COMPOSTOS FENÓLICOS AFETAM A LEVEDURA DURANTE O PROCESSO FERMENTATIVO PHENOLIC COMPOUNDS AFFECTS THE YEAST DURING THE FERMENTATIVE PROCESS

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1 COMPOSTOS FENÓLICOS AFETAM A LEVEDURA DURANTE O PROCESSO FERMENTATIVO PHENOLIC COMPOUNDS AFFECTS THE YEAST DURING THE FERMENTATIVE PROCESS Richelly Caroline Messias (1) Lucas Conegundes Nogueira (2) Gustavo Henrique Gravatim Costa (3) Resumo O objetivo deste trabalho foi estudar os reflexos de diferentes doses de compostos fenólicos no mosto, sobre a fisiologia da levedura em fermentação. O experimento foi realizado no Laboratório de Biomassa e Bioenergia da Universidade do Sagrado Coração, Bauru-SP, na safra 2015/2016. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 5 tratamentos e 3 repetições. Os tratamentos foram constituídos por diferentes doses de compostos fenólicos no mosto: 0, 300, 500, 700 e 900mg/L. O mosto foi preparado a 16 Brix, utilizando açúcar cristal orgânico diluído em água destilada. Inoculou-se em 175mL mosto, fermento biológico prensado na proporção de 10 8 UFC/mL. Após 1 hora, adicionou-se em cada recipiente de fermentação, 175mL de mosto, totalizando 350mL. Após 40 minutos da segunda alimentação (início da fermentação) e no final do processo fermentativo, foram retiradas alíquotas para determinação da viabilidade celular, índice de brotamentos e viabilidade de brotos. O vinho foi caracterizado quanto ao Brix, ph, Acidez Total e Glicerol. Os resultados foram submetidos a análise de variância pelo teste F, e as médias comparadas segundo teste de Tukey (5%). Observou-se que doses superiores a 500mg/L resultaram em decréscimo da viabilidade celular, índice de brotamentos e viabilidade de brotos no início e final do processo fermentativo. Neste sentido, verificou-se também que esta dose promoveu os maiores teores de acidez no vinho. Conclui-se que durante o processo fermentativo, a levedura é afetada quando o mosto apresenta resíduos de compostos fenólicos superiores a 500mg/L. Palavras-chave: Bioenergia. Setor sucroenergético. Saccharomyces cerevisiae. Fisiologia da levedura. Fermentação alcoólica 1 Graduanda em Engenharia Agronômica pela Universidade do Sagrado Coração. Endereço eletrônico: richellycaroline@hotmail.com 2 Graduando em Engenharia Química pela Universidade do Sagrado Coração. Endereço eletrônico: lukas_conegundes@hotmail.com. 3 Doutor em Microbiologia Agropecuária pela FCAV/UNESP. Docente da Universidade do Sagrado Coração. Endereço eletrônico: gustavo.costa@usc.br

2 Abstract The aim of this study was evaluate the consequences of different phenolic compound doses in the must, on yeast physiology in fermentation. The experiment was conducted in the Laboratory of Biomass and Bioenergy in the Universidade do Sagrado Coração, Bauru-SP, in the season 2015/2016. The experimental design was completely randomized with 5 treatments and 3 repetitions. The treatments consisted of different phenolic compounds doses in the must: 0, 300, 500, 700 and 900mg/L. The must was prepared at 16 Brix using organic crystal sugar diluted in distilled water. It was inoculated in 175ml must, yeast compressed at a ratio of 10 8 CFU/mL. After 1 hour, were added to each vessel fermentation, more 175ml must, totaling 350mL. After 40 minutes the second feed (start of fermentation) and the end of the fermentation, aliquots were removed to determine the cell viability, index buds and buds viability. The wine was characterized as Brix, ph, Total Acidity and Glycerol. The results were submitted to analysis of variance by F test, and the averages compared by Tukey test (5%). It was observed that doses greater than 500 mg/l resulted in decreased cell viability, budding index and bud viability at the beginning and end of the fermentation process. In this sense also it has been found that this dose promoted higher levels of acidity in the wine. It follows that during the fermentation process, the yeast is affected when the waste must showed phenolic compounds exceeding 500mg/L. Keywords: Bioenergy. Sucroenergetic sector. Saccharomyces cerevisiae. Yeast physiology. Alcoholic fermentation 1 Introdução A cana de açúcar exerce um papel muito importante na economia do Brasil, além da produção de açúcar, destaca-se a produção de etanol, que é muito valorizado, pois substitui os combustíveis fosseis. O complexo sucroalcooleiro do Brasil é um dos mais modernos e competidores do mundo, o que faz do país parte da lista de maiores produtores de açúcar e etanol. Estima-se que para a safra 2015/2016, sejam produzidos aproximadamente 29,21 bilhões de litros, um aumento de 554,75 milhões de litros em relação a safra 2015/2015 (CONAB, 2015). O etanol no Brasil é produzido a partir da fermentação do caldo de cana pela levedura do gênero Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, determinados compostos presentes no

3 mosto, tais como polímeros, cálcio, ácidos, e fenóis podem afetar negativamente a fisiologia das leveduras durante o processo fermentativo (WALKER, 1998). Deve-se destacar, que a concentração destes elementos varia de acordo com a matériaprima processada. Admite-se, por exemplo, que a cana-de-açúcar comprometida por cigarrinha-das-raízes (Mahanarva fimbriolata) e por broca-da-cana (Diatrea sacharalis), apresenta elevados teores de compostos fenólicos totais do que cana não infestada (RAVANELI et al., 2011). Embora sabe-se que matéria-prima de baixa qualidade afeta diretamente o processo fermentativo, não há possibilidade de descarte deste material pela unidade agroindustrial. Contudo, faz-se necessário o estudo dos impactos desta matéria-prima sobre o processo fermentativo. Neste sentido, não há na literatura dados que apontem o teores máximos de fenol que afetam significativamente a levedura durante o processo fermentativo. Desta maneira, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes concentrações de compostos fenólicos sobre a fisiologia da levedura, e os reflexos sobre a qualidade do vinho obtido. 2 Material e Métodos O experimento foi realizado no Laboratório de Biomassa e Bioenergia da Universidade do Sagrado Coração, Bauru-SP, na safra 2015/2016. Utilizou-se solução de fenóis 10% (p/v), preparada a partir da dissolução de cristais de fenol p.a. (ácido fênico) da marca VETEC, em água destilada. Os mostos foram preparados diluindo-se 56g de açúcar cristal orgânico em 350mL de água destilada, obtendo-se concentração final de 16 Brix. Adicionou-se aos mostos as doses de 0, 300, 500, 700 e 900mg/L. A seguir inoculou-se em 175mL mosto, fermento biológico prensado (levedura S. cerevisiae) na proporção de 10 8 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por mililitro, que apresentava viabilidade celular superior a 85%. Após 1 hora, adicionou-se em cada recipiente de fermentação, 175mL de mosto. A fermentação foi considerada encerrada, quando o Brix foi inferior a 1%. Após 40 minutos da segunda alimentação (início da fermentação) e no final do processo fermentativo, foram retiradas alíquotas para determinação da viabilidade celular, índice de brotamentos e viabilidade de brotos (LEE et al., 1981). O vinho foi caracterizado quanto aos teores de Brix, ph, Acidez Total e Glicerol, segundo método Copersucar (2001). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 5 tratamentos e 3 repetições. Os tratamentos foram constituídos por diferentes doses de polímero no mosto.

4 Os resultados foram submetidos a análise de variância pelo teste F, e as médias comparadas segundo teste de Tukey (5%) (BARBOSA; MALDONADO, 2015). 3 Resultados e Discussão Na tabela 1 estão apresentados os valores médios obtidos para viabilidade celular, índice de brotamento e viabilidade de brotos no início do processo fermentativo. Avaliando-se a viabilidade celular, observou-se que o tratamento que apresentava 700mg/L de compostos fenólicos totais, resultou em decréscimo de 15% da quantidade de células vivas em relação ao demais tratamentos. Deve-se considerar que a fermentação industrial é realizada com viabilidade celular de leveduras superior a 85%, pois nestas condições ocorrem fermentações rápidas (8-10 horas) e completas (não há sobra de açúcares) (BASSO et al., 2011). Considerando-se o índice de brotamentos no início do processo fermentativo, verificou-se que a presença de fenóis resultou em decréscimo significativo deste parâmetro, sendo que a dose mínima de 300mg/L, foi suficiente para reduzir em 90% a quantidade de células em estágio de brotação, em relação ao tratamento em que não se adicionou fenóis. Este efeito também pode ser observado para a quantidade de brotos vivos, sendo que doses superiores a 500mg/L resulta em decréscimo significativo destes valores. Deve-se ressaltar que a não renovação da população de leveduras na dorna de fermentação é prejudicial ao processo industrial, uma vez que este micro-organismo será recuperado e reutilizado em novos ciclos fermentativos, durante toda a safra. Desta maneira, baixos índices de brotamento e de viabilidade de brotos, afetam negativamente a quantidade de células vivas a longo prazo (LIMA et al., 2001). Na tabela 2 estão apresentados os valores médios obtidos para viabilidade celular, índice de brotamento e viabilidade de brotos no final do processo fermentativo. Verificou-se que doses superiores a 500mg/L promoveu significativo decréscimo da viabilidade celular e da viabilidade de brotos no final do processo fermentativo. Estes resultados são similares aos obtidos por Ravaneli et al. (2011), que observaram que a fermentação de mostos com teores de fenóis próximos a 500mg/L, resultou em decréscimo da quantidade de células e brotos vivos. Ademais, cabe destacar que o índice de brotamentos foi afetado apenas nos tratamentos em que se aplicou 700 e 900mg/L de compostos fenólicos. Tais resultados são

5 inferiores aos determinados por Macri et al. (2014), que avaliando o processo fermentativo utilizando-se diferentes auxiliares de sedimentação no tratamento do caldo, verificou valores de brotamento ao final da fermentação de 10 a 30%.; e Montijo et al. (2014) que determinaram índices médios de 15% de células em estágio de brotamento ao final do processo. Tabela 1 Valores médios obtidos para viabilidade celular, índice de brotamentos e viabilidade de brotos no início do processo fermentativo de mostos com diferentes doses de compostos fenólicos totais. Doses Viabilidade celular Brotamento Viabilidade de Brotos mg/l % 0 91,66A 4,45A 88,66A ,33A 0,63B 73,33A ,00A 0,55B 0,00B ,00B 0,61B 78,00A ,00A 0,21B 0,00B Teste F 10,47** 25,39** 29,47** DMS 10,535 1,642 37,90 CV % 4,45 47,24 37,90 Letras diferentes diferem entre si segundo teste de Tukey (5%). **significativo ao nível de 1% de probabilidade. ns não significativo. DMS Desvio Mínimo Significativo. CV Coeficiente de Variação. Tabela 2 Valores médios obtidos para viabilidade celular, índice de brotamentos e viabilidade de brotos no final do processo fermentativo de mostos com diferentes doses de compostos fenólicos totais. Doses Viabilidade celular Brotamento Viabilidade de Brotos mg/l % 0 61,81 ABC 10,13 A 61,81 ABC ,97 A 11,39 A 87,97 A ,62 BC 10,10 A 55,62 BC ,10 C 2,88 B 41,10 C ,11 AB 3,89 B 72,11 AB Teste F 9,08** 12,48** 9,08** DMS 27,20 5,23 27,20 CV % 15,87 25,33 15,87 Letras diferentes diferem entre si segundo teste de Tukey (5%). **significativo ao nível de 1% de probabilidade. ns não significativo. DMS Desvio Mínimo Significativo. CV Coeficiente de Variação.

6 Na tabela 3 estão apresentados os valores médios obtidos para o ph, Acidez Total e Glicerol do vinho. Observou-se que não houve diferença significativa entre os valores de ph. Entretanto, o tratamento em que se utilizou 700mg/L de fenóis, promoveu aumento do teor de ácidos em 0,7g/L em relação ao tratamento em que não se adicionou fenol. Este resultado foi superior ao determinado por Montijo et al. (2014), que estudando a qualidade do vinho obtida por 5 ciclos fermentativos consecutivos, verificaram teores entre 2,2 e 3,4g/L. Considerando-se o teor de glicerol no vinho, observou-se maiores valores para os tratamentos 0 e 300mg/L. Deve-se destacar que o glicerol é produzido pela levedura com o objetivo de equilibra o balanço redox celular, sendo utilizado moléculas de glicose para isso. Assim sendo, admite-se que quanto maior a produção de glicerol, menor a de etanol (WALKER, 1998). Cabe mencionar ainda que os valores foram similares aos obtidos por Macri et al. (2014), que determinando teor de glicerol obtido em vinhos produzidos a partir de fermentação de caldo de cana clarificado com diferentes floculantes, observaram teores da ordem de 1,9%. Tabela 3 Valores médios obtidos para ph, Acidez Total e Glicerol do vinho obtido de processo fermentativo de mostos com diferentes doses de compostos fenólicos. doses ph Acidez Total Glicerol mg/l g/l H 2 SO 4 % 0 3,3 A 3,35 B 1,84 A 300 3,3 A 3,67 AB 1,76 A 500 3,2 A 3,73 AB 1,39 B 700 3,2 A 4,04 A 1,41 B 900 3,2 A 3,61 AB 1,28 B Teste F 0,32ns 6,44** 20,08** DMS 0,43 0,457 0,25 CV % 4,97 4,61 6,2 Letras diferentes diferem entre si segundo teste de Tukey (5%). **significativo ao nível de 1% de probabilidade. ns não significativo. DMS Desvio Mínimo Significativo. CV Coeficiente de Variação. 4 Conclusões Durante o processo fermentativo, a levedura é afetada quando o mosto apresenta teores de compostos fenólicos superiores a 500mg/L Referências

7 BARBOSA, J.C.; MALDONADO JUNIOR, W. Experimentação Agronômica & AgroEstat Sistema para Análises Estatísticas de Ensaios Agronômicos. FUNEP: Jaboticabal, BASSO, L. C.; BASSO, T. O.; ROCHA, S. N. Ethanol Production in Brazil: The Industrial Process and Its Impact on Yeast Fermentation. In: BERNARDES, M. A. S. Biofuel Production: Recent Development and Prospects. São Paulo: INTECH e-book, p CONAB Companhia Nacional de Abastecimento. Acompanhamento da safra brasileira - 3 Levantamento da safra de cana-de-açúcar Disponível em: < ues_-_3o_lev_-_15-16.pdf>. Acesso em: 29/03/2016. COPERSUCAR. Manual de controle químico da fabricação de açúcar. Piracicaba, CD-ROM. LEE, S.S.; ROBINSON, F.M.; WONG, H.Y. Rapid determination of yeast viability. Biotechnology Bioengineering Symposium, n.11, LIMA, U. A.; BASSO, L. C.; AMORIN, H. V. Produção de etanol. In: LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. (Ed.) São Paulo. 2001, v. 3, p MACRI, R.C.V.; COSTA, G.H.G.; MONTIJO, N.A.; SILVA, A.F.; MUTTON, M.J.R. Moringa extracts used in sugarcane juice treatment and effects on ethanolic fermentation. African Journal of Biotechnology, v.13, n.42, p , MONTIJO, N.A.; SILVA, A.F.; COSTA, G.H.G.; FERREIRA, O.E.; MUTTON, M.J.R. Yeast CA-11 fermentation in musts treated with brown and green propolis. African Journal of Microbiology, v.8, n.39, p , RAVANELI, G. C.; GARCIA, D. B.; MADALENO, L. L.; MUTTON, M. A.; STUPIELLO, J. P.; MUTON, M. J. R. Spittlebug impacts on sugarcane quality and ethanol production. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.46, n.2, WALKER, G. M. Yeast Physiology and Biotechnology. 1.ed. Wiley: Baltimore