ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO TIPO DE PRÉ-TRATAMENTO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
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- Victor Brandt Mendonça
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1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO TIPO DE PRÉ-TRATAMENTO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA EM MODO BATELADA ALIMENTADA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM ALTAS CONCENTRAÇÕES DE SÓLIDOS D. L. MACHADO 1, S. C. RABELO 2, R. R. de ANDRADE 3 e A. C. da COSTA 1 1 Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química 2 Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM) 3 Universidade Federal de São Paulo, Departamento de Ciências Exatas e da Terra. para contato: daniele.l.machado@gmail.com RESUMO A alta concentração de sólidos na hidrólise enzimática resulta em maiores concentrações de açúcares fermentescíveis no meio reacional. Por outro lado, muda as propriedades reológicas do meio, ocasionando problemas de transferência de massa e calor, além de aumentar a demanda energética para uma mistura eficiente. Esses problemas podem ser contornados se a hidrólise for realizada em modo batelada alimentada, o que evita acúmulo de sólidos no meio reacional. Nesse trabalho foi investigada a influência do modo operacional (batelada/batelada alimentada) e o tipo de pré-tratamento na concentração de açúcares durante a hidrólise enzimática. 1. INTRODUÇÃO Reduzir os custos do etanol produzido a partir do material lignocelulósico é crucial para permitir a sua comercialização. Um fator que impacta no custo de produção é a concentração de etanol no líquido após a fermentação. Essa deve ser tão alta quanto possível, a fim de minimizar o custo de energia requerida na destilação (Rudolf et al., 2005). Kristensen et al. (2009) afirma que o caldo da fermentação deve apresentar um mínimo de 4% (m/m) de etanol para que a energia requerida na etapa de destilação seja reduzida significantemente. Para isso, dependendo do substrato lignocelulósico, deve-se iniciar o processo de sacarificação com concentração de sólidos de aproximadamente 20% (m/m). Entretanto, há desvantagens no aumento da carga de sólidos na hidrólise enzimática, dentre elas, o aumento da concentração dos produtos finais e dos inibidores, o que leva à diminuição na funcionalidade das enzimas e dos micro-organismos fermentadores. Além disso, a elevada concentração de sólidos pode, também, causar problemas de transferência de massa, calor e consumo excessivo de energia na agitação em reatores, devido ao aumento na viscosidade do meio.
2 Em baixas concentrações de substrato (5% m/m), o rendimento da etapa de sacarificação é alto, próximo a 100% (Sun & Cheng, 2002), entretanto a concentração em etanol alcançada é baixa (< 4%). Diversos autores explicam também que o aumento na carga de sólidos diminui o rendimento da hidrólise enzimática. Isso ocorre, principalmente, devido à inibição pelo produto. Olsen et al., (2014), López-Linares et al., (2014) e Hodge et al., (2008) observaram que a inibição pelo produto é maior com o aumento na carga de sólidos e que, dentre outros fatores também observados (problemas de transferência de massa, aumento na viscosidade e diminuição do conteúdo de água), esse ainda é o efeito mais significativo sobre o rendimento. Devido aos problemas relacionados às altas concentrações de sólidos, muitos estudos abordam a hidrólise em modo batelada alimentada, onde o substrato sólido fresco é adicionado gradualmente ao meio reacional, levando à manutenção de sólidos em baixos níveis no reator. Dentre suas vantagens estão a baixa viscosidade inicial, associada à melhor difusão, pois a carga de sólidos é mantida relativamente baixa. Esse modo de operação permite que o substrato se liquefaça antes da adição de sólidos adicionais, o que mantém o nível de água livre disponível para a reação e difusão de produtos formados, os quais são potencialmente inibidores (Hoyer et al., 2010). Contudo, alguns estudos reportam que os rendimentos alcançados em modo batelada e batelada alimentada foram próximos (López-Linares et al., 2014; Rudolf et al., 2005). Assim, esse trabalho teve como objetivo avaliar o impacto do tipo de pré-tratamento e modo de operação sobre a conversão da celulose em glicose durante a hidrólise enzimática. Para isso, dois tipos de pré-tratamento foram empregados no bagaço de cana-de-açúcar: hidrotérmico e hidrotérmico seguido de deslignificação, e os modos batelada e batelada alimentada foram testados para a sacarificação, onde as concentrações finais de glicose foram determinadas. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Substrato e pré-tratamento O substrato utilizado nos ensaios foi o bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) submetido a dois tipos de pré-tratamento: hidrotérmico (BH) e ácido diluído seguido de deslignificação com NaOH (BD). O material pré-tratado foi fornecido pelo Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) Atividade enzimática Atividade celulolítica da enzima Cellic CTec2 (Novozymes) foi determinada como unidades de papel de filtro por mililitro (FPU/mL), conforme recomendado pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (Ghose (1987) e Adney e Baker (1996)). A atividade enzimática foi de 210,58 FPU/ml para celulase.
3 2.3. Hidrólise enzimática em batelada e batelada alimentada. Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados em duas configurações: hidrólise em batelada, e batelada alimentada. Nesses experimentos avaliou-se o impacto do aumento da carga de sólidos e do tipo de biomassa (lignificado ou deslignificado) na conversão da celulose em glicose durante a reação. A hidrólise enzimática dos bagaços pré-tratados foi realizada em Erlenmeyers de 500 ml, contendo 100 ml de tampão citrato 0,05 M (ph 5,0) complementado com 0,02% de azida sódica por grama de biomassa. A carga de sólidos para as hidrólises em batelada variou entre 5% e 20 % (m/m) de bagaço hidrotérmico (BH) e bagaço deslignificado com NaOH (BD). A carga enzimática de celulase foi de 15 FPU/g de BH e/ou BD, respectivamente. Os frascos foram incubados em agitador orbital (Marconi MA-832), mantido a 150 rpm e 50 ºC. As enzimas foram adicionadas após uma hora de incubação. Amostras foram coletadas do meio reacional em tempos pré-determinados para quantificação dos açúcares liberados. As hidrólises em batelada alimentada foram realizadas de duas formas distintas. A primeira (C1) foi realizada iniciando com 10% de sólidos (m/m) e, a cada 6 horas, adicionou-se solução com 30% de sólidos (m/m) até completar 18 horas. O bagaço alimentado fora pré-hidrolisado por 6 horas antes de cada alimentação, nas mesmas condições reacionais descritas anteriormente (ph, temperatura e carga enzimática), e então, o conteúdo pré-hidrolisado era alimentado no Erlenmeyer. No final das 18 horas, alcancou-se 20% de sólidos (m/m) para cada uma das hidrólises para ambos os bagaços prétratados (BH e BD). A segunda configuração (C2), em batelada alimentada, foi iniciada com 10% de sólidos (m/m), e a cada 6 horas, foram adicionados 5% m/m de bagaço descontando a umidade inicial (aproximadamente 7%) até completar 18 horas. A cada alimentação de bagaço, foi adicionada a quantidade de enzima equivalente para manter a carga enzimática do meio reacional no nível de 15 FPU de celulase/g de bagaço. No final das 18 horas, alcançaram-se 24,77% de sólidos (m/m) para a hidrólise com BH e 24,72% de sólidos para o BD. As amostras coletadas durante as reações de hidrólise enzimática foram posteriormente filtradas utilizando filtros MILLEX HV com membrana de PVDF, 0,22 μm de poro, 13 mm de diâmetro (Milipore), diluídas com tampão citrato, quando necessário e injetadas em HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) para quantificação dos açúcares. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Composição química dos bagaços pré-tratados A composição química dos bagaços pré-tratados foi determinada pelo grupo de pesquisa do Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE). A Tabela 1 detalha a
4 composição para BD e BH: Tabela 1 Composição química dos bagaços pré-tratados. Composição Química Bagaço Pré-Tratado com Ácido Diluído e Deslignificado (%) Bagaço Pré-Tratado Hidrotérmico (%) Celulose 68,44 ± 0,06 61,07 ± 0,97 Hemiceluloses 0,06 ± 0,01 2,1 ± 0,06 Lignina Total (Solúvel e Insolúvel) 11,50 ± 0,01 31,97 ± 0,047 Cinza 18,94 ± 0,52 6,44 ± 0,056 Extrativos - - Total 98,64 ± 0,61 101,58 ± 1, Hidrólise enzimática em batelada simples As hidrólises enzimáticas em batelada simples foram realizadas conforme descrito no item 2.3 para duas concentrações de sólidos, 5 e 20 % (m/m). Essas concentrações foram escolhidas para avaliar o perfil da liberação de glicose no meio reacional, bem como para avaliar a conversão dos açúcares, a fim de se analisar o efeito da carga de sólidos iniciais na sacarificação. Os bagaços prétratados BH e BD foram hidrolisados nas mesmas condições reacionais, sendo que a celulase comercial foi adicionada em tampão citrato, ph 5,0; 50 ºC e 150 rpm. A reação foi mantida por 72 horas. Pela Figura 1 (a e b) observa-se que existe diferença significativa na concentração de glicose liberada para os bagaços BH e BD, tanto para a menor concentração (5%) quanto para a maior (20%) (m/m). Para 5% de sólidos (m/m), a máxima concentração de glicose liberada foi de 18,79 ± 0,34 g/l para BH e de 25,06 ± 0,45 g/l para BD. Quando a hidrólise foi realizada para 20% de sólidos (m/m), a concentração de glicose aumentou, passando de 18,79 para 68,96 ± 2,36 g/l para BH. Já para BD, esta passou de 25,06 para 80,11 ± 0,15 g/l.
5 Concentraçao Glicose (g/l) Concentraçao Glicose (g/l) a b Tempo (Horas) BH BD Tempo (Horas) BH BD Figura 1 Perfis de glicose durante a hidrólise enzimática dos bagaços pré-tratados BH e BD. Concentração de sólidos 5 % (m/m) (a), e 20% (m/m) (b). Martins et al. (2015) também reportaram essa diferença na concentração de glicose obtida quando utilizaram bagaços lignificados e deslignificados na hidrólise enzimática. Contudo, a concentração de sólidos na hidrólise enzimática influencia no rendimento de açúcares. A conversão dos açúcares diminuiu com o aumento da concentração de sólidos. Baseando-se na concentração de glucana inicial dos bagaços pré-tratados, a conversão de glicose foi calculada para os dois bagaços. A conversão para BH diminuiu em aproximadamente 5% (55,40% ± 0,99 para 50,81% ± 1,73), mesmo tendo sido obtido 2,7 vezes a concentração de glicose para a maior concentração de sólidos. Já para o BD, aumentando-se a carga de sólidos de 5 para 20%, a conversão de glicose caiu 13,24% (65,91% ± 1,18 para 52,67% ± 0,09), sendo que sua concentração aumentou em aproximadamente 3,2 vezes. Sabe-se que a carga de sólidos é um dos fatores que mais afeta a conversão dos açúcares na hidrólise enzimática da celulose, e que a alta concentração de açúcares na etapa da hidrólise é essencial para obtenção de altas concentrações de etanol após a fermentação. Um dos caminhos para tentar mininizar os problemas é realizar a hidrólise em modo batelada alimentada (Martins et al., 2015) Hidrólise enzimática em batelada alimentada No intuito de aumentar a concentração de glicose (g/l) sem diminuir a conversão dos açúcares no processo da hidrólise enzimática para altas concentrações de sólidos, duas configurações foram propostas e realizadas para a hidrólise em modo batelada alimentada: C1 e C2, como descrito no item 2.3. Para os dois esquemas, as alimentações foram realizadas nos tempos das hidrólises de 6, 12 e 18 horas para alcançar a quantidade de sólidos de 20% (m/m) na C1, e de aproximadamente 24% (m/m) para C2. A Figura 2 mostra os perfis de concentração de glicose para as diferentes estratégias propostas, os bagaços BH e BD, e concentração de sólidos 20% m/m. Se comparado ao controle
6 Concentraçao Glicose (g/l) (hidrólise a 20% sólidos (m/m), em batelada simples), observa-se que a concentração de glicose no meio reacional aumentou para ambos os bagaços e configurações (C1 e C2) Tempo (Horas) BH BD BH* BD* BH Batelada simples BD batelada simples Figura 2 Influência do tipo de pré-tratamento empregado na hidrólise enzimática nas diferentes configurações. BH* e BD*, à hidrólise dos bagaços hidrotérmico e deslignificado pela configuração C1 e BH e BD correspondem aos bagaços na configuração C2. O aumento da concentração de glicose liberada no meio reacional e a conversão podem ser melhor observados na Tabela 2. As configurações propostas para a batelada alimentada resultaram em um aumento na concentração final de glicose para ambos os bagaços. Entretanto, o bagaço deslignificado foi o que se destacou, liberando até 92,67 ± 0,05 g/l de glicose ao final de 72 horas de reação, um ganho de 12 g/l se comparado com a batelada simples a 20 %. Já para o BH, a diferença entre as configurações não foi tão pronunciada. O maior aumento foi para a hidrólise realizada em C2 (batelada alimentada), com uma diferença de aproximadamente 9g/L em glicose. Os resultados em concentração de glicose foram sempre maiores na configuração C2 porque, como o bagaço foi alimentado com baixo teor de umidade, foi possível atingir uma concentração de sólidos 4% mais alta do que na configuração C1. Mas deve-se notar que a conversão foi mais alta na configuração C1, em que o bagaço foi pré-hidrolisado antes de ser alimentado. Esta configuração também pode ter vantagens em um processo industrial, onde a alimentação de uma solução pode ser mais fácil do que a alimentação de bagaço seco.
7 Tabela 2 Concentração de glicose e conversão da hidrólise para diferentes concentrações de sólidos. Concentração de Hidrotérmico (BH) Deslignificado (BD) sólidos Glicose (g/l) Conversão (%) Glicose (g/l) Conversão (%) 5 % (batelada) 18,79 ± 0,34 55,40 ± 0,99 25,06 ± 0,45 65,91 ± 1,18 20 % (batelada) 68,96 ± 2,36 50,81 ± 1,73 80,11 ± 0,15 52,67 ± 0,09 20 % (batelada alimentada C1) 20 % (batelada alimentada C2) 71,58 ± 0,98 52,74 ± 0,73 90,93 ± 4,07 59,79 ± 2,67 78,25 ± 0,21 42,90 ± 0,13 92,67 ± 0,05 50,63 ± 0,03 A hidrólise enzimática com o bagaço BD permitiu alcançar concentrações elevadas de glicose mesmo na concentração mais baixa de sólidos (5% m/m). Quando a hidrólise foi realizada em modo batelada alimentada, essa concentração também foi superior quando comparado para o BH. Quando se comparam as configurações batelada simples, C1 e C2 pode-se dizer que a conversão em glicose aumentou para os modos C1 e C2, destacando a configuração C1. Possivelmente a etapa de pré-hidrólise com a devida adsorção das enzimas no bagaço resultou em melhor difusão, facilitando a transferência de massa durante cada alimentação. Interessantemente, promover a hidrólise em batelada alimentada para os bagaços BH e BD não foi o suficiente para aumentar a conversão dos açúcares quando se deseja trabalhar com altas concentrações de sólidos. No entanto, pode-se destacar algumas vantagens, como por exemplo, da viscosidade inicial ser baixa, de modo que a difusão e as limitações da mistura podem ser minimizadas ou completamente evitadas, pois a manutenção da carga de sólidos é baixa. Além disso, o regime de alimentação permite que o substrato se liquefaça parcialmente antes da adição de sólidos adicionais, o que mantém um nível de água livre disponível para o processo de reação e difusão de produtos potencialmente inibidores que resultam da reação de hidrólise (Hoyer et al., 2010). 4. CONCLUSÕES A escolha do tipo de pré-tratamento do bagaço influencia na hidrólise enzimática. O bagaço deslignificado (BD) apresentou melhores e maiores conversões quando comparado com o bagaço lignificado (BH), ou seja, para obter uma mesma concentração de glicose no meio reacional seria necessário trabalhar com uma concentração de sólidos maior para o BH do que para o BD. O modo operacional batelada alimentada apresenta variações na conversão dos açúcares, e uma das variáveis é o tipo de pré-tratamento empregado na biomassa, pois para o BD as conversões foram maiores em comparação com o bagaço BH. Possivelmente, trabalhar no modo batelada alimentada para o BH seja vantajoso, caso a concentração de biomassa ao longo da reação seja menor quando comparado com uma batelada simples. Assim, o gasto energético relacionado à agitação seria menor. Os resultados apresentados neste trabalho ressaltam a importância de otimizações para a hidrólise em modo batelada alimentada, como por exemplo, o tempo e o intervalo entre as alimentações de biomassa e enzimas para que se alcance maiores conversões.
8 5. REFERÊNCIAS ADNEY, B.; BAKER, J. Chemical analysis and testing task laboratory analytical procedure. LAP-006. National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO, USA, GHOSE, T, K. Measurement of cellulase activities. Pure and Appl. Chem., v. 59, p , HODGE, D. B.; KARIM, M. N.; SCHELL, D. J.; MCMILLAN, J. D. Soluble and insoluble solids contributions to high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Bioresource Technol., v. 99, p , HOYER, K.; GALBE, M.; ZACCHI, G. Research Effects of enzyme feeding strategy on ethanol yield in fedbatch simultaneous saccharification and fermentation of spruce at high dry matter. Biotechnol. Biofuels., v. 3, nº.14, KRISTENSEN, J. B.; FELBY, C.; & JØRGENSEN, H. Yield-determining factors in high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Biotechnol. Biofuels., v. 2, p. 11, LÓPEZ-LINARES, J-C.; ROMERO, I.; CARA, C.; RUIZ, E.; MOYA, M.; CASTRO, E. Bioethanol production from rapeseed straw at high solids loading with different process configurations. Fuel, v. 122, p , MARTINS, L. H. d.s.; RABELO, S.C.; COSTA, A.C. Effects of the pretreatment method on high solids enzymatic hydrolysis and ethanol fermentation of the cellulosic fraction of sugarcane bagasse. Bioresour. Technol., v. 191, p , OLSEN, S. N.; BORCH, K.; CRUYS-BAGGER, N.; WESTH, P. The Role of Product Inhibition as a Yield- Determining Factor in Enzymatic High-Solid Hydrolysis of Pretreated Corn Stover. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 174, p , RUDOLF, A.; ALKASRAWI, M.; ZACCHI, G.; LIDEN, G. A comparison between batch and fed-batch simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated spruce. Enzyme Microb. Technol., v. 37, p , SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol., v. 83, p. 1 11, 2002.
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