APLICAÇÃO DE COMPLEXO ENZIMÁTICO LIGNOCELULÓSICO PARA A HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

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1 APLICAÇÃO DE COMPLEXO ENZIMÁTICO LIGNOCELULÓSICO PARA A HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ¹Giovana Fernanda Dionisio, ²Flávio César Imazu Santana, ³Flávio Faria de Moraes, 4 Gisella Maria Zanin 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPQ/UEM, discente do curso de Engenharia Química 2 Discente do curso de Engenharia Química ³ Professor do Departamento de Engenharia Química da UEM/PR 4 Professora do Departamento de Engenharia Química da UEM/PR 1,2,3,4 Departamento de Engenharia Química da Universidade Estadual de Maringá. Av Colombo, 5.790, Jardim Universitário, Bloco D90, Campus Sede, Maringá PR, CEP: gisella@uem.br RESUMO - Diante da atual visão mundial, de que é necessário renovar as fontes combustíveis, o bagaço da cana entra como opção de mercado podendo ser empregado para a produção de etanol. A aplicação das enzimas em hidrólises é uma alternativa por ser um processo mais limpo e eficaz. Este trabalho objetivou aplicar diferentes enzimas à hidrólise do bagaço visando aumentar a produção de açúcares fermentescíveis. As hidrólises foram realizadas com base na celulose presente no bagaço e com carga de enzima celulase fixa (10 FPU/g celulose), contendo também tampão citrato 0,05M ph 4,8 e benzoato de sódio 1% (m/v). A carga das demais enzimas foi a sugerida pela Novozymes. As enzimas empregadas foram: celulase, celobiase, xilanase, hemicelulase, β-glucanase e enzima Complex. As hidrólises foram conduzidas em erlenmeyers de 500ml com um volume reacional de 100ml, a 50 C, e agitação de 150RPM, por 24h. A glicose formada foi analisada pelo reagente GOD-PAP. A produção de açúcares redutores não aumentou com o aumento da massa de celulose, sendo a máxima produção superior a 2,0g de glicose para os complexos enzimáticos estudados. O melhor resultado foi obtido com 10% de sólidos secos (bagaço), Celulase (10FPU/ g de celulose), Celobiase (0,4% (m/m)) e Xilanase (0,3% (m/m)). Palavras-Chave: bagaço, celulase, xilanase. INTRODUÇÃO A visão mundial atual de que se vive numa estufa e que os seres humanos são os únicos responsáveis por isso, faz com que a corrida por combustíveis renováveis seja acentuada e consolidada. Nessa busca estão se desenvolvendo novas tecnologias e novas fontes produtoras. A biomassa lignocelulósica representa um dos recursos renováveis mais abundantes na terra, e certamente um dos mais baratos, motivo pelo qual a mesma é extensivamente estudada como fonte de energia sustentável para uso industrial. Em destaque têm-se os resíduos do milho, mandioca, cana-de-açúcar, arroz, entre outros, quase todos os produtos não desejáveis nas agroindústrias. Materiais lignocelulósicos são compostos de lignina, polímeros de carboidratos (hemicelulose e celulose), e pequenas partes de outros compostos (extratos, ácidos, sais e minerais) e são frequentemente chamados lignocelulósicos. A celulose e a hemicelulose, são polissacarídeos constituídos de hexoses e pentoses que podem ser hidrolisados a açúcares e eventualmente fermentados a etanol. A lignina não pode ser convertida em etanol, porém seu emprego no processo como fonte energética é recomendável. A celulose é o maior componente estrutural de todas as células vegetais, é o mais abundante componente orgânico da Terra (Hamelinck et al., 2005). Para essa corrida os processos biotecnológicos são os que se mostraram com melhores rendimentos porque não há necessidade de altas temperaturas e pressões e pela facilidade de manuseio com os reagentes. Dentre eles é importante destacar a utilização das enzimas para a degradação do material lignocelulósico O país com a melhor tecnologia para a produção de etanol a partir de biomassa é o Estados Unidos. Como eles, o Brasil também possui a matéria-prima em excesso, o que falta é aperfeiçoamento dos métodos. No processo biotecnológico, o o selo de lignina e a sua cristalinidade tornam a hidrólise da celulose em glicose mais complicada, sendo necessárias altas temperaturas e ácidos minerais fortes para obter-se satisfatório grau de hidrólise. VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 Embora as enzimas do complexo celulolítico não possam penetrar rapidamente a barreira de lignina e sejam lentas no ataque à cristalinidade da celulose, podem converter a celulose em glicose de forma mais seletiva que o ataque ácido, com a formação de poucos subprodutos (além das condições mais brandas de processo). Em consequência, a hidrólise enzimática da biomassa normalmente envolve o pré-tratamento para romper o selo de lignina e destruir a cristalinidade da celulose (Sundsrom et al., 1981). O pré-tratamento se refere à solubilização e separação de um ou mais dos quatro principais componentes da biomassa: hemicelulose, celulose, lignina e extratos, para tornar a biomassa sólida mais acessível a posteriores tratamentos. A hidrólise (sacarificação) quebra as ligações de hidrogênio nas frações de hemicelulose e celulose em pentoses e hexoses. Esses açúcares podem ser fermentados a etanol (Graf e Koehler, 2007). Se o pré-tratamento for muito agressivo, os açúcares liberados podem ser degradados em compostos inibidores das enzimas diminuindo o rendimento. Entretanto, se condições muito brandas de pré-tratamento são usadas, isto irá resultar em pequena acessibilidade para a enzima (Sendelius, 2005). Normalmente a exposição das fibras ocorre pelo pré-tratamento inicial do material lignocelulósico. Em seguida, usam-se as enzimas para liberar as pentoses e hexoses da celulose e hemicelulose. No pátio das usinas, hoje em dia, já existe um sistema de tratamento de fibras, por explosão a vapor, contudo com um destino diferente. O bagaço é tratado para posterior utilização como ração animal, mas vários estudos mostram que pode ser adequado para a utilização em reações enzimáticas. Com esse pensamento em vista, pesquisas são realizadas onde se emprega um coquetel de enzimas, para que as hemiceluloses também sejam hidrolisadas a pentoses, que com microrganismos específicos podem ser fermentadas a etanol. A celulose quando totalmente hidrolisada forma basicamente glicose, que pode ser convertida a uma série de substâncias químicas e bioquímicas. Numa hidrólise parcial da celulose há a formação de celobiose, que pode atuar como inibidor da enzima celulase, responsável pela quebra do material celulósico em glicose. (Pereira Jr. et al., 2008). Na hidrólise de hemicelulose acontece a formação de um misto de açúcares, mas na maior parte dos casos ocorre a formação de xilose (Pereira Jr. et al., 2008). Este trabalho teve como objetivo aplicar novas enzimas à hidrólise do bagaço de cana-deaçúcar, buscando, a melhor combinação para a produção de açúcares fermentescíveis e, também estabelecer novos parâmetros para futuras análises individuais dos mesmos. Um ponto importante que foi estabelecido foi a relação bagaço/concentração de enzima ou combinação das diferentes enzimas estudadas, que foram: celulase, celobiase, xilanase, hemicelulase, β- Glucanase e enzima Complex, todas as enzimas comerciais fornecidas pela Novozymes. Materiais MATERIAIS E MÉTODOS Substrato: O substrato utilizado foi o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor e lavado doado pela Escola de Engenharia de Lorena, USP. Enzimas: As enzimas celulase (NS50013), celobiase (NS50010), xilanase (NS50030), hemicelulase (NS50014), β-glucanase (NS50029) e enzima Complex (NS50012) foram doadas pela Novozymes. Todos os demais reagentes empregados nos ensaios foram de grau analítico. Métodos Caracterização do bagaço: O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor foi caracterizado quanto aos teores de fibra detergente ácida (FDA), fibra detergente neutra (FDN), celulose, lignina, hemicelulose e cinzas, pelos métodos da determinação de FDA e FDN, segundo Silva (1990). O teor de celulose presente no bagaço, conforme determinado por Moreira Neto et al. (2007) foi igual a 55,6%. A umidade, determinada pelo método da estufa até massa constante, foi igual a 8% em base seca. Análise de açúcares redutores: Os açúcares redutores foram determinados pelo método do DNS e expressos como glicose na determinação da atividade da enzima celulase e como xilose para as enzimas xilanase e hemicelulase (Ghose, 1987, Miller, 1959). As amostras são levadas ao banho em fervura por 5 minutos, resfriadas em banho de gelo, agitadas e em seguida lê-se a absorvância a 540nm em espectrofotômetro. Análise de glicose: A glicose formada na hidrólise da celobiose e do bagaço foi analisada pelo método do GOD-POD (Trinder, 1969), que consiste em incubar a amostra em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida adiciona-se água, agita-se e faz-se a leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 525nm. Para esse método fez-se o uso da curva padrão de glicose. Atividade da enzima celulase (FPU): Para determinar a atividade da celulase utilizou-se o LAP 006 (Adney e Baker, 1996), que consiste em realizar a hidrólise de tiras de papel de filtro (1 x 6 cm (50mg)) Whatmann #1, recortadas e enroladas, e adicionadas a tubos de ensaio pré-

3 incubados a 50 C contendo 1,0mL de tampão acetato de sódio 0,01M ph 4,8 e 0,5mL de enzima diluída por 60 minutos, determinando-se em seguida a quantidade de açúcares redutores produzidos na reação, expressos como glicose, pelo método do DNS. Nesse caso determina-se a atividade em papel de filtro representada por FPU, que significa a quantidade de atividade enzimática, determinada nas condições descritas, que produz açúcares redutores equivalentes a 2,0mg de glicose. Atividade da enzima celobiase (CB): A atividade da celobiase foi determinada segundo o método de Ghose (1987) que tem como substrato a celobiose 15mM, sendo o substrato e a enzima incubados por 30 minutos a 50 C e a glicose produzida determinada pelo método GOD-PAP. A atividade CB representa a concentração de enzima que produz 1,0mg de glicose. Também se determinou a atividade da celobiase presente na celulase. Atividade da xilanase e hemicelulase: Para determinar a atividade da xilanase e hemicelulase utilizou-se a Xilana Birchwood a 1% (m/v) diluída em tampão citrato de sódio 0,05M ph 4,8 como substrato. O hidrolisado forma-se após a incubação de 10 minutos a uma temperatura de 40 C e os açúcares redutores produzidos foram dosados pelo reagente DNS. Ensaios de hidrólise do bagaço: Para os ensaios de hidrólise foram empregadas combinações das enzimas celulase, celobiase, xilanase, hemicelulase e enzima Complex, de acordo com o mostrado na Tabela 1. um volume total de reação, 100ml. A reação foi conduzida em frascos erlenmeyers de 500ml contendo o bagaço, 10ml de tampão citrato de sódio 0,05M, ph 4,8, combinações de enzimas (conforme Tabela 1) e solução de benzoato de sódio (1,0g/L) para completar 100ml. As alíquotas para a análise foram retiradas nos tempos de 0,1, 4, 8, 16 e 24h, tendo no máximo 2,0ml de volume. A glicose formada foi dosada pelo reagente GOD- PAP. RESULTADOS E DISCUSSÃO A atividade da enzima celulase (NS50013) empregada nos ensaios foi igual a 51,02FPU (FPU = unidades/ml enzima). Essa enzima apresentou uma atividade em celobiase igual a 2,18CB, ou seja, a enzima celulase é uma mistura e nela há outra enzima, a celobiase, para evitar que ocoram inibições quando utilizada sozinha. A enzima celobiase (NS50010) apresentou uma atividade de 629,8CB (CB = unidades/mll enzima). A atividade da enzima xilanase (NS50030), determinada em xilana foi igual a 16,20U/ml (U=µmol de xilose/ ml de enzima). Os resultados encontrados nos ensaios de hidrólise são mostrados nas Figuras 1, 2 e 3 onde se pode acompanhar a conversão de celulose em glicose, em 24 h de reação, em função das diferentes enzimas empregadas e para as concentração de 5, 10 e 15% de sólidos secos. Tabela 1 Combinações Enzimáticas Empregadas nos Ensaios de Hidrólise Ensaio Enzimas 1 Celulase 2 Celulase e Celobiase 3 Celulase, Celobiase e Xilanase 4 Celulase, Celobiase e Hemicelulase 5 Celulase, Celobiase e β-glucanase 6 Celulase, Celobiase e Enzima Complex Para o planejamento dos ensaios de hidrólise tomou-se como base a porcentagem de celulose contida no bagaço pré-tratado (55,6%), ou seja, quantificou-se a fibra de maior importância para os estudos. Definiram-se ainda as cargas enzimáticas de cada enzima no meio. Para a celulase utilizou-se 10 FPU/ g de celulose e para as demais, fez-se uso do valor definido pela Novozymes, sendo: 0,4% (m/m) de celobiase, 0,3% (m/m) de xilanase, 0,23% (m/m) de hemicelulose, 0,6% (m/m) de β-glucanase e 0,23% (m/m) de enzima Complex (NS50012). O bagaço foi adicionado ao meio levando em conta apenas o bagaço seco. Assim, foram realizados ensaios contendo no meio reacional, base seca, 5%, 10% e 15% (m/v) de bagaço para Figura 1 - Conversão da celulose em glicose para ensaios contendo 5% (m/v) de sólidos secos realizados a 50 C com meio com tampão citrato de sódio 0,05M ph 4,8 e benzoato de sódio 0,01g/L, para as combinações de enzima conforme Tabela 1.

4 Figura 2 - Conversão da celulose em glicose para ensaio contendo 10% (m/v) de sólidos secos realizado a 50 C em meio com citrato de sódio 0,05M ph 4,8 e benzoato de sódio 0,01g/L, para as combinações de enzima conforme Tabela 1.

5 e manter as boas condições de agitação. Portanto há um compromisso entre a massa de bagaço e qualidade de uniformidade do meio reacional. Figura 5 Conversão de celulose em glicose em função da massa de bagaço seco para as hidrólises realizadas com os complexos enzimáticos à temperatura de 50 C em meio reacional contendo tampão citrato 0,05mM ph 4,8 e benzoato de sódio. CONCLUSÕES A combinação de enzimas empregadas mostrou que a melhor combinação, isto é a que conduz à maior conversão de celulose em glicose, é a formada por: celulase, celobiase e xilanase. Os resultados mostram o efeito benéfico causado pela adição de mais de uma enzima para hidrolisar o bagaço, assim há atuação das mesmas também nas hemiceluloses, aumentando a produção de açúcares fermentáveis. Também a partir dos dados apresentados há uma abertura para novas combinações de enzimas que serão aplicadas em hidrólises, sempre com o foco no aumento do rendimento final da conversão em glicose. Outro ponto relevante é o fato do aumento da glicose não ser linear com o aumento de bagaço em meio reacional, isto devido ao tipo de reator batelada não proporcionar uma boa homogeneização e ao bagaço ter a capacidade de absorver o meio líquido no qual se encontra. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADNEY, B.; BAKER, J., Measurement of cellulase activities chemical analysis and testing Laboratory Analytical Procedures. LAP 006. Disponível em :< energy.gov/biomass/analytical_procedures.html>. GHOSE T. K., Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem., 59, GRAF A., KOEHLER T., Oregon cellulose ethanol study: An evaluation of the potential for ethanol production in Oregon using cellulose-based feedstocks. Oregon Office of Energy, 30p + annexes. Disponível em < /Biomass/study. shtml>, 28 de Agosto de HAMELINCK, C.N., VAN HOOIJDONK, G., FAAIJ, A.P.C., Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass Bioenergy, 28, p MILLER, G. L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical Chemistry. 31, MOREIRA NETO, J. ANDRADE, L. P., STEFANO, L., ZANIN, G. M., Aplicação das enzimas celulase e celobiase na hidrólise do bagaço de cana-deaçúcar pré-tratado por explosão a vapor. Anais do VII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica, São Carlos-SP (publicado em CD- ROM). PEREIRA JR., N., COUTO, M. A. P. G., SANTA ANNA, L. M. M., Biomass of lignocellulosic composition for fuel ethanol production within the context of biorefinery. OGIER, J. C., BALLERINI, D., LEYGUE1, J. P., RIGAL, L., POURQUIÉ, J., Production d éthanol à partir de biomasse lignocellulosique, Oil & Gas Science and Technology - Revue de l IFP, 54, SENDELIUS J., Steam pretreatment optimization for sugarcane bagasse in bioethanol. Master of Science Thesis. Department of Chemical Engineering, Lund University, Sweden. SILVA, D. J., O método Van Soest na determinação da qualidade de forragem. Análise de Alimentos (Métodos Químicos e Biológicos), p STERNBERG, D., β-glycosidase of Trichoderma: Its biosynthesis and role in saccharification of cellulose, Applied and Environmental Microbiology, 31, SUNDSTROM, D. W., KLEI, H. E., COUGHLIN, R. W., BIEDERMAN, G. J., BROUWER, C. A., Enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose using immobilized β-glycosidase, Biotechnology and Bioengineering, 23, TRINDER, P., Determination of glucose in blood using glucose oxidize with an alternative oxygen acceptor. Annals of Clinical Biochemistry, 6, AGRADECIMENTOS Ao CNPq, à FINEP, à Novozymes (doação das enzimas) e ao Prof. Adilson R. Gonçalves (EEL) pelo pré-tratamento do bagaço de cana.