteriorar resíduos industriais. Tal mérito economiza o alto custo dos componentes químicos (AL-BAHRY et al., 2012). Outrossim, recicla os resíduos industriais, propiciando a formação de um produto tão ou mais eficaz quanto os usuais dispersantes químicos. Aqueles são denominados de biossurfactantes: os biorremediadores do petróleo. Por ser produzido no estado de agregação líquido, o biossurfactante possui uma propriedade específica, exemplificada pelo motivo de alguns insetos não submergirem quando estão em contato com a superfície aquosa. A razão citada se explica por existir um limite entre diferentes meios como a água e o ar por forças repulsivas. Essas, quando baixas, possibilitam o líquido a se espalhar com mais facilidade, garantindo uma maior área de contato ao ser aplicado em alguns materiais e havendo consequentemente um aumento na velocidade da reação (DALTIN, 2011), e a dispersar meios apolares como o petróleo com grande facilidade. Tal característica é a redução das tensões superficial e interfacial, cujos dados consolidam a capacidade da dispersão dos óleos nos biossurfactantes e os ratificam essenciais no controle dos desastres petrolíferos. O objetivo é verificar a estabilidade do biossurfactante por Candida guilliermondii para remediar áreas com contaminação por derivados de petróleo na água do mar.

3 MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo A levedura Candida guilliermondii (UCP 995), depositada no Banco de Culturas do Núcleo de Pesquisas Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco foi utilizada como produtora do biossurfactante. Meios de manutenção, crescimento do inóculo e de produção do biossurfactante A levedura foi mantida através da mistura sólida de Yeast Mold Agar (YMA), composta por: extrato de levedura (0,3%), D-glicose (1%), peptona (0,5%), ágar bacteriano (2%) e água destilada q.s.p. (100 ml). Os componentes foram esterilizados em autoclave a 121 C por 20 min. A exclusão do ágar propicia à mistura o estado de agregação líquido e é denominada de Yeast Mold Broth (YMB), o qual é o meio de crescimento do inóculo. O meio de produção consistiu no acréscimo de 4% de milhocina, 2,5% de melaço e água destilada q.s.p. (6 ou 20 L), o ph foi ajustado para 5,5, acrescentou-se o óleo de soja e todo o meio foi autoclavado a 121 C por 20 min. Preparação do inóculo O inóculo tornou-se padrão pela transferência da levedura para um tubo de ensaio, contendo o meio YMA, deixando-a em temperatura ambiente (25 C) para a devida manutenção. Logo após 72 horas, foram removidas assepticamente as leveduras até um frasco com YMB estéril. Por fim, o erlenmeyer do YMB foi posto a rotacionar na máquina incubadora shaker durante 24 horas, a 200 rpm e a 28 C. Produção do biossurfactante Para a produção do biossurfactante em shaker, após o crescimento do inóculo em meio líquido YMB, foi realizada uma diluição seriada para a contagem das células

4 por mililitro e calculado o volume para alcançar a concentração de 10 4 células/ml. Em seguida, utilizaram-se erlenmeyers, contendo o meio de produção estéril e sendo rotacionados a 200 rpm, a 28 C e durante 144 horas. Posteriormente, a fermentação para produção do biossurfactante em biorreator de 50 L foi realizada, com 20 L do meio de produção selecionado em shaker e estéril, sob agitação de 90 rpm, durante 144 horas e à temperatura de 28 ºC. Isolamento do biossurfactante O líquido metabólico gerado pelos shaker e biorreator foi centrifugado a 4500 rpm durante 15 min, para a retirada das células, e submetido ao processo de extração. Esse consiste no abaixamento do ph até 2 via uma solução de HCl 6,0 M, inserindo, em uma segunda etapa, 2 volumes de metanol. Essa mistura foi refrigerada a -15 C durante 24 horas, seca em estufa a 37 C por 48 horas e mantida em dessecador até o peso constante, calculando o produto em g/l (SOBRINHO et al., 2008). Determinação das propriedades surfactantes: tensões superficial e interfacial e índice de emulsificação. As tensões foram medidas pelo método do anel DU NUOY no tensiômetro KSV Sigma 70 (Finland). A superficial e a interfacial foram mensuradas pela força (mn/m) necessária para suspender o anel, rompendo o limite entre o biossurfactante e o meio analisado, seja o ar (superficial) ou o n-hexa-decano (interfacial). Para encontrar o índice de emulsificação, foram retirados 2 ml do biossurfactante e colocados em tubos de ensaio acoplados isovolumetricamente ao óleo de soja após a fritura e ao óleo motor utilizado. Tais recipientes foram agitados em vórtex durante 1 minuto e deixados, durante 24 horas, em repouso. O índice de emulsificação foi calculado pela razão entre a altura da emulsão e a altura total, sendo o valor multiplicado por 100 (COOPER; GOLDENBERG, 1987). Estabilidade do líquido metabólico com propriedade surfactante

5 O biodetergente produzido em shaker foi conservado em uma primeira etapa sob os procedimentos, realizados em triplicata, em que apenas as tensões superficiais foram medidas, verificando a estabilidade no tempo de estocagem (0, 10, 20, 30, 60 e 90 dias), descritos abaixo: A) Adição de diferentes concentrações do sorbato de potássio (0,2%, 0,6% e 1,0%); B) Aquecimento a 80 C (vapor fluente), por banho-maria, durante 30 min e depois adicionado 0,2% de sorbato de potássio, processo realizado; C) Esterilização por tindalização fracionada, por autoclave, durante 30 min por 3 dias consecutivos. Por ratificar a uniformidade das tensões superficiais, foi decidido reaplicar os testes. Desses, o A foi realizado, em triplicata, com a concentração de 0,2%, variando o ph (2, 4, 6, 8, 10 e 12) em idênticas proporções temporais. Para caracterizar o biossurfactante, foram mensurados a tensão superficial e o índice de emulsificação. Avaliação da capacidade surfactante do líquido metabólico em biorreator Após o teste de estabilidade com o sorbato a 0,2%, foi decidido utilizar um biorreator como produtor do biossurfactante, em proporções maiores, sendo realizados os testes de rendimento e a determinação das propriedades surfactantes. RESULTADOS E DISCUSSÃO Avaliação de diferentes técnicas de conservação do biossurfactante produzido por Candida guilliermondii A figura 1 apresenta as tensões superficiais do biossurfactante produzido por Candida guilliermondii, quando submetido às técnicas de conservação: adição de sorbato de potássio, vapor fluente com o sorbato a 0,2% e de tindalização fracionada. Figura 1 Tensões superficiais do experimento de diferentes concentrações de sorbato de potássio (0,2%, 0,6%, 1,0%), do vapor fluente com o sorbato a 0,2% e de tindalização fracionada

6 O líquido metabólico livre de células e de conservantes demonstrou uma tensão superficial de 31,3 mn/m, apresentando uma pequena redução, em todos os métodos para manutenção do tensoativo, nos dois primeiros dias de análise. O experimento teve a menor tensão superficial aos 10 dias com sorbato a 0,2%, 30,3 mn/m e as condições de sorbato a 1% e de vapor fluente com o sorbato a 0,2% foram eficazes para a tensão permanecer inferior comparada à inicial. A vantagem dos métodos do sorbato é o baixo custo comparado ao banho-maria e à autoclave Testes de estabilidade pelo método do sorbato de potássio sob a concentração de 0,2% Ao se corroborar a eficiência das metodologias através das tensões, testes de estabilidade com a adição de 0,2% do sorbato de potássio com a alternância do ph foram realizados para a medição das propriedades surfactantes. Na figura 2 são mostradas as variações da tensão superficial com a alteração do potencial hidrogeniônico pela metodologia do sorbato a 0,2%. Pelos critérios de baixas tensões superficiais e uniformidade, no ph 8, o biossurfactante indicou tensões iniciais, ao nível da tensão-controle, 31,3 mn/m. Logo, houve um destaque do biodetergente nesse potencial, ao qual se assemelha curiosamente ao dos oceanos em geral.

7 Figura 2 Tensões superficiais do experimento da concentração de sorbato de potássio 0,2% A figura 3 ilustra os índices de emulsificação do biossurfactante, utilizando óleo de soja (Figura 3A) e óleo de motor (Figura 3B). Pode-se observar que, utilizando o óleo de soja como substrato, verificou-se um aumento nos índices de emulsificação nos ph s 10 e 12. No óleo motor, as variações de ph mantiveram percentuais elevados na compatibilidade da biomolécula como o resultado de 99,0% no ph 12. Figura 3 Emulsões do óleo de soja (A) e do óleo motor (B) do experimento da concentração de sorbato de potássio a 0,2% Determinação das propriedades do biossurfactante em shaker e em biorreator O grande apanágio do uso do biorreator, processo scale-up, foi o rendimento obtido. Esse, comparado à shaker, de produção 8,5 g/l, ascendeu a 32,0 g/l. O biossurfactante também reduziu as tensões superficial da água (72,0 mn/m) para 31,3 mn/m em shaker e para 34,7 mn/m em biorreator e a interfacial entre a água e o n-

8 hexa-decano (40 mn/m) foi reduzida, em igual ordem, para 7,17 mn/m e 10,22 mn/m. Ademais, na shaker, o índice de emulsificação no óleo de soja foi de 25,8% e no óleo motor foi de 90,5%. O biorreator aumentou o primeiro índice para 33,6% e não alterou perceptivelmente a emulsificação no óleo motor com 90,0%. As características do biossurfactante produzido por biorreator foram plausíveis, entretanto a necessidade do estudo para se obter as melhores condições é essencial. CONCLUSÃO 1 As metodologias de conservação foram adequadas, reduzindo a tensão superficial para 30,4 mn/m no vapor fluente; 2 Alterações com efetivas propriedades surfactantes em ph s entre 8 e 12; 3 A produção em biorreator foi vantajosa, refletindo a necessidade da pesquisa para combater os desastres ambientais gerados pelo homem; REFERÊNCIAS AL-BAHRY et al., S.N. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B20 using date molasses and its possible application in enhanced oil recovery. International Biodeterioration & Biodegradation, doi: /j.ibiod COOPER, D. G.; GOLDENBERG, B. G. Surface-Active Agents from two Bacillus Species. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 53, p , DALTIN, D. Tensoativos: química, propriedades e aplicações. São Paulo: Blucher, MASCARELLI, Amanda. Deepwater Horizon: After the oil. Nature International Weekly Journal of Science, 01º Sep Disponível em: < Acesso em 04 jan MASCARELLI, Amanda. Deepwater Horizon dispersants lingered in the deep. Nature International Weekly Journal of Science, 27 Jan Disponível em: < Acesso em 06 jan

9 SOBRINHO, H. B. S. Utilization of two agroindustrial by-products for the production of a surfactant by Candida guilliermondii UCP0995. Process Biochemistry, v. 43, p , 2008.