INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO NA FERMENTAÇÃO DE XILOSE POR DUAS LINHAGENS DE LEVEDURAS

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1 26 a 29 de novembro de 2013 Campus de Palmas INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO NA FERMENTAÇÃO DE XILOSE POR DUAS LINHAGENS DE LEVEDURAS NASCIMENTO, Nayara Glenya Sousa 1 ; CARREIRO, Solange Cristina 2 Nayara Glenya Sousa Nascimento 1 ; Solange Cristina Carreiro 2 1 Aluna do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; nayaraglenya@uft.edu.br PIBIC/CNPq 2 Orientadora do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; solange@uft.edu.br RESUMO Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de duas linhagens de leveduras isoladas de exsudato e madeira em decomposição para fermentar xilose em diferentes condições de cultivo. Para isto, foram realizados testes fermentativos, onde se variou a concentração de xilose, agitação e temperatura. As linhagens foram reativadas em Agar Sabouraud- glicose pela técnica de estriamento, a 28 ºC por 48 horas. Com relação a produção de biomassa, apenas a linhagem LAG 630 apresentou aumento de biomassa após 96 horas de fermentação a 150 rpm nas duas temperaturas. Esses dados indicam que a xilose consumida não foi convertida em células na maioria das condições de fermentação utilizadas. No entanto houve consumo de xilose, uma vez que as dosagens de açúcares redutores ao longo do período de fermentação variaram, sendo consumida de 95% e 98% de xilose. Isso indica que ao invés de produzir etanol as linhagens podem ter tomado outra via bioquímica, produzindo, por exemplo, xilitol. Palavras-chave: Fermentação; leveduras; xilose; exsudato. INTRODUÇÃO Leveduras são fungos que ao menos numa parte de seus ciclos vitais se apresentam como unicelulares. São desprovidas de clorofila e apresentam parede celular rígida. São largamente encontradas na natureza em habitats diversos,

2 como solo, plantas e animais, dentre outros. Elas são boas biotransformadoras, incluindo a fermentação de açúcares. A atual tecnologia industrial utiliza carboidratos de determinadas culturas como milho, trigo, batata, beterraba, sorgo, cana-de-açúcar e mandioca para a produção de etanol (Kim e Dale 2005)Os polissacarídeos presentes em materiais lignocelulósicos, como a celulose e a hemicelulose, são de grande interesse como matérias-primas para a produção de etanol de segunda geração, devido á sua grande disponibilidade, riqueza em açucares e, principalmente, porque eles não afetam as áreas de cultivo de alimentos. No entanto, enquanto as tecnologias para a produção de etanol a partir de açúcar ou amido são bem estabelecidas, as tecnologias para a produção de bioetanol a partir de biomassa lignocelulósica ainda estão em desenvolvimento em todo o mundo (Mussatto e Roberto 2004). Dessa forma, a conversão eficiente da biomassa a etanol implica na utilização de linhagens microbianas capazes de fermentar não somente glicose, mas todos os açúcares presentes em hidrolisados lignocelulósicos, tais como xilose, arabinose, celobiose, galactose e manose, com alto rendimento e produtividade em etanol (Van Maris et al. 2006; Hahn-Hagerdal et al. 2007). Com o objetivo de ampliar os conhecimentos sobre a produção biotecnológica de etanol, o presente trabalho realizou um estudo sobre a influência das condições de cultivo (agitação e temperatura) e da concentração de xilose na fermentação de xilose por duas leveduras. MATERIAL E MÉTODOS Linhagens: Foram utilizadas as linhagens LAG 630 (LAMBIO) isolada de exsudato e Scheffersomyces (Pichia) stipitis UFMG-IMH 43.2 (LAMA) isolada de madeira em decomposição. Ensaios fermentativos: as linhagens foram previamente cultivadas em um erlenmeyer com 100 ml de meio contendo 0,67% de Yeast Nitrogen Base (YNB) e 2% de xilose, incubadas em agitador horizontal a 150 rpm e 28ºC por 48 h. Os ensaios de fermentação foram conduzidos em frascos erlenmeyers contendo 300 ml de meio contendo 0,5% de extrato de levedura, 2% de peptona, 0,05% de KH 2 PO 4, 0,05% (NH 4 ) 2 SO 4, 0,05% de MgSO 4.7H 2 O. A concentração de xilose utilizada foi de 2% e 5%, os frascos foram inoculados com 5% v/v (30 ml) de inóculo correspondendo a 1 unidade de densidades ótica (OD) a 600 e incubados por 120 horas em agitador horizontal sob temperatura de

3 28 ºC e rotação de 150 rpm. Foram colhidas amostras a cada 24 horas até o final do ensaio. As amostras coletadas foram estocadas a 20 ºC para as análises posteriores. Determinação de biomassa: 1mL de cada amostra (em duplicata) foi colocado em uma placa de Petri tarada e pesado; em seguida a placa foi mantida em estufa a 60 C até atingir peso constante. Dosagem de etanol: cada amostra foi destilada por arraste de vapor em um microdestilador e o teor de etanol foi determinado pelo Método de Determinação de Etanol por Oxidação Crômica. As leituras foram feitas a uma frequência de 600nm e os valores obtidos foram substituídos na fórmula obtida pela curva de calibração do dicromato de potássio (GUYMON e CROWELL, 1959). Todas as análises foram feitas em duplicata. Determinação dos açúcares redutores totais: a dosagem de xilose foi baseada na medida de ART, através da metodologia do DNS (ácido 3,5 dinitrossalicílico), segundo Miller (1959). As leituras serão realizadas em espectrofotômetro com absorbância de 540 nm. Todas as análises serão feitas em duplicata. RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste de fermentação em que se variou a temperatura, agitação e concentração de xilose, para as duas linhagens estudadas (LAG 630 e UFMG-IMH 43.1), não houve produção de etanol, em nenhuma das condições estudadas (temperaturas de 28 ºC e 35 ºC e agitação de 150 rpm e 250 rpm e concentração de 2% e 5 % de xilose). No entanto houve consumo de xilose, uma vez que as dosagens de açúcares redutores ao longo do período de fermentação variaram, tendo sido consumindo de 95% e 98% de xilose. Isso indica que ao invés de produzir etanol as linhagens podem ter tomado outra via bioquímica produzindo, por exemplo, xilitol. As tabelas 1 e 2 apresentam o valor residual de xilose (concentração de xilose), e a concentração celular em função do tempo, agitação, concentração de xilose e temperatura, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, nota-se que as leveduras não conseguiram metabolizar o açúcar (xilose) a etanol de acordo com as condições de cultivo estudadas. Iisto nos mostra que a conversão de xilose a etanol é ainda algo muito complexo, visto

4 que estudos sobre este tema apontam que na maioria das vezes se estudam as leveduras para se descobrir se as mesmas tem tal capacidade e os resultados são muito pequenos. Araújo (2011) estudou 289 leveduras, sendo 170 linhagens isoladas a partir de polpas de frutas e 119 linhagens isoladas de exsudato vegetal. Das leveduras estudadas apenas três fermentaram xilose (2,5%), sendo que as mesmas são provenientes de exsudato. Segundo Van Maris et al., (2006) apenas um pequeno número de leveduras assimiladoras de xilose é capaz de fermentar essa pentose a etanol.a conversão de xilose a etanol não é uma característica amplamente difundida dentre as leveduras. Com relação à produção de biomassa, apenas a linhagem LAG 630 apresentou aumento de biomassa após 96 horas de fermentação a 150 rpm nas duas temperaturas. Esses dados indicam que a xilose consumida não foi convertida em células na maioria das condições de fermentação utilizadas. Tabela 1. Concentração de xilose em função do tempo variando as condições estudadas. % Xilose Rpm C Concentração de Xilose (g/l) (h) LAG ,31 5,22 1,53 LAG ,90 4,90 1,50 IMH ,10 4,10 0,88 IMH ,92 4,15 0,85 LAG ,43 5,55 1,67 LAG ,11 5,43 1,70 IMH ,35 4,93 0,97 IMH ,19 4,76 0,90 Tabela 2. Concentração celular em função do tempo variando as condições estudadas. % Xilose Rpm C Concentração Celular (g/l) (h) LAG ,061 0,062 0,063 0,064 LAG ,062 0,063 0,0638 0,064 IMH ,058 0,060 0,062 0,063

5 IMH ,060 0, ,064 LAG ,064 0,0645 0,0705 0,138 LAG ,064 0,065 0,0706 0,14 IMH ,059 0,060 0,061 0,0621 IMH ,060 0,061 0,062 0,0629 LITERATURA CITADA AGBOGBOFK, COWARD-KELLY G (2008). Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeasts, Pichia stipitis. Biotechnology letters 30: ARAÚJO, J.A. Seleção de linhagens de leveduras fermentadoras de xilose para produção de etanol. (2011). Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Tocantins, Palmas GUYMON JF, CROWELL EA (1959) The chemical determination of alcohol in wines and stillage by dichromate. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 42:393-8 KIM S, DALE BE (2005). Life cycle assessment of various cropping systems utilized for producing biofuels: bioethanol and biodiesel, Biomass Bioener 29: MUSSATTO SI, ROBERTO IC (2004). Alternatives for detoxification of dilutedacid lignocellulosic hydrolysates for use in fermentative processes a review.bioresource technology 93:1-10. VAN MARIS AJA, Abbott DA, Bellissimi E, VAN DEN BRINK J, KUYPER M, LUTTIK AH, WISSELINK HW, SCHEFFERS WA, VAN DIJKEN JP, PRONK JT (2006). Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Anton Van Leeuwenh 90: AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"