APLICAÇÃO DO PLANEJAMENTO FATORIAL 2 4 NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

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1 275 ISSN APLICAÇÃO DO PLANEJAMENTO FATORIAL 2 4 NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR David Albuquerque Lima 1 e Ester Ribeiro Gouveia 2 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de quatro variáveis sobre a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar, simulando a mudança de temperatura e de agitação que ocorrem na sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), após inoculação da levedura, bem como o efeito da presença de etanol e do número de etapas de adição das enzimas. Foi aplicado um planejamento fatorial 2 4 com os seguintes fatores e níveis: temperatura (50 e 37ºC), agitação (150 e 80 rpm), concentração de etanol (0 e 1% V/V) e número de etapas de adição das enzimas (uma ou duas etapas). Os experimentos foram realizados em frascos contendo: celulases (15 FPU/g celulose), -glucosidase (10 % V/V), tampão de citrato de sódio (ph 4,8) e bagaço de cana-de-açúcar deslignificado (2 %). Após o tratamento dos dados, dentre os quatro fatores investigados apenas o número de etapas de adição das enzimas foi significativo e isto só ocorreu na sacarificação. Palavras-chave: Planejamento factorial, celulases, -glucosidase, bagaço de cana-de-açúcar APPLICATION OF A FACTORIAL DESIGN IN THE ENZYMATIC HYDROLYSIS OF SUGARCANE BAGASSE ABSTRACT The objective of this study is to evaluate the effects of four factors on the enzymatic hydrolysis in order to simulate the conditions used in simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of sugarcane bagasse for ethanol production. We have applied a factorial design 2 4 with the following factors and levels: temperature (50 and 37 degrees), agitation (150 and 80 rpm), ethanol concentration (0 and 1% V / V) and number of steps of adding enzymes (1 and 2). The experiments were performed in flasks with: cellulase (15 FPU / g cellulose) and -glucosidase (5% v / v) sodium citrate buffer (ph 4.8) and bagasse (2% w / v). After the statistical analysis of the four factors, only the number of steps for the addition of enzymes was significant as to the speed of enzymatic hydrolysis, not to mention the negative effect created by reducing its speed. Keywords: fatorial design. celulases. -glucosidase. sugarcane bagasse. Protocolo de 07/12/ Graduando do curso de Biomedicina na Universidade Federal de Pernambuco; estagiário de iniciação científica no laboratório de Processos Biotecnológicos da Universidade Federal de Pernambuco; davidalima_@hotmail.com. 2 Doutorado em Engenharia Química pela Universidade Federal de São Carlos; Mestrado em Engenharia Química pela Universidade Federal de Pernambuco; atua como professor adjunto III e pesquisadora da Universidade Federal de Pernambuco, na área de biotecnologia; estergouveia@gmail.com

2 276 Aplicação do planejamento fatorial 2 4 na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Lima & Gouveia INTRODUÇÃO A hidrólise do bagaço de cana-deaçúcar é necessária para a conversão dos polissacarídeos em açúcares fermentescíveis, para posterior fermentação e produção de etanol (Martin et al., 2006). A hidrólise enzimática desses materiais é conduzida por celulases onde os maiores grupos de celulases envolvidas no processo de hidrólise são: endoglucanases e exoglucanases (Sun & Cheng, 2002). As celulases quebram a celulose em celobiose que é subsequentemente clivada à glicose pela betaglucosidase (Palmqvist & Hahn-Hãgerdal, 2000). Em contraste com a hidrólise ácida, a hidrólise enzimática é conduzida em condições amenas de ph e de temperatura (ph igual a 4,8 e temperatura entre 45 e 50 C) e não apresenta problemas de corrosão; entretanto, para que seja eficiente é necessário, primeiro, submeter o material lignocelulósico a um pretratamento, para disponibilizar a celulose ao ataque enzimático. A concentração de substrato é um dos fatores que afetam a produção e a taxa inicial de hidrólise enzimática da celulose (Sun & Cheng, 2002). Altas concentrações de substrato podem causar inibição pelo produto formado uma vez que a atividade da celulase é inibida pela celobiose e a da -glucosidase pela glicose (Philippidis et al., 1993). Uma alternativa à inibição enzimática pelo produto final diz respeito à realização da hidrólise enzimática junto com a fermentação, que é chamada Sacarificação e Fermentação Simultâneas SSF (Olofsson et al., 2008; Sun & Cheng, 2002). A sacarificação e também a fermentação simultâneas, constituem a hidrólise enzimática e a fermentação que ocorrem ao mesmo tempo e no mesmo recipiente. As enzimas hidrolisam os polissacarídeos a açúcares que são imediatamente consumidos pela levedura para a produção de etanol (Wilkins et al., 2007) evitando, desta forma, a inibição enzimática pelo produto final. Isto representa a principal vantagem deste processo (Olofsson et al., 2008). Um processo em SSF requer uma condição intermediária de temperatura para as enzimas e para a levedura adicionada, uma vez que a temperatura ótima para a sacarificação é cerca de 55º C e para a fermentação é 30º C (Martin et al., 2008) além de uma condição intermediária de agitação visto que a fermentação alcoólica ocorre em condições de limitação de oxigênio enquanto a sacarificação é realizada, geralmente, a 150 rpm (Adsul et al., 2005). Ainda de acordo com (Chen & Jin 2006) concentrações de etanol entre 1 e 7% podem inibir a hidrólise enzimática. O objetivo deste trabalho foi verificar a influência da mudança da temperatura e da agitação sobre a hidrólise enzimática simulando um experimento de SSF. Além de que também se verificou, neste trabalho, se o etanol, numa concentração de 1% V/V, inibiria a hidrólise enzimática e se as enzimas devem, na verdade, ser adicionadas em uma ou duas etapas, isto é, apenas no início da pré-sacarificação ou também após a pré-sacarificação. MATERIAL E MÉTODOS Bagaço de cana-de-açúcar Foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar pretratado por explosão a vapor na Usina Vale do Rosário, em São Paulo, e gentilmente cedido pelo Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena (Universidade de São Paulo) o qual foi deslignificado por Oliveira e Gouveia (2011). O material deslignificado continha 64,79 % de celulose, 13,72 % de hemicelulose e 11,88 % de lignina caracterizado, segundo a metodologia validada para bagaço de cana-de-açúcar, por Gouveia et al. (2009). Hidrólises enzimáticas As preparações comerciais de celulases (Celluclast 1.5L) e -glucosidase (Novozym 188) ambas da Novozyme A/S, Bagsværd, Dinamarca, foram cedidas pelo Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP). As atividades enzimáticas da Celluclast 1.5L (42.4 FPU/mL and 21.1 CBU/mL) e da β-glucosidase (13.4x10 2 CBU/mL) foram determinadas de acordo com o método descrito por Ghose (1987) em que FPU é Unidade de Papel de Filtro (liberação de 2 mg de glicose durante a reação enzimática) e CBU é Unidade de Celobiose (liberação de 1 mg de glicose durante a reação enzimática). As hidrólises foram realizadas em frascos de Erlenmeyers de 250 ml, com 2 g de bagaço pretratado e deslignificado, 100 ml de tampão de citrato de sódio (50 mm; ph 4,8) e as preparações comerciais de celulases (15 FPU/g

3 Aplicação do planejamento fatorial 2 4 na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Lima & Gouveia 277 celulose) e β-glucosidase (10 % do volume de Celluclast adicionado). As enzimas foram adicionadas em uma ou duas etapas, isto é, 1/3 de celulases no início e 2/3 após 6 horas. Nas primeiras 6 horas a temperatura e a agitação foram 50º C e 150 rpm, respectivamente. A Tabela 1 apresenta os fatores e os níveis do planejamento fatorial 2 4. A conversão de celulose em glicose durante as hidrólises enzimáticas foi calculada conforme a equação a seguir: Conversão (%) em que: Glicose HE 0,9 Carga sólidos Celulose Sólido 100 Glicose HE : concentração de glicose no hidrolisado enzimático, g/l; 0.9: fator considerando-se a razão de massa molecular entre a glicose anidra contida na celulose e a glicose livre; Carga de sólidos: concentração da biomassa lignocelulósica no experimento, g/l; Celulose Sólido : teor de celulose na biomassa lignocelulósica, %. Tabela 1. Fatores e níveis do planejamento fatorial 2 4 Níveis FATORES - + A - Enzimas (nº etapas) 1 2 B - Etanol (%) 0 1 C - Temperatura (ºC) D - Agitação (rpm) Quantificação de glicose e de etanol Glicose e etanol foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência em um cromatógrafo da Agilent (HP 1100). As condições de análise foram as seguintes: coluna Aminex HPX-87H + ; fase móvel: H 2 SO 4 5 mm, 0,6 ml/min, 50 C e detector de índice de refração. Sacarificação e fermentação simultâneas Foi utilizada uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238, cedida pela Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil. Esta cultura foi mantida no meio contendo (em g/l): glicose (20), extrato de levedura (5), peptona (3) e ágar (15) em ph 7,0. O meio de cultura do inóculo foi o mesmo utilizado para manutenção porém sem adição de ágar; após 12 h de cultivo a 30 0 C e 250 rpm, a suspensão de células foi filtrada em membrana de diâmetro de poro igual a 0,45 m. O filtrado foi descartado e a biomassa microbiana foi ressuspensa em 10 ml de água estéril a qual foi transferida para um erlenmeyer de 250 ml contendo 90 ml de meio de fermentação. Sacarificação e fermentação simultâneas foram realizadas em Erlenmeyers de 250 ml. Cada frasco continha 90 ml de meio de fermentação (com os nutrientes dissolvidos em tampão citrato de sódio a 50 mm e ph 4,8 - (NH4) 2 SO 4 ; 2 g/l; KH 2 PO 4 ; 2 g/l; MgSO 4.7H 2 O; 0,75 g/l; extrato de levedura; 4 g/l) e 2 g de bagaço deslignificado. Os frascos foram incubados em uma mesa agitadora a 50 C e 150 rpm; após 6 horas cada frasco foi inoculado com a suspensão microbiana e incubado a 37ºC e 80 rpm. A concentração inicial de biomassa foi 1 g/l após a inoculação. Os experimentos foram realizados em duplicata. Análise de variância Análises de variância (Callegari-Jacques 2003) foram realizadas para, através delas, se avaliar a significância estatística utilizando-se o programa Origin 6.0 e se considerando 95% de confiança. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nos ensaios realizados com a aplicação do planejamento fatorial a concentração de glicose variou de 5,6 g/l a 8,4 g/l; a partir dos valores de concentração de glicose, foram calculadas as velocidades iniciais; as equações da reta apresentaram bom ajuste com coeficientes de correlação (R 2 ) maiores que 0,940; a conversão de celulose alcançada com apenas 12 horas variou de 42 a 63 %; a Tabela 2 apresenta a velocidade inicial (v 0 ) e a conversão de celulose obtida em cada ensaio do planejamento fatorial 2 4. Os efeitos dos quatro fatores (nº de etapas de adição das enzimas - A, presença ou ausência de etanol - B, temperatura - C e agitação - D) sobre a velocidade inicial e a conversão de celulose em glicose obtidas em cada um dos 16 ensaios do planejamento, foram

4 278 Aplicação do planejamento fatorial 2 4 na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Lima & Gouveia analisados no Statistica 6.0 enquanto as Tabelas 3 e 4 apresentam os valores encontrados, com seus respectivos erros. Tabela 2. Velocidade inicial e conversão em cada ensaio do planejamento fatorial 2 4. Ensaio A B C D v 0 (g/l.h) Conversão (%) , , , , , , , , , , , , , , , ,55 42 Os valores dos efeitos dos fatores sobre a velocidade inicial foram relativamente pequenos tal como, também, os efeitos sobre os valores de conversão sendo a adição das enzimas em uma ou em duas etapas, o único efeito significativo (valor em negrito nas Tabelas 3 e 4). Como este fator apresenta um efeito negativo (- 0,297 e -8,250) sobre a velocidade inicial e a conversão, a adição das enzimas em duas etapas diminui tanto a velocidade quanto a conversão; entretanto, o efeito do número de etapas de adição das enzimas foi maior sobre a conversão do que sobre a velocidade inicial. A presença de etanol numa concentração de 1 % não apresentou efeito significativo sobre a velocidade da hidrólise, o que é importante em um processo em SSF, em que a produção de etanol é simultânea à hidrólise; da mesma forma, a redução da temperatura e da agitação durante a hidrólise enzimática também não foi significativa; logo, a temperatura e a agitação ótimas em SSF serão determinadas pelas condições mais favoráveis para a fermentação de vez que a redução dessas variáveis não influenciou a velocidade inicial da hidrólise nem a conversão. Tabela 3. Efeitos do planejamento fatorial sobre a velocidade inicial. Efeito Valor ± erro Média 0,718 ± 0,019 A - 0,297 ± 0,038 B 0,017 ± 0,038 C 0,037 ± 0,038 D 0,028 ± 0,038 AB 0,031 ± 0,038 AC 0,006 ± 0,038 AD 0,094 ± 0,038 BC 0,023 ± 0,038 BD 0,000 ± 0,038 CD 0,058 ± 0,038 Tabela 4. Efeitos do planejamento fatorial sobre a conversão de celulose. Efeito Valor ± erro Média 49,875 ± 1,51 A -8,250 ± 3,02 B -0,500 ± 3,02 C 0,250 ± 3,02 D 1,500 ± 3,02 AB 1,000 ± 3,02 AC 0,250 ± 3,02 AD 2,000 ± 3,02 BC 4,000 ± 3,02 BD 4,250 ± 3,02 CD -1,000 ± 3,02 As SSF foram realizadas nas condições dos ensaios 15 e 16 do planejamento fatorial, no qual a única diferença entre eles foi a adição das enzimas. Amostras foram retiradas de 4 em 4 horas, sendo que o tempo de 0 hora é exatamente após as 6 horas de sacarificação; as concentrações de glicose e de etanol, obtidas durante a SSF, são apresentadas na Figura 1.

5 Aplicação do planejamento fatorial 2 4 na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Lima & Gouveia 279 Figura 1. Concentração de glicose e de etanol durante a SSF. A análise de variância da produção de etanol foi realizada em cada tempo e apenas com 8 horas os resultados utilizando uma ou duas etapas de adição das enzimas, foram significativamente diferentes (F = 66,2175; α= 0,05) sinal de que a adição das enzimas em duas etapas provoca efeito negativo na conversão apenas no início do processo uma vez que a produção máxima é obtida com 24 horas, independente do número de etapas. CONCLUSÕES O processo de sacarificação e da fermentação simultâneas (SSF) do bagaço de cana-de-açúcar, pode ser realizado com 6 horas de pressacarificação reduzindo não apenas a temperatura mas também a agitação, sem que haja um efeito negativo sobre a hidrólise. A produção de etanol de até 10 g/l também não influencia na hidrólise enzimática. As enzimas podem ser adicionadas em uma única etapa pois a produção máxima de etanol foi obtida com 24 horas, mesmo quando as enzimas foram adicionadas em duas etapas indicando que as enzimas não perdem a atividade após o resfriamento, no momento da inoculação da levedura. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adsul, M.G.; Ghuleb, J.E.; Singhb, R.; Shaikhb, H. (2005). Polysaccharides from bagasse: applications in cellulase and xylanase production. Carbohydr. Polym., 57, Callegari-Jacques, S. M. (2003). Bioestatística: princípios e aplicações. 1ª edição. Artmed Editora SA. Porto Alegre, Brasil. Gouveia, E.R.; Nascimento, R.T.; Souto-Maior, A.M.; Rocha, G.J.M., Validation of methodology for the chemical characterization of sugar cane bagasse. Quim. Nova. v.32, n.6, , Ghose, T. K., Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem. v.59, n.2, p , Hongzhang C.; Shengying J. (2006). Effect of ethanol and yeast on cellulose activity and hydrolysis of crystalline cellulose. Enzym. Microb. Technol., 39, Martín, C.; Marcet, M.; Almazán, O.; Jönsson, L.J. (2006). Adaptation of a recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strain to a sugarcane bagasse hydrolysate with high content of fermentation inhibitors. Bioresour. Technol., 98, Martin, C.; Marcet, M.; Thomsen, A.B. (2008). Comparison between wet oxidation and steam explosion as pretreatment methods for enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. Bioresour. Technol., 3, Olofsson, K.; Bertilsson, M.; Lidén, G. (2008). A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks. Biotechnology for Biofuel 1 Disponível em < >. Acesso em: 02 de maio de Palmqvist, E. ; Hahn-H, B. (2000) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates II: inhibitors

6 280 Aplicação do planejamento fatorial 2 4 na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Lima & Gouveia and mechanisms of inhibition. Bioresour. Technol., v. 74, 25-33, Philippidis, G.P.; Smith, T.K.; Wyman, C.E. (1993). Study of the enzymatic hydrolysis of cellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous saccharification and fermentation process. Biot. Bioeng., 41, Sun, Y.; Cheng, J. (2002). Hidrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol., 83, Wilkins, M.R., Widmer, W.W., Grohmann, K., (2007). Simultaneous saccharification and fermentation of citrus peel waste by Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol. Process Biochem. 42,