ESTUDO DA PRODUÇÃO MICROBIANA DE ÁLCOOL UTILIZANDO GLICEROL COMO SUBSTRATO

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1 ESTUDO DA PRODUÇÃO MICROBIANA DE ÁLCOOL UTILIZANDO GLICEROL COMO SUBSTRATO 1 Regiane S. Pinheiro, Jocélia S. Mendes, 3 Jouciane S. Silva, Andrea L. O. Ferreira 1 Bolsista de Iniciação Científica PID/UFC, discente do curso de Engenharia Química Bolsista de pós-graduação ANP/UFC, discente do curso de Engenharia Química 3 Bolsista de pós-graduação FUNCAP/UFC, discente do curso de Engenharia Química Professora da Universidade Federal do Ceará 1,,3, Departamento de Engenharia Química - Campus do Pici Bloco 79 Universidade Federal do Ceará Fortaleza-CE CEP: andrea@ufc.br RESUMO O objetivo do nosso trabalho foi produzir uma fonte renovável de combustível e ao utilizar glicerol que é um subproduto indesejado da indústria do biodiesel estamos dando valor agregado a este, contribuindo assim, para o não agravamento da situação ambiental global. Realizou-se um estudo sobre diversos microrganismos produtores de álcool. Selecionaram-se apenas os capazes de utilizar glicerol como principal fonte de carbono, são eles: Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella pneumonia e Escherichia coli. Realizaram-se fermentações bateladas em mesa rotatória, utilizando condições adequadas para cada tipo de microrganismo estudado. Os produtos obtidos na fermentação foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Palavras-Chave: microrganismos, fermentação, indústria do biodiesel. INTRODUÇÃO Com o crescimento populacional aumenta também o consumo de energia, principalmente a oriunda dos derivados de petróleo, os quais não são renováveis e instáveis economicamente. Este cenário mundial tem impulsionado as universidades a pesquisarem novas fontes de energias alternativas de baixo custo, que sejam renováveis e atendam grandes demanda populacional. A produção de biocombustíveis vem crescendo e se destacando cada vez mais no mercado mundial, devido à mesma ser originada de fontes renováveis, reaproveitar resíduos industriais, serem biodegradáveis e terem queima limpa (Vicente et al., 199). Dada à disponibilidade do glicerol, preços baixos e alto grau de redução, o glicerol tornou-se ideal para a produção de compostos reduzidos através de fermentação anaeróbia. Considerando que, cada 1 kg de biodiesel produzido por transesterificação de óleos vegetais ou de gorduras animais, são gerados 1 kg de glicerol bruto (González-Pajuelo et al., ; Mu et al., ). Nosso trabalho objetiva produzir uma fonte renovável de combustível. Ao utilizar glicerol que é um subproduto indesejado da indústria do biodiesel estamos dando valor agregado a este, contribuindo assim, para o não agravamento da situação ambiental global. Para este fim, realizou-se um estudo literário sobre diversos microrganismos produtores de álcool e a partir do mesmo selecionaram-se apenas os capazes de utilizar glicerol como principal fonte de carbono. Dentre eles, três apresentaram grande potencial de conversão do glicerol a álcool, são eles: Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella pneumonia e Escherichia coli. METODOLOGIA Realizaram-se fermentações bateladas em mesa rotatória, utilizando condições adequadas para cada tipo de microrganismo estudado, para o acompanhamento da produção de álcool amostras foram retiradas em tempos predefinidos para análises dos produtos. Os produtos obtidos na fermentação foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Cultivo da Saccharomyces sp. VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 7 a 3 de julho de 9 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 A levedura foi estocada em tubos e placas de petri com ágar dextrose sabouraud (AS). O meio utilizado para inóculo contém (g/l) glicose 3; extrato de levedura 1; (NH ) SO 1; Na HPO,5; MgSO 7H O 1,; ZnSO 7H O,5. Meio fermentativo contém (g/l): extrato de levedura 5; (NH ) SO 1; KH PO,5; MgSO 7H O 1, g/l; ZnSO 7H O,5; glicerol 1% v/v (autoclavado a 11 C por 15 min). O ph dos meios foi ajustado para 5, e autoclavados a 11 C por 1 min. As fermentações foram conduzidas em mesa rotatório utilizando erlenmeyer de 5 ml, contendo 1 ml de meio, a 3 ºC e 15 rpm, amostras foram retiradas a cada hora para acompanhar o consumo de glicerol e produção de etanol. Cultivo da Klebsiella pneumoniae A bactéria foi estocada em tubos e placas de petri com ágar nutriente (AN). O meio para o inóculo contém (g/l): glicerol ; K HPO 3,3; KH PO 1,3; (NH) SO,; MgSO 7H O,; CaCl,; extrato de levedura 1; elemento traçador 1mL/L. O meio fermentativo contem (g/l): glicerol ; K HPO 3H O 3,93; KH PO 1,5; (NH) SO,; MgSO 7H O,; CaCl,; extrato de levedura 1; elemento traçador 1mL/L. O ph dos meios foram ajustados para 7, e, em seguida, autoclavados a 11 C por 1 min (Cheng et al., ) As fermentações foram conduzidas em mesa rotatório utilizando erlenmeyer de 5 ml, contendo 1 ml de meio, a ºC e rpm, amostra foram retiradas a cada hora (Ma et al., 9). Cultivo da Escherichia coli A bactéria foi estocada em tubos e placas de petri com ágar nutriente (AN). O meio para o cultivo contém (g/l): K HPO,99; MgSO,1; CaCl,99; Na HPO 5,9; NH Cl 1,1; NaCl,5; Na SeO 3,7; triptona ; glicerol 1,131. O ph dos meios foram ajustados para 7, e em seguida, autoclavados a 11 C por 1 min (Smith e Neidhardt, 193). As fermentações foram conduzidas em mesa rotatório utilizando erlenmeyer de 5 ml, contendo 1 ml de meio, a 37 ºC e rpm, amostra foram retiradas a cada hora (Gonzalez et al., ). Procedimentos analíticos A densidade ótica foi medida por espectrofotometria (Spectronic instruments/ Spectronic Genesys) a, 5 e nm respectivamente, para Saccharomyces sp., Klebsiella pneumoniae e E. coli. Os produtos obtidos e o substrato (glicerol) consumido pelos microrganismos foram analisados através da leitura das áreas nos gráficos através do cromatrograma CLAE (Waters) utilizando detector de infravermelho e coluna supelcogel C - 1H, 3cm x 7,mm (Supelco), a 3ºC, volume das amostras de 1µL, com ácido fosfórico,1 M como fase móvel a uma vazão de,5 ml/min. Saccharomyces sp. 11 RESULTADOS As fermentações utilizando Saccharomyces sp. 11 foram conduzidas utilizando 1% de inóculo com as condições operacionais descritas anteriormente. Através de análises realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode-se perceber que não houve resultados promissores para o objetivo deste trabalho. Devido ao baixo consumo de glicerol e a baixíssima produção de etanol. Acredita-se que a baixa produção de etanol possa ser conseqüência dos resíduos existentes no glicerol oriundo da indústria do biodiesel. Para analisarmos este resultado, foi realizado um ensaio onde utilizou-se glicerol p.a. para efeito comparativo. Neste ensaio foi constatado que a baixa produção não é causada pelo glicerol proveniente da indústria de biodiesel. Acredita-se que o microrganismo necessite da fonte de carbono mais acessível. Saccharomyces sp. 13 As fermentações utilizando Saccharomyces sp. 13 foram conduzidas nas mesmas condições realizadas para Saccharomyces sp. 11.As análises tiveram resultados bem semelhantes aoencontrado para Saccharomyces sp. 11

3 Klebsiella pneumonia 39 (ATCC 95) As fermentações realizadas com Klebsiella pneumonia 39 (ATCC 95), mostraram bons resultados. Nesta fermentação utilizou 1% de inóculo com condições operacionais descritas anteriormente. Na Figura 1 podemos ver o consumo de glicerol em função do tempo e na Figura a produção de etanol em função do tempo % inoculo, 1, 1, 1% inoculo 1 1, Figura 1 - Consumo de glicerol Etanol g/l 1, 1,,,,,, Figura Produção de etanol Através da Figura 1 observa-se que entre e 5 horas o microrganismo consumiu pouco glicerol, isto se deve ao período de adaptação do mesmo. Entre 5 a 1 horas temos a fase exponencial de crescimento do microrganismo, observando o alto consumo de glicerol. Pelo gráfico podemos observar que a produção de etanol segue o metabolismo de produção primário. Na Figura pode-se ver que em horas de fermentação temos a maior produção de etanol, cerca de 1, g/l, após horas temos um queda na curva de produção. Essa queda pode ocorre devido à falta de glicerol já que em torno de horas o mesmo teve uma queda brusca em sua curva. Para uma melhor produção de etanol seria mais adequada uma configuração do biorreator batelada alimentada, que garantiria o fornecimento de fonte de carbono para o meio, não deixando cair à produção. É interessante industrialmente que o biorreator seja operado dentro das condições experimentais observadas no período de 5 a 1 horas de fermentação, etapa onde houve maior produção de etanol. Estudaremos posteriormente o decaimento da curva após horas de fermentação, avaliando uma possível inibição pelo substrato. Na Figura 3 temos a curva de consumo de glicerol em função do tempo, com as condições experimentais descrita anteriormente modificando a quantidade de inóculo, onde se utilizou 1%. Na Figura temos a curva de produção de etanol em função do tempo. 1 1, 1 1% inoculo 1, 1, 1% inoculo Etanol (g/l) 1,,,, Figura 3 Consumo de glicerol Figura Produção de etanol Observa-se através da Figura 3 que após decorrido 3 horas de fermentação há uma redução significativa da concentração do glicerol e que após 7 horas sua concentração permanece constante. Esse consumo acelerado comparado com o da Figura 1 deve-se ao fato de que nessa fermentação a quantidade de inóculo é 1 vezes maior, o que aumenta o consumo de glicerol, já na Figura observa-se que o

4 aumento da quantidade de inóculo não foi significativo para a produção de etanol, visto que a produção continuou em aproximadamente de 1, g/l. A diferença que houve quando se aumentou a quantidade de inóculo, foi o tempo para atingir a produção máxima. Na fermentação com 1% de inóculo esse tempo foi com horas, já na fermentação utilizando 1% de inóculo foi com 5 horas. Optamos por trabalhar com 1% de inóculo visto que a diferença não é significativa, e o objetivo proposto inicialmente era verificar os efeitos de diferentes microrganismos na produção de etanol, ensaios mais sistemáticos serão realizados para verificar o efeito do inóculo na produtividade. Uma vez que a produtividade é um parâmetro importantíssimo para concepção de uma produção industrial. Cultivo da Escherichia coli As fermentações realizadas com escherichia coli mostraram bons resultados. Usou-se apenas 1% de inóculo nessas fermentações, com as condições operacionais descritas anteriormente. Na Figura 5 pode-se visualizar o consumo de glicerol em função do tempo e na Figura a produção de etanol em função do tempo. 1,1 1% inóculo,1,1 1% inóculo Etanol (g/l),1,,,,, , 1 Figura 5 Consumo glicerol Escherichia coli. Figura Produção etanol Escherichia coli Através da Figura 5 pode-se observar o decaimento da curva de glicerol indicando que o mesmo foi completamente consumido pelo microrganismo testado. Na Figura temos a curva de produção do etanol, na qual se vê que a bactéria estudada é satisfatória para o nosso trabalho, devido a mesma ter produzido cerca de,1 g/l de etanol em 7 horas de fermentação. CONCLUSÃO Realizaram-se fermentações bateladas em mesa rotatória, utilizando condições adequadas para cada tipo de microrganismo estudado. Para o acompanhamento da produção de álcool amostras foram retiradas em tempos predefinidos para análises dos produtos, os microorganismos: Saccharomyces sp. 11 e Saccharomyces sp. 13 não produziram quantidade apreciáveis de etanol a partir do consumo de glicerol. Já as bactérias Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli apresentaram uma boa produção de etanol a partir de glicerol chegando a produzir respectivamente, 1, g/l de etanol em 5 horas de fermentação e,1 g/l de etanol em 7 horas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CHENG, K. K., LIU, D. H., SUN, Y., & LIU, W. B. 1,3-Propanediol production by Klebsiella pneumoniae under different aeration strategies. Biotechnology Letters., ,.

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