TOLERÂNCIA A INIBIDORES E ALTO TEOR DE SÓLIDOS POR LEVEDURAS NA PRODUÇÃO DE ETANOL DE 2ª GERAÇÃO

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1 TOLERÂNCIA A INIBIDORES E ALTO TEOR DE SÓLIDOS POR LEVEDURAS NA PRODUÇÃO DE ETANOL DE 2ª GERAÇÃO T. D. MENDES 1, C. M. M. MACHADO 1, T. F. PACHECO 1, D. S. RODRIGUES 1, K. SMART 2 1 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Agroenergia 2 Departament of Food Sciences University of Nottingham (UK) para contato: cristina.machado@embrapa.br RESUMO A maior parte dos métodos de pré-tratamento da lignocelulose para produção de hidrolisados e posterior fermentação a etanol produz grande número de produtos paralelos que afetam significativamente o crescimento das leveduras reduzindo a concentração final de etanol. Dessa forma, a busca de leveduras mais resistentes e o entendimento dos mecanismos da tolerância ao estresse sob as diversas condições a que eles são submetidos durante a fermentação alcoólica de hidrolisados hemicelulósicos é fundamental. Portanto, nesse trabalho cepas comerciais de Saccharomyces cerevisiae (CAT1; NCYC 2592) e Candida succiphila (NCYC 1403) e cepas de S. cerevisiae selecionadas do programa de melhoramento de leveduras da Universidade de Nottingham (C02 e D06) foram avaliadas em placas de petri pela técnica de spot plate, contendo hidrolisado de palha de trigo ou meio sintético com formulação equivalente, em concentrações crescentes de ácido ferúlico e açúcar, com e sem adição de fonte suplementar de nitrogênio (YNB). Observou-se que o ácido ferúlico reduz a taxa de crescimento das leveduras em concentrações acima de 0,25 mm especialmente para a Candida succiphila e que a ausência de nitrogênio suplementar no hidrolisado de palha de trigo também afeta negativamente seu crescimento. Nos testes com concentração crescente de açúcar observou-se que o crescimento das cepas testadas não foi afetado até um nível inicial de 16% de glucose. 1. INTRODUÇÃO Uma vez que aproximadamente 27% da energia consumida no mundo é usada para transporte e este é o setor que mais contribui à poluição ambiental (EIA, 2008), tem sido dada prioridade à pesquisa e aplicação de alternativas nesta área. O etanol surge como uma opção viável nesse contexto, sendo este o biocombustível mais produzido e utilizado no mundo. A produção atual de etanol é basicamente proveniente de fontes amiláceas e sacarinas, sendo o milho e a cana-de-açúcar, respectivamente, seus principais representantes. O primeiro respondeu por mais de 50 milhões de m³ nos Estados Unidos, enquanto o segundo por mais de 24 milhões de m³ no Brasil, totalizando 86% de todo etanol produzido em 2010 (U.S. Department of Energy). No entanto, toda essa produção correspondeu a apenas 17% do

2 consumo dos Estados Unidos e pouco mais de 2% do consumo mundial de gasolina em 2010 (U.S. Energy Information Admnistration, 2010). Para um aumento significativo da participação do etanol no mercado de combustíveis será necessária uma produção ainda mais extensiva dessas culturas, o que implicaria num uso maior de terras férteis (cada vez mais escassas) ou o desenvolvimentos novas tecnologias que possibilitem o uso de fontes lignocelulósicas como matéria prima. No entanto, a produção de etanol combustível por fermentação da mistura de açúcares resultantes da hidrólise da biomassa ainda é um desafio, com muitas oportunidades de avanço. Um dos principais problemas associados a essas matérias-primas está relacionado à rigidez estrutural conferida pela lignina, grau de acetilação da hemicelulose e o próprio grau de polimerização e cristalinidade da celulose (cujas regiões amorfas são mais facilmente hidrolisadas), que atuam como um bloqueio, impedindo o acesso das enzimas celulolíticas (SUN e CHENG, 2002). Diferentes tipos de pré-tratamento tem sido idealizados e testados para eliminar as barreiras estruturais da biomassa que prejudicam o rendimento do processo. Todos eles levam à formação de produtos inibidores cujas natureza e concentração depende do tipo de biomassa pré-tratada assim como das condições do processo temperatura, tempo, pressão, ph e catalisador usado (SUN e CHENG, 2002, KLINKE et al, 2004). O emprego de solução ácida, por exemplo, não tem a capacidade de remover a lignina, mas consegue hidrolisar quase a totalidade da hemicelulose presente na matéria-prima em açúcares solúveis (xilose, arabinose e glicose) ficando na fração sólida celulose e lignina (HSU et al., 2010, DEMIRBAS, 2008). Portanto, nesse caso, os produtos inibidores formados são principalmente aqueles relacionados à degradação da hemicelulose e, em menor grau da lignina (LARSSON et al, 2000). Assim, além da xilose, hidrolisados hemicelulósico podem conter arabinose, ácido glucorônico, ácidos acético, ferúlico e p-cumárico, em concentrações que dependem da fonte da xilana. Por exemplo, a fibra de milho contém cerca de 3% de ácido ferúlico e o farelo de trigo entre 0,5 e 1% (SAHA, 2003). Outro ponto importante a ser considerado é que os materiais lignocelulósicos quando hidrolisados disponibilizam uma fração de hexoses resultante da celulose que é facilmente fermentescível por leveduras industriais como Saccharomyces cerevisiae, e uma fração de pentoses (xilose e arabinose), provenientes da hidrólise da hemicelulose, carboidratos estes não diretamente fermentescíveis à etanol, sendo este um dos desafios mais importantes a resolver no âmbito científico e tecnológico (JEFFRIES & JIN, 2004). Também, muitos dos hidrolisados lignocelulósicos são deficientes em nitrogênio. Este componente é de grande importância para o crescimento, multiplicação das células e influencia na tolerância das leveduras ao etanol produzido e para uma boa fermentação o nitrogênio disponível na forma de nitrogênio amino livre (FAN) deve estar em uma concentração de mg/l (THOMAS & INGLEDEW, 1990). Dessa forma, a busca de microrganismos mais resistentes e o entendimento dos mecanismos da tolerância ao estresse sob as diversas condições a que eles são submetidos durante a fermentação alcoólica de hidrolisados hemicelulósicos é fundamental. Nesse trabalho cepas de Saccharomyces cerevisiae comerciais e selecionadas do programa de melhoramento de leveduras da Universidade de Nottingham e uma cepa de Candida succiphila, conhecida por sua capacidade de fermentar pentoses foram avaliadas em placas de petri em condições aeróbicas e anaeróbicas, pela técnica de spot plate, contendo hidrolisado

3 de palha de trigo ou meio sintético com formulação equivalente, em concentrações crescentes de ácido ferúlico e açúcar, com e sem adição de fonte suplementar de nitrogênio (YNB) de forma a se avaliar sua tolerância a condições que possivelmente ocorrerão em fermentações para produção de etanol de segunda geração. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material Para a produção dos hidrolisados lignocelulósicos foi usada palha de trigo (cv. Zebedee) produzido na fazenda do campus de Sutton Bonnington da Universidade de Nottingham (Inglaterra). Na hidrólise enzimática foi utilizado um complexo enzimático comercial Cellic CTec2, da Novozymes Os microrganismos avaliados nesse trabalho foram as cepas comerciais de Saccharomyces cerevisiae (CAT1; NCYC 2592) e Candida succiphila (NCYC 1403) e as cepas de S. cerevisiae selecionadas do programa de melhoramento de leveduras da Universidade de Nottingham (C02 e D06) Métodos Preparo da biomassa: Os materiais lignocelulósicos foram secos a 70 C por 48 horas e processados em moinho de facas com granulometria máxima de 3 mm. Pré-tratamento: O material seco e moído foi pré-tratado adicionando-se ácido sulfúrico 1% (v/v) à biomassa, numa razão sólido/líquido de 1/10. Esta suspensão foi mantida por 30 minutos em autoclave a 121º C. Este material foi filtrado e o sólido foi então lavado com água, utilizando-se o dobro do volume de ácido empregado no pré-tratamento. Este material foi filtrado, e o sólido retirado deste pré-tratamento foi lavado com água (utilizando um volume equivalente a 2 vezes ao volume de solução ácida original). Uma alíquota da fração sólida de ambas as etapas foi reservada para a determinação da umidade do material em estufa de secagem a 92 C. A fração líquida foi analisada quanto ao teor de açúcares e inibidores e posteriormente descartada. Hidrólise enzimática: A fração sólida obtida do pré foram submetidos à hidrólise enzimática de 15 FPU do extrato enzimático comercial Cellic CTec2 por grama de substrato seco em tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1 M e ph 5,0 numa razão sólido/líquido de 1/12. A hidrólise foi conduzida em shaker rotativo de bancada, a 50 C e 200 rpm por 24 horas. Concentração do hidrolisado enzimático: Para execução do experimento de spot plates o hidrolisado enzimático foi concentrado em rotoevaporador a C até 1/3 do volume inicial.

4 Análise cromatográfica: O hidrolisado enzimático e o hidrolisado enzimático concentrado foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por DAVIES et al, 2011, para detecção do perfil de açúcares e inibidores formados. Spot Plates: As leveduras a serem avaliadas foram incubadas a 30 C em meio líquido YPG (extrato de levedura 1%, bacto-peptona 2%, glucose 2%) por 16 hs A partir do ajuste de OD 600 nm medida em espectrofotômetro a 1, diluições decimais seriadas foram feitas. 5 µl das diluições foram semeadas em placas de acordo com as condições descritas a seguir e incubadas a 30 C por 24 h. Foram executados dois experimentos de spot plates. No primeiro, para avaliação da influência de concentrações crescentes de açúcar em meio, as placas foram preparadas com o hidrolisado enzimático e com complementação de glicose, xilose e nitrogênio e com meio sintético com formulação equivalente nas condições detalhadas na Tabela1. No segundo experimento, para avaliação da tolerância das leveduras ao ácido ferúlico, as placas foram preparadas com o hidrolisado enzimático concentrado e com meio sintético nas condições detalhadas na Tabela 2 e incubadas em condições de aerobiose e anaerobiose. Tabela 1 Condições do meio de cultivo no experimento de avaliação da tolerância das leveduras a concentrações crescentes de açúcar Glucose Xilose Ácido acético FAN amino nitrogênio (g/l) (g/l) (g/l) livre* (mg/l) Hidrolisado ,5 0,60 8 Sintético ,5 0,60 0 Condição ,5 0, Condição , Condição , Condição , Condição , *O nitrogênio nos meios sintéticos foi adicionado via meio nitrogênio levedura base (YNB) Tabela 2 Condições do meio de cultivo no experimento de avaliação da tolerância das leveduras ao ácido ferúlico Glucose Xilose Ácido Ferúlico FAN amino nitrogênio (g/l) (g/l) (g/l) livre* (mg/l) Hidrolisado concentrado , Sintético ,124 0 Sintético , Sintético , Sintético , Sintético , *O nitrogênio nos meios sintéticos foi adicionado via meio nitrogênio levedura base (YNB)

5 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 2.1. Análises cromatográficas Os resultados das análises de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) das frações líquidas após o pré-tratamento e hidrólise enzimática, assim como o hidrolisado enzimático concentrado estão apresentados na Tabela 3. TABELA 3 Concentração de açúcares e inibidores após pré-tratamento ácido, hidrólise enzimática e concentração do hidrolisado Concentração (g/l) Após pré-tratamento Após hidrólise enzimática Após rotoevaporação arabinose 2,43 0,632 1,66 galactose 0,70 0,200 0,63 glucose 2,42 20,060 60,10 xilose 15,38 2,530 7,69 HMF 0,026 0,005 0,025 furfural 0,149 0,011 0,004 ácido ferúlico nd 0,012 0,125 ácido acético 2,273 0,604 nd ácido cumárico 0,015 0,010 0,032 Uma vez que é conduzida em condições amenas, sabe-se que não há formação de inibidores durante a hidrólise enzimática. No entanto, como pode ser observado, todos os compostos analisados foram detectados. Possivelmente, o que ocorreu é que durante a hidrólise ácida esses inibidores foram formados, mas se mantiveram dentro da estrutura do complexo de celulignina (fração sólida após o pré-tratamento). Ao ser desestruturado com a hidrólise enzimática, esses compostos foram liberados na fração líquida analisada. De qualquer forma as concentrações presentes são bastante baixas e não devem afetar a fermentação alcoólica. Com a concentração do hidrolisado, os açúcares como era de se esperar, tiveram sua concentração aumentada em 3 vezes. Já os inibidores tiveram seu teor modificado em proporções diferentes, possivelmente devido ao seu ponto de evaporação. Destaque deve ser dado ao ácido ferúlico, que atingiu uma concentração de 0,125 g/l. Esse composto é bastante tóxico havendo relatos de uma redução de 83% no rendimento em biomassa e de 64% na taxa de crescimento de leveduras quando presente em concentração de 0,2 g/l, chegando a inibição total do crescimento em concentrações acima de 0,25 g/l (SAHA, 2003; BARANOWSKI, 1980) Spot plates Na Figura 1 são apresentadas as placas do Experimento 1, onde se avaliou concentrações crescentes de açúcar em meio hidrolisado enzimático com complementação de glicose, xilose e nitrogênio e com meio sintético com formulação equivalente.

6 Pode-se observar que todas as cepas avaliadas não tiveram seu crescimento afetado pelo aumento da concentração de açúcar até os níveis testados. No entanto, o crescimento é fortemente prejudicado sem complementação de nitrogênio no meio. Também nota-se que, para todas as cepas de Saccharomyces e em especial para a Candida succiphila, o crescimento é sempre um pouco melhorado no meio sintético em comparação com o hidrolisado hemicelulósico. Esse comportamento é esperado porque no hidrolisado, além do ácido acético existem outros inibidores presentes, que embora em baixa concentração, afetam o crescimento das leveduras. Condições Hidrolisado hemicelulósico Meio sintético Cepa testada 20 g/l glucose 2,5 g/l xilose Sem adição de YNB 20 g/l glucose 2,5 g/l xilose 40 g/l glucose 5 g/l xilose 80 g/l glucose 10 g/l xilose 120 g/l glucose 15 g/l xilose 1 20 g/l xilose Figura 1. Influência de concentrações crescentes de açúcares no crescimento das cepas testadas No segundo experimento, para avaliação da tolerância das leveduras ao ácido ferúlico, as placas foram preparadas com o hidrolisado enzimático concentrado e com meio sintético, incubadas por 24 h em condições aeróbicas e anaeróbicas.

7 Observando-se a Figura 2, também aqui nota-se melhor desempenho do meio sintético com composição equivalente frente ao hidrolisado. Em condições anaeróbicas essa diferença é ainda mais significativa, tendo praticamente nenhum crescimento das cepas avaliadas no hidrolisado frente a um crescimento razoável no meio sintético. O ácido ferúlico afeta o crescimento das leveduras testadas já em concentrações baixas como 0,097 g/l especialmente em condições anaeróbicas e a C. succiphila mostrou-se a mais afetada por esse inibidor, seguida pelas cepas comerciais de S. cerevisiae. Já as duas cepas do programa de melhoramento de leveduras da Universidade de Nottingham (C02 e D06) são as que se mostraram mais tolerantes ao inibidor. Condições Aeróbico Anaeróbico Cepa testada Hidrolisado concentrado 0,124 g/l ácido ferúlico Sem adição de YNB 0,124 g/l ácido ferúlico Sem adição de YNB 0,048 g/l ácido ferúlico 0,097 g/l ácido ferúlico 0,145 g/l ácido ferúlico 0,194 g/l ácido ferúlico Figura 2. Tolerância das cepas testadas a concentrações crescentes de ácido ferúlico em condições aeróbicas e anaeróbicas

8 4. CONCLUSÕES Com esse trabalho demonstrou-se que as condições de stress a que as cepas de leveduras são submetidas em fermentações de hidrolisados lignocelulósicos trazem efeitos deletérios a seu crescimento. De modo geral as cepas de Saccharomyces cerevisiae são mais robustas comparadas à cepa de Candida succiphila avaliada, que se mostrou bastante sensível mesmo a baixas concentrações de ácido ferúlico. A ausência de suplementação de nitrogênio no hidrolisado hemicelulósico é bastante negativa ao crescimento das leveduras, sendo sua complementação um ponto importante a ser considerado na produção de etanol de segunda geração. 5. REFERÊNCIAS BARANOWSKI, J.D.; DAVIDSON, P.M.; NAGEL, C.W. ; BRANEN, A.L. Inhibition of Saccharomyces cerevisiae by naturally occurring hydroxycinnamates. Journal of Food Science, v. 45, p , DAVIES, S. M.; LINFORTH, R. S.; WILKINSON, S. J.; SMART, K. A. COOK, D. J. Rapid analysis of formic acid, acetic acid, and furfural in pretreated wheat straw hydrolysates and ethanol in a bioethanol fermentation using atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry. Biotechnology for Biofuels v. 4 p , DEMIRBAS, A. Biofuels sources, biofuel policy, biofuel economy and global biofuel projections. Energy Conversion and Management, v. 49, p , EIA - Energy Information Administration. International Energy Outlook Washington: EIA, HSU, T.; GUO, G.; CHEN, W.; HWANG, W. Effect of dilute acid pretreatment of rice straw on structural properties and enzymatic hydrolysis. Bioresource Technology, v. 101, p , JEFFRIES, T.W.; JIN, Y.S. Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology, v.63, p , 2004 KLINKE, H. B.; THOMSEN, A. B.; AHRING, B. K. Inhibition of ethanol producing yeast and bacteria by degradation products produced during pretreatment of biomass. Applied Microbiology and Biotechnology, v.63, p. 1 26, LARSSON, S.; QUINTANA-SÁINZ, A.; REIMANN, A.; NILVEBRANT, N. O.; JÖNSSON, L. J. Influence of lignocellulose-derived aromatic compounds on oxygen-limited growth and ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. (2000), Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 84, p , 2000.

9 OECD/IEA 2011 Key World Energy Statistics. Paris: OECD, SAHA, B.C. Hemicellulose bioconversion. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 30, p , SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: A review. Bioresource Technol., v. 83, p. 1-11, THOMAS, K.C.; INGLEDEW, W.M. Fuel alcohol production: effects of free amino nitrogen on fermentation of very-high-gravity wheat mashes. Applied Environmental Microbiology, v. 56, p , 1990.