Mestrando em microbiologia agropecuária pela FCAV-UNESP. Endereço 4

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1 INFLUENCIA DOS NUTRIENTES (N, P, Mg, Mn E Zn) SOBRE A MULTIPLICAÇÃO DE LEVEDURA. Influence of nutrients (N, P, Mg, Mn and Zn) in the yeast multiplication. MATHEUS DE CASTRO IRENE (1) WELTON JOSÉ DO PRADO (2) VITOR TEIXEIRA (3) FRANCIELE QUINTINO MENDES (4) CRISTHYANE MILLENA DE FREITA (5) MÁRCIA ROSSINI JUSTINO MUTTON (6) Resumo A produção de bioetanol no Brasil, se faz quase que exclusivamente por fermentação de mosto, constituído por caldo de cana-de-açúcar. Alguns macronutrientes e micronutrientes também são adicionados ao mosto, a fim de complementar as deficiências do meio, tornando alguns elementos indispensáveis às leveduras para uma máxima transformação dos açúcares, fato este que também influencia na multiplicação da célula. O presente trabalho teve como objetivo comparar a influência da adição de nutrientes no crescimento de massa, suplementando-os com nitrogênio(n), fósforo(p), magnésio (Mg), manganês(mn) e zinco (Zn) em dois mostos diferentes, um com caldo de cana e outro preparado com mosto glicose a 4º Brix. O delineamento experimental foi adotado em parcelas subdivididas com duas repetições, empregando-se 9 tratamentos distintos. Após a análise dos resultados, verificou-se que o caldo de cana oferecia as quantidades de nutrientes suficientes para o crescimento de massa e que não há necessidade de uma suplementação, para o meio de glicose a suplementação com fósforo foi a melhor, destacando este como componente essencial. Palavra Chave: Bioetanol. Crescimento de massa. Levedura. Mosto. 1 Graduando em bicombustíveis pela FATEC Jaboticabal. Endereço eletrônico: Matheus.irene@hotmail.com 2 Graduando em bicombustíveis pela FATEC Jaboticabal. Endereço eletrônico: japinha_welton@hotmail.com 3 Mestrando em microbiologia agropecuária pela FCAV-UNESP. Endereço eletrônico:vitor-nh@hotmail.com 4 Graduando em engenharia agronômica pela FCAV-UNESP. Endereço eletrônico:fran_bh@hotmail.com ³ Mestrando em microbiologia agropecuária pela FCAV-UNESP. Endereço eletrônico: cristhyanemille@hotmail.com 6 Professora Titular pela FCAV-UNESP Endereço eletrônico: marcia.mutton@gmail.com

2 Abstract The production of ethanol in Brazil, is done almost exclusively by fermenting wort, consisting of broth sugarcane. Some macronutrients and micronutrients are also added to the must in order to complement the deficiencies through, making some essential elements to yeast for maximum transformation of sugars, a fact that also influences the proliferation of the cell. This study aimed to compare the influence of the addition of nutrients in the mass growth, supplementing them with nitrogen (N), phosphorus (P), magnesium (Mg), manganese (Mn) and zinc (Zn) in two different musts, with sugarcane juice and other prepared wort glucose 4th Brix. The experimental design was adopted in split plot with two replications, using 9 different treatments. After analyzing the results, it was found that the sugar cane juice offered quantities sufficient nutrients for the mass growth and there is no need for supplementation to the medium glucose supplementation with phosphorus was better highlighting this as essential component. Keywords: Bioethanol. mass growth. Yeast. Must. 1 Introdução A matéria-prima mais rentável para produção de bioetanol é a cana-de-açúcar, sendo o Brasil, produtor mundial, este fato ocorre por esta ser uma planta na qual apresenta colmos ricos em açúcares fermentáveis. (ÚNICA, 2016). A Fermentação alcoólica é um processo conhecido e utilizado desde antiguidade para a fabricação de pão e bebidas alcoólicas, e outros alimentos. Recentemente a fermentação empregando leveduras com capacidade de sobrevivência em condições aeróbicas e anaeróbicas vem sendo utilizada em processos fermentativos na produção de etanol ou multiplicação de massa. Antecedendo ao processo fermentativo deve-se realizar a multiplicação e desenvolvimento das leveduras, e para tanto este depende da disponibilidade de nutrientes, como P, N, Mg, Mn e Zn. Deve-se destacar cada nutriente apresenta uma atividade específica podendo favorecer ou comprometer a fermentação. De modo semelhante o fósforo é essencial para o metabolismo da célula uma vez que estão diferentemente relacionados aos processos de energia e na síntese de ácidos nucleícos, fundamentais para a transformação de açúcar em álcool e na produção de ATP tanto na glicose como na cadeia respiratória. O magnésio desempenha um papel importante no crescimento das leveduras atuando como co-fator de muitas reações metabólicas, além de atuar como ativadores enzimáticos na glicose junto ao zinco (AMORIM, 1977; VASCONCELOS, 1987).

3 Com este propósito, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito da presença dos elementos nitrogênio, fósforo, magnésio, manganês e zinco em mostos de glicose e caldo de cana de açúcar sobre multiplicação da levedura. 2 Material e Métodos O experimento foi conduzido no Laboratório de Tecnologia do Açúcar e do Álcool e Microbiologia das Fermentações FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal-SP, na safra 2014/15. O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com duas repetições, empregando-se 9 tratamentos principais a 4º Brix sendo: 1. Testemunha (mosto de caldo de cana); 2. Testemunha (mosto de glicose); 3. Mosto de Glicose + P + Mg + Mn + Zn; 4. Mosto de Glicose + N + Mg + Mn + Zn; 5. Mosto de Glicose + N + P + Mn + Zn; 6. Mosto de Glicose + N + P + Mg + Zn; 7. Mosto de Glicose + N + P + Mg + Mn; 8. Mosto de Glicose + N + P + Mg + Mn + Zn; 9. Mosto de caldo de cana + N + P + Mg + Mn + Zn; Os resultados foram submetidos à análise de comparação de médias de interação segundo teste de Tukey (5% de probabilidade), utilizando-se o programa ASSISTAT versão 7.7 betas. O caldo de cana foi extraído através de moenda de laboratório, com padronização de 4º Brix, estabelecida a temperatura de 32ºC. Os mostos foram padronizados como apresentados a seguir. Mosto padrão: Preparados 250 ml de mosto a partir de caldo de cana, com a concentração de 4º Brix, estabelecido o ph em 4,5 com ácido sulfúrico. Mosto comparativo: Preparados 250 ml de mosto a partir de glicose, já suplementados com fontes de sais estabelecidos como tratamento principal, nas concentrações de 4º Brix. A preparação dos sais foram adicionados nos seguintes teores: 300 ppm de N, na forma de sulfato de amônio; 332 ppm de P, na forma de Fosfato monoácido de Potássio; 50

4 ppm de Mg, na forma de Sulfato de magnésio; 10 ppm de Mn, na forma de Sulfato de manganês; 10 ppm de Zn, na forma de Sulfato de zinco; A multiplicação, de células foi conduzida em incubadora com agitação constante e controle de temperatura, utilizando-se fermento biológico fresco processo, na concentração de 15% do volume, quando o Brix atingia a 1. Posteriormente o fermentado foi centrifugado em centrifuga de laboratório a 5000 rpm, por 5 minutos. Obtendo-se a fase líquida e massa de levedura. As analises microbiológica foram determinados pelo método direto no pé-de-cuba tempo inicia e tempo final do processo de multiplicação de células. Os parâmetros quantificados foram: Brix do mosto, segundo Scheneider (1979); ph do mosto: leitura direta por phmetro, com correção de temperatura; Acidez sulfúrica do mosto e vinho: metodologia proposta por Amorim et al. (1996); Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT): segundo Copersucar (2001); viabilidade de células das leveduras, brotamento e viabilidade de brotos, segundo Lee et al. (1991). 3 Resultados e Discussão Para se iniciar um crescimento de massa, o recomendável é que as quantidades de células vivas apresentem porcentagem de celular acima de 85% para obtermos um crescimento eficaz (AMORIM, 2005). Sendo assim, no resultado do pé-de-cuba apresentou uma viabilidade de 99% no brotamento de 2% e a viabilidade dos brotos de 100% portanto acima do recomendável. Posteriormente ao processo de multiplicação e centrifugação, obteve-se a massa de células e a fase líquida, estes foram analisados ph, acidez total, açúcares redutores residuais totais (ARRT) na Tabela 1. O ph é uma importante variável sendo que para cada microrganismo há um ph ideal, para a levedura valores da ordem de 4 a 5,0 servem como um preventivo de contaminação. Avaliando-se resultados a tabela 1 verifica-se que valores muito abaixo do ideal afetando diretamente no crescimento de massa. Para os parâmetros de acidez total e ARRT não apresentou diferença significativa dentre os tratamentos avaliados, entendendo-se que a presença de nutrientes não interferiu na produção de ácidos, e os resíduos de açúcares.

5 Avaliando-se o crescimento de massa dentre os tratamentos, observou-se que a ausência de fósforo promoveu dução significativa deste parâmetro quando utilizou-se caldo de cana de açúcar suplementado com todos os nutrientes os valores obtidos foram 11,23% superiores no mostos de glicose (tabela 1). Tabela 1 Resultados da análise de variância (teste de F) e comparação de médias pelo teste de Tukey (5% de probabilidade) do vinho residual do processo a 4ºBrix para as análises de ph, Acidez Total, Açúcares Redutores Residuais Totais. Safra 2014/15. Tratamentos ph Acidez Total (g.l-1 H 2 SO 4 ) ARRT (%) Significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0,01); * significativo ao nível de 5% de probabilidade (0,01 =< p < 0,05) e ns não significativo (p >=0,05). CV% = Coeficiente de variação. DMS = Diferença mínima significativa 5). Segundo Amorim (2005), avaliando-se os teores de magnésio, manganês e o zinco, verifica-se que não apresentou diferença significativa comparando-se aos demais nutrientes, diferenciando-se apenas quando suplementado com fósforo no mosto. Massa (gramas) 1 3,10A 1,75A 0,03A 17,05AB 2 2,80B 1,77A 0,03A 15,80BC 3 2,77B 1,71A 0,03A 15,50BC 4 2,33D 1,86A 0,03A 14,70C 5 2,44CD 1,92A 0,03A 15,70BC 6 2,39D 1,99A 0,03A 15,70BC 7 2,41D 1,95A 0,02A 15,45BC 8 2,34D 1,99A 0,04A 15,05BC 9 2,66BC 1,83A 0,03A 18,20A Teste F 39,12** 0,62ns 1,07ns 7,64** DMS 0,23 0,73 0,02 2,17 CV (%) 2,31 9,93 23,96 3,45 4 Conclusões. No presente trabalho dentre todos os nutrientes o fósforo destaca-se como um componente essencial para células no crescimento de massa.

6 Referências AMORIM, H. V.Fermentação alcoólica, ciência & tecnologia. Piracicaba. Fermentec. 448 p.2005 VASCONCELOS, J. N. de. Guia de Aulas Práticas: Engenharia Bioquímica e Tecnologia do álcool. Laboratório de Derivados da Cana-de-Açúcar, Centro de Tecnologia da Universidade Federal de Alagoas, 26 p,2000. SANTOS, A. M. D. Estudo da influência da complementação de nutrientes no mosto sobre o processo de fermentação alcoólica em batelada, COPERSUCAR. Manual de controle químico da fabricação de açúcar. Piracicaba: [s.n.], 1 CD-ROM,2001.