VIABILIDADE DE UTILIZAÇÃO DA PALHA DE CANA-DE-AÇÚCAR NA PRODUÇÃO DE ETANOL

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1 VIABILIDADE DE UTILIZAÇÃO DA PALHA DE CANA-DE-AÇÚCAR NA PRODUÇÃO DE ETANOL André de Sousa Freitas 1, Priscila Vargas Pereira 1, Raquel Vieira de Carvalho 1, Jussara Moreira Coelho 1 1 Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Engenharia de Alimentos, Alto Universitário, , ES, Brasil, andresousafreitas@yahoo.com.br Resumo - A palha de cana-de-açúcar representa importante matéria prima para produção de bioetanol, gerando assim, benefícios ambientais e econômicos. Para produção do etanol de segunda geração, faz-se necessário expor a celulose, presente nesta biomossa lignocelulósica, com sua posterior conversão em glicose e subsequente fermentação. O presente trabalho objetivou avaliar soluções de H 2 SO 4 em diferentes concentrações, na etapa de pré-tratamento da palha; determinar o rendimento em açúcares após hidrólise enzimática e a concentração de etanol após fermentação por ação da levedura Saccharomyces cerevisiae. As concentrações de H 2 SO 4 utilizadas foram de 0, 1 e 5% (m/v). Todas as amostras foram caracterizadas quanto ao teor de celulose, hemicelulose e lignina. A quantificação dos açúcares foi realizada nos tempos de 24, 48 e 72 horas. A fermentação foi realizada por 72 horas, a 30 C e 150 rpm. A solução de H 2 SO 4 1% (m/v) foi a escolhida por remover 82,95% de hemicelulose, permitindo uma produção de aproximadamente 13,97 mg.l -1 de açúcares redutores, após 48 horas de hidrólise, além de um rendimento de 84% em etanol. Palavras-chave: Açúcares redutores, deslignificação, ácido sulfúrico. Área do Conhecimento: Ciência e Tecnologia de Alimentos Introdução As reservas de petróleo são as principais fontes energéticas mundiais. Contudo, o petróleo é um combustível de fonte não renovável e vem preocupando a sociedade quanto aos danos ambientais causados pela sua queima, ocasionando a emissão de gases responsáveis pelo efeito estufa (KHESHGI, PRINCE e MARLAND, 2000; HIMMEL et al., 2007). Desse modo, o interesse pelo uso do etanol como combustível vem aumentando (ROBERTO, 2007; ASGHER et al., 2013). A produção de etanol, nos dias atuais, é realizada pelas destilarias com materiais diretamente fermentescíveis (caldo da cana-de-açúcar) ou materiais amiláceos (milho), conhecido como etanol de primeira geração (NUNES et al., 2013). A fim de se expandir a produção de etanol, um processo não convencional e que faz uso da celulose como fonte de carbono vem sendo utilizado, sendo este etanol conhecido como de segunda geração. A celulose é encontrada em diversas biomassas lignocelulósicas, como a palha de cana-de-açúcar (BRETHAUER e WYMAN, 2010). Dados da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) demonstram que na safra 2015/2016 foram produzidos no Brasil, aproximadamente, 93 milhões de toneladas de palha de cana-de-açúcar. De maneira geral, cerca de 140 kg de palha de cana-de-açúcar são descartadas em destilarias para cada tonelada de cana processada. A primeira etapa da produção de etanol a partir da palha de cana-de-açúcar denomina-se prétratamento e objetiva a remoção da lignina e hemicelulose, e exposição da cadeia de celulose a qual deve ser tratada enzimaticamente para produção de glicose. Diversos pré-tratamentos são empregados, como os físicos, químicos, físico-químicos e biológicos, porém, os pré-tratamentos químicos recebem maior atenção por removerem a lignina sem degradação da cadeia celulósica (HIMMEL et al., 2007). Dentre os pré-tratamentos químicos, a utilização de ácido diluído promove maior degradação da fração hemicelulósica, destacando-se como um método eficiente, rápido e simples (RAMOS, 2003). Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivo a avaliação da viabilidade de produção de etanol utilizando palha de cana-de-açúcar pré-tratada com ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) diluído, seguido de hidrólise enzimática e fermentação. Metodologia 1

2 As análises foram realizadas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Operações Unitárias do Departamento de Engenharia de Alimentos, do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias, da Universidade Federal do Espírito Santo (CCAE - UFES), Alegre, ES. A palha de cana-de-açúcar foi obtida na Usina Paineiras S. A., localizada na cidade de Itapemirim/ES, sendo transportada para o Laboratório de Operações Unitárias, onde a mesma foi moída em moinho de facas da marca SOLAB tipo Willy. Após moagem, a palha foi acondicionada em sacos plásticos transparentes da marca TradPouch e armazenada à 4 C até o momento do uso. A palha foi pré-tratada com soluções de H 2 SO 4 nas concentrações de 0, 1 e 5% m/v. O prétratamento ocorreu em frascos de 250 ml, os quais continham 10 g de palha e 100 ml de solução. Cada pré-tratamento foi realizado em três repetições. Os frascos foram submetidos a uma temperatura de 121 C em autoclave por 30 minutos. Após o tratamento térmico, as misturas foram filtradas a vácuo, realizando lavagens com água destilada aquecida a 60 ºC (PEREIRA, 2013). As amostras então foram secas em estufa a 40 C durante 24 horas, armazenadas em sacos plásticos transparentes e acondicionadas à 4 C. As análises de caracterização da matéria-prima foram realizadas no Laboratório de Nutrição Animal, do Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa/MG. As amostras de palha in natura e pré-tratadas (0, 1, 5% m/v de H 2 SO 4 ), foram caracterizadas quanto aos teores de celulose, hemicelulose e lignina, empregando-se o método de Van Soest (1991). Os efeitos do prétratamento na remoção de hemicelulose e lignina foram avaliados seguindo a equação 1. % remoção = X i X a 100 (Eq 1) X Onde X i é o teor de hemicelulose ou lignina da amostra in natura e X a o teor de hemicelulose ou lignina na amostra pré-tratada (0, 1 e 5% de H 2 SO 4 ). A palha in natura e pré-tratada foi hidrolisada por um complexo de celulases liofilizado, Powercell, fornecido pela empresa Prozyn. Esse complexo tinha atividade enzimática declarada de 200 FPU.g -1. Para confirmação da atividade enzimática do complexo foi utilizado o método de Ghose (1987). Para realização do procedimento de hidrólise enzimática, 10 g de palha de cana-de-açúcar in natura e pré-tratadas foram ressuspendidas, cada uma, em 100 ml de tampão citrato de sódio, ph 5,0 (ph ótimo do complexo enzimático). A concentração de enzima empregada foi de 15 FPU.g -1 de palha e a hidrólise enzimática foi conduzida à temperatura de 60 C, com agitação de 150 rpm por 72 horas (PEREIRA, 2013). Alíquotas de 1,5 ml do sobrenadante de cada amostra foram coletadas nos tempos de 24, 48 e 72 horas e armazenadas em congelador para avaliação posterior da concentração de açúcares redutores pelo método de Miller (1959). Para o cálculo da concentração de açúcares redutores foi construída uma curva padrão com variadas concentrações (0, 0.5, 1, 2, 3.3, 5 e 6.7 g.l -1 ) de glicose e seus respectivos valores de absorbância e foi calculado o rendimento em glicose por grama de celulose (Y G/C ), mostrada na equação 2. i A produção de etanol foi conduzida utilizando-se cultura pura de Saccharomyces cerevisiae liofilizada e tolerante ao álcool e ao calor, utilizada na produção de vinhos, da marca Red Star, na concentração de 5 g.l -1. A fermentação alcoólica foi conduzida utilizando-se a fração líquida obtida após a hidrólise enzimática, sem adição de qualquer suplemento, em erlenmeyers de 250 ml. A levedura foi inoculada na fração líquida e os experimentos foram realizados em Incubadora tipo Shaker, a 30 ºC, 150 rpm, por 72 horas. Ao final da fermentação, realizou-se a filtração e centrifugação do meio fermentado, a 5000 rpm por 20 min, para alcançar maior claridade da fração líquida. O sobrenadante foi retirado e conduzido ao processo de destilação, onde foi montado um aparato composto por uma manta aquecedora e um condensador de liebig do tipo liso. A metodologia empregada foi a proposta pelo Instituto Adolfo Lutz (2005) para determinação do teor alcoólico de bebidas fermentadas. A concentração de etanol foi 2

3 avaliada por densidade em picnômetro de acordo com a metodologia do Instituto Adolfo Lutz (2005) e calculou-se o rendimento em etanol por grama de glicose (Y E/G ) de acordo com a equação 3. Y E/G = X X E tan ol (Eq 3) Gli cose Onde X Etanol é a concentração de etanol, e X Glicose é a concentração de glicose, ambas expressas em g.l -1. Para comparar o efeito dos diferentes tipos de pré-tratamento utilizando palha de cana-deaçúcar, o experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, onde os dados experimentais foram obtidos em triplicata. Os dados de concentração de açúcares redutores foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade usando o programa estatístico GENES, versão Resultados A caracterização da palha de cana-de-açúcar in natura e pré-tratada com solução de ácido sulfúrico nas concentrações de 0, 1 e 5% (m/v), está apresentada na Tabela 1. Tabela 1 Composição da palha de cana-de-açúcar quanto aos teores de celulose, hemicelulose e lignina, da amostra in natura e tratada com ácido sulfúrico. Amostras Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Palha in natura 0% de H 2 SO 4 1% de H 2 SO 4 5% de H 2 SO 4 *Valores médios de duplicatas 37,94 43,11 60,71 59,59 37,42 40,61 6,38 2,19 7,98 10,4 20,6 23,5 A concentração de açúcares redutores, em função do tempo de hidrólise enzimática, para as diferentes amostras estudadas, segue apresentada pela Figura 1. Figura 1 Hidrólise enzimática, em função do tempo, expressa em concentração em g.l -1 de açúcar redutor (AR), de palha in natura e pré-tratada com ácido sulfúrico nas concentrações de 0, 1 e 5% (m/v). A Tabela 2 apresenta os valores obtidos de celulose após pré-tratamento com solução de ácido sulfúrico 1% (m/v), concentração de glicose após 48 h de sacarificação, quantificação de etanol após 72 h de fermentação e os rendimentos de glicose em relação à celulose (Equação 2) e de etanol em relação à glicose (Equação 3). 3

4 Tabela 2 Concentração de celulose, glicose e etanol, bem como os rendimentos de glicose em relação à celulose e de etanol em relação à glicose. Celulose (%) Glicose (g.l -1) Y (G/C) Etanol (g/l) Y (E/G) 60,71 13,97 0,16 5,96 0,43 *Y (G/C): rendimento de glicose em relação à celulose, Y (E/G): rendimento de etanol em relação à glicose Discussão Os teores de celulose e hemicelulose da palha in natura (Tabela 1) não se distanciam dos valores relatados por Mendes (2013). Entretanto, o teor de lignina é bem inferior à faixa apresentada pelo pesquisador. Para este autor a palha de cana-de-açúcar estudada era constituída por 40 a 44% de celulose, 30 a 32% de hemicelulose e 22 a 25% de lignina. Os maiores teores de celulose, 60,71 e 59,59%, foram encontrados nos materiais tratados com solução de ácido sulfúrico 1 e 5% (m/v), respectivamente. Esse aumento na porcentagem de celulose da palha, após pré-tratamento, deve-se à remoção de hemicelulose e outros constituintes da palha in natura, com consequente exposição e aumento da proporção de celulose. O teor de celulose da palha de cana-de-açúcar pré-tratada com solução de ácido sulfúrico 1% (m/v), 60,71%, foi próximo ao relatado por Silva (2009), 51,9%, utilizando solução ácida de mesma concentração, como pré-tratamento, a 120 ºC, por 10 minutos. Segundo Behera et al. (2014), o tratamento com ácido diluído em concentrações entre 0,1 e 2% (m/v), costuma ser mais efetivo do que a utilização de ácido concentrado, apresentando menor degradação de celulose e formação de inibidores. O percentual de remoção da fração hemicelulósica e de lignina das amostras de palha prétratadas com solução de ácido sulfúrico, foram obtidas pela Equação 1. Quanto a fração hemicelulósica, a solução de ácido sulfúrico na concentração de 5% (m/v) foi o pré-tratamento mais eficaz, atingindo remoção de 94,15% em comparação com as amostras de palha in natura. Utilizando a solução de H 2 SO 4 na concentração de 1% (m/v), a remoção foi de 82,95%, encontrando um teor de hemicelulose restante de 6,38%. Silva (2009) relatou uma concentração de hemicelulose de 17,00%, após pré-tratamento utilizando solução de ácido sulfúrico 1% (m/v). Este valor encontra-se acima do obtido neste trabalho, o que indica que o presente estudo obteve maior êxito na realização de prétratamento ácido para remoção de hemicelulose. A hidrólise da hemicelulose é a principal ação realizada pelo pré-tratamento com ácidos diluídos (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000). Menores valores de hemicelulose restante, devido à maior remoção, resultam em maior exposição da matriz celulósica o que facilitaria as próximas etapas. Em relação aos teores de lignina, pode-se notar que não houve remoção e sim um acréscimo na sua concentração, mostrando um crescimento de até 200,00% em relação à palha in natura após realização dos diferentes pré-tratamentos. Isto pode ser explicado pelo estudo de Taherzadeh e Karimi (2008) onde os pesquisadores ressaltam que a lignina apresenta elevada resistência à degradação química. Possivelmente submeter a palha de cana-de-açúcar à altas temperaturas, em autoclave, utilizando H 2 SO 4, não remove lignina, mas remove outros compostos fazendo com que a proporção de lignina na palha tratada aumente. Ao observarmos a Figura 1, pode-se perceber que após 24 horas, os valores de açúcares redutores se elevam. Além disso, o comportamento das concentrações de açúcares redutores, em função do tempo de hidrólise enzimática, obtido com as amostras tratadas com solução de H 2 SO 4 1% (m/v) se assemelham ao de H 2 SO 4 5% (m/v). Após a sacarificação enzimática das amostras de palha pré-tratadas com solução de H 2 SO 4, nas concentrações de 1 e 5% (m/v), observa-se uma maior concentração de açúcares redutores, cerca de 16 g.l -1, para o tratamento de 5% (m/v). Alguns poucos estudos têm mostrado que a remoção da hemicelulose por alguns reagentes químicos, como o ácido sulfúrico, aumenta consideravelmente a conversão de celulose, da palha de cana, em açúcares redutores (SILVA, 2009). O tempo de 48 horas de hidrólise enzimática foi suficiente, uma vez que não houve diferença estatística significativa, variando-se os tempos de hidrólise, pelo teste F em um nível de significância de 5%. Fixando-se o tempo de 48 horas de hidrólise, foi possível observar que não houve diferença significativa entre as amostras de palha pré-tratadas com soluções de H 2 SO 4 1 e 5% (m/v). Como não diferiram entre si, a concentração de 1% (m/v) foi a escolhida como pré-tratamento para os 4

5 experimentos subsequentes, pelo fato de que o reagente é um dos fatores que mais interferem no custo de produção do etanol, além de permitir menor exposição do manipulador ao reagente químico que exige cuidados no manuseio. A conversão de celulose em glicose (Y G/C ) foi de 0,16 g glicose /g celulose. Este resultado mostra-se inferior aos obtidos por Pereira (2013) com capim-andropogon, capim-elefante e capim-mombaça, tendo relatado 0,28 g glicose /g celulose, 0,31 g glicose /g celulose e 0,28 g glicose /g celulose, respectivamente. Esta diferença encontrada para o rendimento Y G/C pode ter sido influenciada pela natureza recalcitrante da biomassa vegetal. A concentração de etanol após o processo fermentativo foi de 5,96 g.l -1, estando este valor distante dos encontrados por Pereira (2013) na obtenção de etanol a partir do capimandropogon, capim-elefante e capim-mombaça, relatando concentrações de 15,17 g.l -1, 13,58 g.l -1 e 12,47 g.l -1, respectivamente. Além deste, Sindhu et al. (2011) em estudo da obtenção de etanol a partir da palha da cana-de-açúcar, relataram ter encontrado 11,36 g.l -1 de etanol, tendo conduzido o processo fermentativo de maneira semelhante ao do presente estudo. O rendimento em etanol (Y E/G ) apresentou-se abaixo do valor teórico de 0,51 g etanol /g glicose, porém, este resultado representa 84% do rendimento esperado, sendo este considerado bom em virtude das condições do processo e da dificuldade que existe em se obter valores iguais ou superiores ao valor de etanol teórico. Conclusão Por este estudo foi possível verificar que a produção de etanol utilizando palha de cana-deaçúcar é viável. A solução de H 2 SO 4 1% (m/v) foi a mais eficaz e indicada para o pré-tratamento, promovendo uma remoção significativa de hemicelulose. Além disso, a mesma possibilitou altas concentrações de açúcares redutores durante hidrólise enzimática por 48 horas, proporcionando redução de custos, devido ao menor tempo reacional e a prevenção de contaminação microbiana. Somado a isso, o processo fermentativo resultou num bom rendimento em etanol, sendo este 84% do valor de etanol teórico. Referências ASGHER, M., AHMAD, Z., IQBAL, H. M. N. Alkali and enzymatic delignification of sugarcane bagasse to expose cellulose polymers for saccharification and bio-ethanol production. Industrial Crops and Products. v. 44. p BEHERA, S., ARORA, R., NANDHAGOPAL, N., KUMAR, S. Importance of chemical pretreatment for bioconversion of lignocellulosic biomass. Renewable and Sustainable Energy Reviews v. 36. P BRETHAUER, S., WYMAN, C. E. Review Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production. Bioresource Technology. v p CONAB COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO. Acompanhamento da safra brasileira de cana-de-açúcar. v. 2. n. 4. Abril, CRUZ, C.D. GENES - A software package for analysis in experimental statistics and quantitative genetics. Acta Scientiarum. v. 35, n. 3, p , GHOSE, T. K. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry. v. 59. p HIMMEL, M. E., DING, S. Y., JOHNSON, D. K., ADENEY, W. S., NIMLOS, M. R., BRADY, J. W. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. ed. 4. Brasília,

6 KHESHGI, H. S., PRINCE, R. C., MARLAND, G. The potential of biomass fuels in the context of global climate change: Focus on transportation fuels. Annual Review of Energy and the Environment MENDES, KASSANDRA CHRISTINY SILVA. Estudo do processo de pré-tratamento da palha de cana-de-açúcar para a otimização da produção de xilose com reduzida formação de produtos de degradação. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Tecnologia e Geociências MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. v. 31. n. 3. p MORO, MARIANA KUSTER. Pré-tratamento da biomassa de cana-de-açúcar por extrusão com dupla-rosca. Dissertação (mestrado) Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa de Engenharia (COPPE-UFRJ), Rio de Janeiro, NUNES, R. M., GUARDA, E. A., SERRA, J. C. V., MARTINS, A. A. Resíduos agroindustriais: potencial de produção do etanol de segunda geração no Brasil. Revista Liberato, Novo Hamburgo. v. 14. p PALMQVIST, E. HAHN-HÄGERDAL, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: Inhibition and detoxification. Department of Applied Microbiology, Lund University. PO Box Lund. Sweden. p PEREIRA, D. G. S. Rendimentos da hidrólise enzimática e fermentação alcoólica de capimelefante, capim-andropogon, capim-mombaça e bagaço de cana-de-açúcar para produção de etanol de segunda geração. Dissertação (mestrado), Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, RABELO, S. C. Avaliação de desempenho do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino para a hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. p RAMOS, L. P. The chemistry involved in the steam treatment of lignocellulosic materials. Química Nova ROBERTO, C. Etanol celulósico: utopia ou realidade?. Revista Idea News. v. 83. p RODRIGUES, A. L. P., SAMPAIO, I. B. M., CARNEIRO, J. C., TOMICH, T. R., MARTINS, R.G.R. Degradabilidade in situda matéria seca de forrageiras tropicais obtidas em diferentes épocas de corte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. v 56. p SILVA, V. F. N. Estudos de pré-tratamento e sacarificação enzimática de resíduos agroindustriais como etapas no processo de obtenção de etanol celulósico. Dissertação (Mestre em Ciências) Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo EEL. p SINDHU, R., KUTTIRAJA, M., BINOD, P., JANU, K. U., SUKUMARAN, R. K., PANDEY, A. Dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification of sugarcane tops for bioetahnol production. In: Bioresource Technology. Elsevier TAHERZADEH, M. J., KARIMI, K. Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: a Review. International Journal of Molecular Sciences VAN SOEST, P.J., ROBERTSON, J.B.; LEWIS, B.A. Symposium: carboydrate metodology, metabolism, and nutritional implications in dairy cattle. Journal Dairy Science. v.74. p