INFLUÊNCIA DE DIFERENTES NEUTRALIZADORES DE PH NA PRODUÇÃO DE D(-) ÁCIDO LÁTICO POR Sporolactobacillus nakayamae

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1 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES NEUTRALIZADORES DE PH NA PRODUÇÃO DE D(-) ÁCIDO LÁTICO POR Sporolactobacillus nakayamae INFLUENCE OF DIFFERENT ph NEUTRALIZERS IN D(-) LACTIC ACID PRODUCTION BY Sporolactobacillus nakayamae Susan Michelz Beitel (1) Daiane Cristina Sass (2) Luciana Fontes Coelho (3) Jonas Contiero (4) Resumo O intuito do estudo foi obter elevadas concentrações de D(-) ácido lático por via fermentativa. Para a otimização deste processo, explorou-se a utilização de diferentes neutralizadores de ph, que têm grande influência na produção de ácido lático, nos custos do processo, e no produto final obtido. O micro-organismo produtor de D(-) ácido lático, Sporolactobacillus nakayamae, apresentou níveis elevados de produção. As fermentações foram realizadas em biorreator Infors HT Multifors 2, contendo 0,27 L de meio GYP modificado (35 g/l de extrato de levedura, 110 g /L de açúcar cristal e 7,5 sais GYP ml). As concentrações de ácido láctico e sacarose foram determinadas por cromatografia líquida (HPLC). O controlador de ph selecionado foi NaOH 10N, levando em consideração a praticidade do processo, e as melhores respostas obtidas em relação à produção de ácido lático (103,71 g/l), produtividade (2,16 g/l.h) e rendimento (0,94 g/g). Palavras-chave: Ácido lático. Fermentação submersa. Neutralizadores. Abstract The aims of this study was to obtain high concentrations of D (-) lactic acid by fermentation. To improve this process, the utilization of different ph neutralizers was explored, those have great influence on the production of lactic acid, the process cost, and end product obtained. The micro-organism producing D (-) lactic acid, Sporolactobacillus nakayamae, showed high levels of production. Fermentations were performed in a bioreactor Infors HT Multifors 2 containing 0.27 L of modified GYP medium (35 g / L yeast extract 110 g / l of granulated sugar and 7.5 ml GYP salts). The concentrations of lactic acid and sucrose were determined by liquid chromatography (HPLC). The selected ph controller was NaOH 10N, taking into 1 Doutoranda em Microbiologia Aplicada pela UNESP-Rio Claro. Endereço eletrônico: susan_mibe@hotmail.com 2 Doutora em Química pela USP. Docente da UNESP- Rio Claro. Endereço eletrônico: daiane_sass@hotmail.com 3 Doutora em Microbiologia Aplicada pela UNESP- Rio Claro. Endereço eletrônico: lufonco@yahoo.com.br 4 Doutor em Engenharia de alimentos pela UNICAMP. Docente da UNESP Rio Claro. Endereço eletrônico: jconti@rc.unesp.br

2 account the practicality of process and the best responses obtained in the production of lactic acid ( g / L), productivity (2.16 g / L h) and yield ( 0.94 g / g). Keywords: Lactic acid. submerged fermentation. Neutralizers. 1 Introdução O ácido lático é um composto amplamente utilizado nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, médicas e químicas (SAKAY e YAMANAMI, 2006). A sua produção por fermentação apresenta diversas vantagens quando comparada com a síntese química, como por exemplo, os baixos custos de substratos, temperaturas relativamente baixas, além de baixo consumo de energia. Estudos demonstram que o controle do ph durante a fermentação favorece a produção de ácido lático (MUSSATTO et al., 2008). Para o controle de ph durante a fermentação são utilizados alguns agentes neutralizantes, como, carbonato de cálcio, carbonato de sódio e hidróxido de sódio, adicionados ao meio de fermentação. Entre esses agentes, o carbonato de cálcio tem sido amplamente utilizado nas pesquisas com frascos agitados e em reator (YEN, 2010). 2 Material e Métodos Micro-organismo O micro-organismo S. nakayamae utilizado no trabalho é um bacilo gram +, homofermentativo produtor de D(-) ácido lático e formador de espóros. Está armazenado em meio GYP (Glucose-Yeast-Peptona) e glicerol 30 %, na proporção de 1:1 (v/v) à -80 C. Inóculo O micro-organismo foi crescido por aproximadamente 24 horas à 35 C, ou até atingir Densidade Óptica (DO 600 ) de 2,5. A concentração celular foi avaliada por turbidimetria, com absorbância determinada a 600 nm em espectrofotômetro. O volume de inóculo foi 10% do volume total de cultivo nos experimentos. Condições de cultivo As fermentações foram realizadas em reator Multifors 2, com volume de trabalho inicial de 300 ml,o ph foi mantido em 6.0 ao longo da fermentação por adição automática intermitente das bases estudadas. A temperatura deste processo foi de 35 ºC e agitação de 100

3 RPMs. As fermentações foram conduzidas por 48 horas, das quais amostras foram retiradas periodicamente e utilizadas para quantificação de D(-) ácido lático e sacarose residual. O meio de cultivo utilizado nas fermentações foi composto por 110 g/l açúcar cristal, 35 g/l extrato de levedura Bionis e 7,5 ml/l solução de sais GYP. Agentes neutralizantes de ph em biorreator Várias bases podem ser utilizadas para neutralizar a acidez do meio durante a fermentação, e a escolha dessa base irá influenciar na produção nas etapas posteriores do processo. Para tanto, diferentes bases foram estudadas, sendo elas Ca(OH) 2 6N, KOH 10N, NaOH (10N), CaCO3 5% e 6%, NH 4 OH (27%). O volume final das fermentações foi considerado para cálculo de normalização do ácido lático produzido (normalização = produção g/l x volume final ml/volume inicial ml). Quantificação do ácido lático e da sacarose Ao final da fermentação, as alíquotas coletadas foram centrifugadas à 7000x g por 10 minutos, e o sobrenadante apropriadamente diluído e filtrado por membrana de acetato celulose, foi utilizado para quantificação do ácido lático e sacarose. Foi empregado o cromatógrafo líquido de alto desempenho, equipado com coluna Rezex ROA (300 x 7,8 mm) da Phenomenex, eluída com H 2 SO 4 0,005N como fase móvel, fluxo de 0,6 ml/min, volume de injeção de 5 µl e temperatura de 65 C. 3 Resultados e Discussão Perfil de produção de D (-) ácido lático utilizando diferentes neutralizadores de ph Através da figura 1 é possível verificar a quantidade de ácido lático produzido em 48 horas e a sacarose residual referente às fermentações submetidas aos diferentes controladores de ph: O controlador de ph selecionado foi NaOH 10N, levando em consideração a praticidade do processo, e as melhores respostas obtidas em relação à produção de ácido lático (103,71 g/l), produtividade (2,16 g/l.h) e rendimento (0,94 g/g). Esta base apresenta alta solubilidade (1090 g/l em água à 20 ºC), o que possibilita utilizar uma solução bastante concentrada (10N), alterando pouco o volume final da fermentação.

4 Figura 1 Comparação entre diferentes controladores de ph na fermentação para produção de D(-) ácido lático. Meio GYP modificado, 35 ºC, agitação de 100 rpm por 48 horas. A-KOH; B- Ca(OH) 2, C- NaOH; D- CaCO 3 5%; E- CaCO 3 6%; F- NH 4 OH Ácido Lático g/l Sacarose residual g/l 0 A B C D E F Neutralizadores de ph Ácido lático Sacarose residual 0 Os controladores CaCO 3 ou Ca(OH) 2 apresentam menor solubilidade em água (0,014 g/l e 185 g/l respectivamente), dessa forma requerem constante agitação no recipiente conectado ao fermentador, pois sedimentam no frasco e eventualmente obstruem as mangueiras pelas quais chegam ao fermentador. Estudou-se a possibilidade de adicionar uma solução de 500 g/l de CaCO 3, porém em 24 horas 200 ml desta solução foi adicionada automaticamente ao vaso de fermentação, chegando ao volume máximo do reator, não mantendo o ph em 6.0 durante todo o processo, o CaCO 3 utilizado nesta concentração causou obstrução das mangueiras do fermentador. Dessa forma foi adicionado no início da fermentação dentro do reator, 5% de CaCO 3. Ao final de 48 horas a produção foi de 91,17 g/l de ácido lático, mas nesta condição o ph 6.0 não foi mantido e o ph final da fermentação foi 3.4. Quando adicionado 6% de CaCO 3 no período inicial da fermentação no interior do vaso, verificou-se que a produção de ácido lático é reduzida (37,46 g/l), indicando que esta concentração é inibitória para o micro-organismo. O controlador NH 4 OH 27%, inibiu o crescimento da bactéria antes mesmo de ser adicionado. Por ser um composto volátil, os vapores deste reagente nesta concentração foram capazes de basificar o ph do meio, inibindo o crescimento do micro-organismo.

5 4 Conclusões S. nakayamae foi capaz de produzir elevados níveis de D(-) ácido lático quando o ph da fermentação foi mantido por adição de NaOH, apresentando baixas concentrações de sacarose residual ao final da fermentação. Ademais, a adição deste neutralizante apresenta facilidade no manuseio do processo por não necessitar de agitação constante, não obstrui mangueiras e não eleva significativamente o volume da fermentação por ser um composto altamente solúvel. Outra vantagem de se utilizar o NaOH como neutralizante, se considerado um posterior processo de purificação por eletrodiálise, este composto pode ser reutilizado no processo fermentativo, sem gerar resíduos. 5 Agradecimentos/Apoio financeiro Braskem, FAPESP, CNPq Referências MUSSATTO, S.I., FERNANDES, M., MANCILHA, I.M., ROBERTO, I.C. Effects of medium supplementation and ph control on lactic acid production from brewer s spent grain. Bioch. Eng. J., v. 40, n.3, p , SAKAI, K., YAMANAMI, T. Thermotolerant Bacillus licheniformis TY7 produces optically active L-lactic acid from kitchen refuse under open condition. J. Biosci. Bioeng., v.102, n.2, p , YEN, H.W; CHEN, T.J.; PAN, W.C.; WU, H.J. Effects of neutralizing agents on lactic acid production by Rhizopus oryzae using sweet potato starch. World J. Microbiol. Biotechnol. v.26, n.3, p , 2010.