HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE RESÍDUO DE ERVA-MATE CANCHEADA: PARÂMETROS OPERACIONAIS PARA A OBTENÇÃO DE GLICOSE

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1 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE RESÍDUO DE ERVA-MATE CANCHEADA: PARÂMETROS OPERACIONAIS PARA A OBTENÇÃO DE GLICOSE I.L. Silva 1, E. Skoronski 2, A.P. Kempka 1 1- Departamento de Engenharia de Alimentos e Engenharia Química Universidade do Estado de Santa Catarina, - CEP: Pinhalzinho SC Brasil, Telefone: 55 (49) (idi_lange_silva@hotmail.com, aniela.kempka@udesc.br) 2- Departamento de Engenharia Ambiental Universidade do Estado de Santa Catarina, - CEP: Lages SC Brasil, Telefone: 55 (49) (everton.skoronski@udesc.br) RESUMO Etanol de segunda geração é produzido a partir de matérias-primas lignocelulósicas e antes da etapa de fermentação, deve-se realizar a sacarificação. A erva-mate cancheada remanescente do processo de produção das ervateiras é um material lignocelulósico que pode ser utilizado na produção do bioetanol. Objetivou-se no presente trabalho estudar diferentes parâmetros operacionais, para a hidrólise enzimática do resíduo da erva-mate cancheada, utilizando um complexo de celulases (comercial). Os parâmetros estudados foram: tempo de hidrólise, temperatura (41ºC a 53ºC), ph (4,3 a 5,3) e concentração de substrato (2% a 6%, m/v). Os resultados demonstraram que um tempo de hidrólise de 8 horas, temperatura de 41ºC, ph 5,1 e concentração de substrato 6 %(m/v), levaram a maior obtenção de glicose. Para otimização da hidrólise, são necessários mais estudos. Os resultados preliminares obtidos permitiram verificar que o subproduto da erva-mate é uma matéria-prima com potencial para a produção de bioetanol de segunda geração. ABSTRACT Ethanol of second generation is produced from lignocellulosic feedstocks and before the fermentation stage, should perform saccharification. The remaining of yerba mate production process is a lignocellulosic material which may be used in bioethanol production. The objective the present work was study different operating parameters for enzymatic hydrolysis of yerba mate residue using a complex of cellulases (commercial). The parameters studied were: time of hydrolysis, temperature (41 C to 53 C), ph (4.3 to 5.3) and substrate concentration (2% to 6% w/v). The results showed that hydrolysis time of 8 hours, 41 C of temperature, ph 5.1 and the substrate concentration of 6% (w/v), led to obtain a higher glucose concentration. To optimize hydrolysis, further studies are required. The preliminary results obtained showed that the by-product of yerba mate is a raw material with potential for second-generation bioethanol production. PALAVRAS-CHAVE: material lignocelulósico; complexo de celulases; hidrólise, glicose. KEYWORDS: lignocellulosic material; complex of cellulases; hydrolysis glucose. 1. INTRODUÇÃO Tendo sua origem na América do Sul, a erva-mate (Ilex paraguariensis St Hill.) ocorre naturalmente na Argentina, Brasil e Paraguai. Entretanto, cerca de 80% da área de ocorrência pertence

2 ao Brasil, distribuindo-se entre os Estados do Mato Grosso do Sul, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Esmelindro et al., 2002), sendo consumida, principalmente, na forma de chimarrão. Durante o processo de industrialização (sapeco, secagem e cancheamento), quantidades significativas de subproduto são geradas. O resíduo é correspondente a, aproximadamente, 2% da produção em massa. O seu principal uso é como fonte de energia (queima em caldeiras) e/ou como adubo orgânico (Gonçalves et al., 2007). Como se trata de uma planta de composição química elaborada, a erva-mate tem motivado pesquisadores a investirem na melhoria da qualidade do produto. Paralelamente, alguns estudos têm sido conduzidos com o intuito de identificar rotas alternativas para a aplicação da erva-mate, visando agregar valor a esta importante matéria-prima regional (Maccari e Santos, 2000). Materiais lignocelulósicos são recursos renováveis de biomassa que podem ser utilizados como matérias-primas numa biorrefinaria para ser convertidos em uma ampla gama de produtos valiosos, incluindo combustíveis, energia, calor, produtos químicos e materiais. Combustíveis de segunda geração (como o bioetanol) podem ser obtidos a partir de materiais lignocelulósicos que constituem uma alternativa interessante uma vez que estes materiais não competem com as culturas alimentares e podem ser obtidos a partir de resíduos agroflorestais (Alvira et al., 2010). A produção de etanol por fermentação de biomassa ganhou atenção especial durante as duas últimas décadas (Olsson et al., 2005; Serrano-Ruiz et al., 2010). O processo enzimático é mais atraente devido as condições ambientais e a eficiência de conversão pode ser aumentada pelo ajuste das condições reacionais, ou por modificação das enzimas (Himmel et al., 2007; Sticklen, 2008). Para o desenvolvimento de novos produtos a partir da erva-mate, bem como a extração de compostos de interesse, é de fundamental importância a caracterização físico-química do produto em função das etapas do processamento industrial (Esmelindro et al., 2002) Desta forma, o objetivo deste trabalho foi determinar, preliminarmente, as condições experimentais de tempo de reação, temperatura, ph e concentração de substrato para obtenção de glicose a partir da hidrólise enzimática de resíduo de erva mate cancheada. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os ensaios de hidrólise enzimática do resíduo de erva-mate cancheada foram conduzidos no Laboratório de Bioprocessos do Departamento de Engenharia de Alimentos e Engenharia Química - DEAQ da Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC. As amostras de erva-mate foram coletadas na Indústria e Comércio Ervateira Nossa Senhora De Lourdes Ltda. (Vargeão- SC), oriundas de um mesmo lote. O completo enzimático utilizado foi o NS Novozyme, com atividade de BHU(2)/g e dosagem de 3% (m/m). O resíduo de erva-mate foi moído em liquidificador semi-industrial, classificado quanto à granulometria (utilizada a massa retida em peneira de 100 Mesh), acondicionado em embalagens plásticas e armazenado em freezer, em temperatura abaixo de 0 C. Foi realizada a caracterização físico-química do resíduo de erva-mate, através das análises de umidade, proteínas pelo método de Kjeldhal, lipídios pelo método de extração a quente (Soxhlet), glicose e cinzas (IAL, 2008). Os ensaios de hidrólise do resíduo de erva-mate foram divididos em 4 etapas, sendo a concentração de enzima fixada em 3% (m/m) e igual para todos os experimentos: tempo de hidrólise, temperatura, ph e concentração de substrato. Para a obtenção do perfil de hidrólise ao longo do tempo, soluções 3% (m/v) de resíduo de erva-mate em tampão de acetato de sódio ph 5,0, adicionada do complexo enzimático, foram incubadas a 50 C. Para a obtenção dos perfis de hidrólise em diferentes temperaturas, soluções 3% (m/v) de resíduo de erva-mate em tampão de acetato de sódio ph 5,0 e adicionadas do complexo enzimático, foram incubadas a 41 C, 44 C, 47 C, 50 C e 53 C, no tempo determinado na etapa anterior. Para a obtenção dos perfis de hidrólise em diferentes phs, soluções 3%

3 (m/v) de resíduo de erva-mate em tampão de acetato de sódio, phs 4,5; 4,8; 5,1 e 5,3 e adicionadas do complexo enzimático, foram incubadas na temperatura e tempo determinados nas etapas anteriores. Por fim, para a obtenção dos perfis de hidrólise em diferentes concentrações de substrato, soluções 2,0%; 3,0%, 4,0%, 5,0%, 6,0% (m/v) de resíduo de erva-mate em tampão de acetato de sódio ph determinado na etapa anterior, e adicionadas do complexo enzimático, foram incubadas na temperatura e tempo determinados nas etapas anteriores. Todos os ensaios de hidrólise foram realizados em Shaker a 100 rpm, em duplicatas, e foram retiradas amostras a cada 2 horas durante até, 12 horas, para determinação da concentração de glicose, sendo utilizado, para tanto, o método DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico) (Miller, 1959) e sendo descontado o valor inicial de glicose da amostra. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES O resíduo de erva-mate, na caracterização físico-química, apresentou 2,39 % de umidade, 14,57% de proteínas, 8,67% de lipídios, 1,69% de glicose e 5,95% de cinzas. Esmelindro et al. (2002) ao caracterizarem erva-mate visando verificar a influência das etapas do processamento industrial, encontraram valores semelhantes para proteínas (12,84%), lipídios (5,74%) glicose (1,71%) e cinzas (6,06%) para erva-mate cancheada (5 dias). Na Figura 1 estão mostrados os perfis de hidrólise enzimática do resíduo de erva-mate cancheada ao longo do tempo (a) e em diferentes temperaturas (b) para a obtenção de glicose. Figura 1 Perfis de hidrólise enzimática do resíduo de erva-mate cancheada ao longo do tempo (a) e em diferentes temperaturas (b) para a obtenção de glicose. Verifica-se na Figura 1(a) que houve um aumento na concentração de glicose com ponto de máximo em 5 horas, permanecendo, após este tempo, praticamente constante até 12 horas (com um pequeno declínio em 8 horas). Por haver este comportamento em 8 horas, definiu-se este tempo de hidrólise para as demais etapas (3% de substrato, ph 5,0 e 50 ºC). Na Figura 1b, observa-se que ocorre um perfil crescente (na obtenção de glicose) para todas as temperaturas ao longo do tempo, porém, verifica-se que as temperaturas de 41ºC, 44 ºC e 47ºC levaram as maiores concentrações de glicose, definindo-se, portanto, para as proximas etapas pela temperatura de 41 C (3% de substrato, ph 5,0 e 8 horas de processo). A faixa de temperatura, indicada pelo fabricante da enzima, para os experimentos de hidrólise de materiais lignocelulósicos é de 45 a 50ºC. Harun e Danquah (2011), em estudo sobre a hidrólise de biomassa de algas, obtiveram a maior conversão em glicose para ph 5,5 e a temperatura ótima da hidrólise foi de 40 C (temperaturas abaixo e acima de 40 C resultaram em conversões mais

4 baixas). Aumentos de temperatura afetam a cinética das reações enzimáticas, aumentando a frequência de colisão entre um substrato e o sítio ativo de uma enzima, porém, aumentos excessivos podem causar desnaturação nas enzimas (Shuler e Kargi, 2002). Na Figura 2 estão mostrados os perfis de hidrólise enzimática do resíduo de erva-mate cancheada em diferentes phs (a) e em diferentes concentrações de substrato (b) para a obtenção de glicose. Figura 2 Perfis de hidrólise enzimática do resíduo de erva-mate cancheada em diferentes phs (a) e em diferentes concentrações de substrato (b) para a obtenção de glicose. Ao longo do tempo de hidrólise, quando se variou o ph, que os phs 5,1 e 5,3 levaram as maiores concentrações de glicose, seguidos do ph 5,6 (3% de substrato, 41ºC e 8 horas de processo), optando-se para a próxima etapa pelo ph 5,1. Para a concentração de substrato (Figura 2b), observa-se que houve um aumento na concentração de glicose em 8 horas de processo, para os experimentos com concentrações de 4%, 5% e 6% de resíduo de erva-mate (41ºC, ph 5,1 e 8 horas de processo). Uma concentração de substrato mais elevada indica a disponibilidade de mais celulose que pode ser hidrolisada em glicose. Porém, quando a concentração de substrato é aumentada para além do seu valor ótimo e a quantidade de enzima utilizada é fixa, têm-se fatores limitantes, como a inibição pelo produto final e as limitações na transferência de massa na mistura reacional, devido à elevada viscosidade, o que leva a um baixo teor de glucose. A hidrólise pode ser ineficiente quando o substrato exceder 10% (m/m, em massa seca), devido ao aumento da viscosidade (Harun e Danquah, 2011; Tan e Lee, 2014). 4. CONCLUSÕES O resíduo de erva-mate pode ser uma alternativa na produção de bioetanol e para tanto a sacarificação de seu conteúdo lignocelulósico deve ser realizada. Os parâmetros, dentro da faixa estudada, demonstraram que condições mais amenas de temperatura e ph e maiores concentrações de substrato, levam a maiores produções de glicose, e que tempos de até oito horas são suficientes para a sacarificação parcial desta matéria-prima. Mais estudos serão realizados buscando otimizar as condições de hidrólise bem como a fermentação pata a produção do bioetanol.

5 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alvira, P., Tomás-Pejó, E., Ballesteros, M., & Negro, M. (2010). Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: a review. Bioresource Technology, 101(13), , Esmelindro, M. C., Toniazzo, G., Waczuk, A., Dariva, C., & Oliveira, D. (2002). Caracterização físico-química da erva-mate: influência das etapas do processamento industrial. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 22(2), Gonçalves, M., Guerreiro, M.C., Bianchi, M.L., Oliveira, L.C.A., Pereira, E.I., & Dallago, R.M. (2007). Produção de carvão a partir de resíduo de erva-mate para a remoção de contaminantes orgânicos de meio aquoso. Ciência e Agrotecnologia, 31(5), Harun R., & Danquah M. K. Enzymatic hydrolysis of microalgal biomass for bioethanol production. (2011). Chemical Engineering Journal, 168, Himmel, M. E., Ding, S.Y., Johnson, D.K., Adney, W.S., Nimlos, M.R., Brady, J.W., & Foust, T.D. (2007). Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science, 315. Instituto Adolfo Lutz (2008). Métodos físico-químicos para análise de alimentos (4 ed). São Paulo. Maccari, A.J., Santos, A.P.R (2000). Produtos alternativos e desenvolvimento da tecnologia industrial na cadeia produtiva da erva-mate. MCT/CNPq/PADCT, Curitiba, PR. Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31(3), Olsson, L., Jørgensen, H., Krogh, K.B.R., Roca, C. (2005). Bioethanol production from lignocellulosic material. In: Dumitriu, S.(Ed.), Polysaccharides: Structural Diversity and Functional Versatility. Dekker, New York, pp Serrano-Ruiz, J.C., West, R.M., Dumesic, J.A., (2010). Catalytic conversion of renewable biomass resources to fuels and chemicals. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 1, Shuler M.L., & Kargi, F. (2002). Bioprocess Engineering. 2nd ed. Prentice Hall. Sticklen, M.B. (2008). Plant genetic engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol. Nat. Rev. Genet, Tan, I. S., & Lee, K. T. (2014). Enzymatic hydrolysis and fermentation of seaweed solid wastes for bioethanol production: An optimization study. Energy, 78,