SELEÇÃO DE LINHAGEM INDUSTRIAL DE

Transcrição

1 75 ISSN SELEÇÃO DE LINHAGEM INDUSTRIAL DE Saccharomyces cerevisiae COM POTENCIAL DESEMPENHO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL EM CONDIÇÕES ADVERSAS DE TEMPERATURA E DE AGITAÇÃO Julliana Ribeiro Alves dos Santos 1, Norma Buarque de Gusmão 2, Ester Ribeiro Gouveia 3 RESUMO O objetivo deste trabalho foi selecionar linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae capaz de apresentar um potencial desempenho fermentativo em condições adversas de temperatura e de agitação, visando a produção de bioetanol por sacarificação e fermentação simultâneas. Os ensaios foram realizados em duas etapas. Na primeira etapa, foram realizadas fermentações com quatro linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae e três diferentes temperaturas, mas sem agitação. Na segunda etapa, foi aplicado um planejamento fatorial, utilizando apenas uma levedura, selecionada na etapa anterior, em ensaios de fermentação variando tanto a temperatura, quanto a agitação. Foram realizadas medidas de CO 2 na primeira etapa e de glicose e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência, na etapa seguinte. O aumento da temperatura foi muito mais prejudicial à fermentação do que o aumento da agitação, para os níveis testados. A linhagem UFPEDA 1238 apresentou maior desempenho fermentativo nas condições adversas de temperatura e de agitação utilizadas no presente trabalho. Palavras-chave: Saccharomyces, planejamento fatorial, temperatura, agitação. SELECTION OF INDUSTRIAL STRAIN OF Saccharomyces cerevisiae WITH POTENTIAL PERFORMANCE FOR ETHANOL PRODUCTION IN ADVERSE CONDITIONS OF TEMPERATURE AND AGITATION ABSTRACT The objective of this work is to select an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae capable of presenting some potential fermentation performance under adverse conditions of temperature and agitation in order to produce bio-ethanol by simultaneous saccharification and fermentation. The tests were carried out along two phases. In the first phase, fermentations were performed with four industrial strains of Saccharomyces cerevisiae at three different temperatures with no shaking. In the second phase, a factorial design was applied utilizing only one kind of yeast, selected in the previous stage in fermentation tests by varying both the temperature and the agitation. Measurements were made of CO 2 in the first phase and of glucose and ethanol by means of high performance liquid chromatography in the following phase. The temperature increase was far more damaging to fermentation than the increased agitation at the levels being tested. The UFPEDA 1238 strain showed higher fermentation performance in adverse conditions of temperature and agitation such as the ones observed in the present work. Keywords: Saccharomyces, factorial design, temperature, agitation. Protocolo de 13/03/ Pesquisadora, Biomédica, UFPE, Departamento de Antibióticos, Av. Prof. Moraes Rêgo, Cidade Universitária, Recife-PE, julliana.santos85@gmail.com, (81) Professora Adjunta, Doutora em Microbiologia, UFPE Departamento de Antibióticos, Av. Prof. Moraes Rêgo, Cidade Universitária, Recife-PE, nbg@ufpe.br, (81) Professora Adjunta, Doutora em Engenharia Química, UFPE, Departamento de Antibióticos, Av. Prof. Moraes Rêgo, Cidade Universitária, Recife-PE, estergouveia@gmail.com, (81)

2 76 Seleção de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial para a produção de etanol... Santos et al. INTRODUÇÃO Saccharomyces é um microrganismo aeróbio facultativo, isto é, que tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose. Os produtos finais do metabolismo do açúcar irão depender das condições ambientais em que a levedura se encontra. Assim, em aerobiose, o açúcar é transformado em biomassa, CO 2 e água, e, em anaerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO 2, processo denominado de fermentação alcoólica. Os carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos (constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose, glicose, frutose e outros), estes últimos fornecidos à levedura. O etanol e o CO 2 resultantes se constituem, tão somente, de produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose (Lima et al., 2001). Martin et al. (2006) destacaram a importância de Saccharomyces cerevisiae como o microrganismo que tem sido tradicionalmente usado para a produção de bebidas alcoólicas e etanol, tendo açúcares como sacarose e glicose como substratos. Este microrganismo também possui a capacidade de produzir etanol a partir de material lignocelulósico. Saccharomyces cerevisiae apresenta diversas vantagens em relação à produção de etanol a partir da lignocelulose, como a não exigência de oxigenação e a relativa tolerância a etanol e inibidores da fermentação, que são geralmente compostos formados no tratamento físico e/ou químico dado ao material lignocelulósico antes da fermentação (Martin et al. 2002; Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000). A produção de etanol celulósico, também conhecido como bioetanol, a partir de material lignocelulósico, como o bagaço de cana-deaçúcar, requer a sua hidrólise, que pode, após pré-tratamento, ser realizada por celulases e β- glucosidase (Jan & Chen, 2003; Lima et al., 2005). Uma etapa de pré-tratamento é necessária para aumentar a conversão enzimática e diminuir o custo do processo (Martin et al., 2008). As celulases (endoglucanase e exoglucanase) quebram a celulose em celobiose, que é subsequentemente convertida em duas moléculas de glicose, pela betaglucosidase (Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000). Entretanto, a atividade da endoglucanase é inibida pela celobiose e menos extensivamente pela glicose, enquanto que, a beta-glucosidase é inibida pela glicose (Philippidis et al., 1993). A sacarificação e fermentação simultânea (SFS) é uma forma de evitar a inibição enzimática, uma vez que à medida que a glicose está sendo formada, também está sendo consumida para a produção de bioetanol, levando a uma maior conversão de celulose (Martin et al., 2008). Um processo em SFS requer uma condição intermediária de temperatura para as enzimas e para a levedura adicionada, uma vez que as temperaturas ótimas para a sacarificação e fermentação são cerca de 55 0 C e 30 0 C, respectivamente (Martin et al., 2008). A agitação também é outra variável que requer uma condição intermediária. Como já mencionado, Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo utilizado no Brasil para a produção de etanol. Entretanto, este microrganismo converte satisfatoriamente glicose em etanol e CO 2, apenas em condições de anaerobiose (Lima et al., 2001). Por outro lado, a sacarificação é realizada geralmente a 150 rpm (Adsul et al., 2005). Diante do que foi exposto, o objetivo deste trabalho foi encontrar condições de temperatura e de agitação intermediárias entre àquelas utilizadas na fermentação e àquelas utilizadas na sacarificação, visando um processo de produção de bioetanol em SSF. MATERIAIS E MÉTODOS Microrganismos e meios de cultura Foram utilizadas quatro linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae (UFPEDA 1238, JP-1, Pedra, Agrisa R e Agrisa S), cedidas pela Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. O meio de cultura utilizado para a conservação do microrganismo foi o GLP, em tubo de ensaio inclinado, à base de glicose (20 g/l), extrato de levedura (5 g/l), peptona (3 g/l) e ágar (1,5 % P/V). Na preparação do inóculo, foi também utilizado o meio GLP, porém sem adição de ágar. Os meios de fermentação, continham: glicose (80 g/l), (NH 4 ) 2 SO 4 (1 g/l), K 2 HPO 4 (0,5 g/l), MgSO 4.7H 2 O (0,25 g/l), extrato de levedura (2 g/l), peptona (1 g/l). O ph foi ajustado para 5,0 em todos os casos. Fermentações Inicialmente, cada linhagem foi repicada em tubo de ensaio contendo o meio GLP sólido

3 Seleção de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial para a produção de etanol... Santos et al. 77 (ph = 7,0), o qual foi mantido a 30 0 C em estufa, durante 24 horas. Após esse período, o inóculo foi preparado através de outro repique em frasco de erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio GLP líquido (ph = 7,0), o qual foi acondicionado a 250 rpm e a 30 0 C, por 12 horas. Foram realizados 4 diferentes experimentos em duplicata, em meios à base de sacarose, em frascos de erlenmeyer de 125 ml, contendo 90 ml de meio de fermentação e 10 ml do inóculo (10% V/V). Os frascos foram mantidos à 30 C, sem agitação, durante 24 horas. Na segunda etapa do trabalho, um planejamento fatorial 2 2 com os experimentos realizados em duplicata foi aplicado para o estudo das condições de temperatura e agitação na produção de etanol. Os experimentos realizados nesta etapa foram conforme as condições apresentadas na Tabela 1. Métodos analíticos A produção de CO 2 foi determinada pela perda de peso, na primeira etapa de experimentos, efetuando-se a pesagem dos frascos em balança analítica, após leve agitação manual durante 30 segundos. Amostras das fermentações da segunda etapa, foram centrifugadas a 10 rpm durante 10 minutos, sendo os sobrenadantes utilizados para a determinação de glicose e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A determinação da concentração de glicose foi realizada por CLAE com as seguintes condições: coluna Rezex ROA- Organic Acid H + (8%), ácido sulfúrico 5 mm como fase móvel, detecção por índice de refração, vazão de 0,6 ml/min e 45 0 C. Na determinação de etanol, foi modificada apenas a temperatura para 30 0 C e a vazão para 1 ml/min (Gouveia et al., 2009). RESULTADOS E DISCUSSÃO Variação da temperatura para a seleção inicial de levedura com potencial fermentativo Conforme a equação estequiométrica da utilização de glicose por Saccharomyces cerevisiae, para cada 180 g/l de glicose utilizada pela levedura, 88 g/l é convertido em CO 2 e 92 g/l em etanol. Dessa forma, os rendimentos em CO 2 e em etanol podem ser calculados pelas Equações (1) e (2), respectivamente: CO2 100 η CO = (1) 2 S 0,49 E 100 η E = (2) S 0,51 O termo CO 2 na Equação (1) é a concentração em g/l de dióxido de carbono obtida utilizando-se a Equação (3): CO 2 Pi Pf = (3) V ( L) P 1 (g) e P 2 (g) são os pesos dos frascos no início (tempo zero) e no final (24 horas) da fermentação, respectivamente, e V é o volume de meio expresso em litros. O termo E na Equação (2) refere-se à concentração (em g/l) de etanol obtido no final da fermentação. Ainda, E e S são as variações das concentrações (em g/l) de etanol e de glicose, respectivamente. Com relação aos rendimentos teóricos em CO 2 obtidos nas fermentações com as quatro leveduras industriais, a Figura 1 apresenta um gráfico para cada temperatura testada. Tabela 1. Condições dos ensaios do planejamento fatorial Ensaios Temperatura ( 0 ) Agitação (rpm) Figura 1. Rendimentos teóricos em CO 2 obtidos pelas quatro leveduras industriais para cada uma das temperaturas.

4 78 Seleção de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial para a produção de etanol... Santos et al. É possível observar na Figura 1, que os maiores rendimentos foram obtidos para as fermentações a 37 0 C, independente da linhagem utilizada. A linhagem Pedra foi a que apresentou os menores rendimentos. Em experimentos para a produção de etanol na presença de xilose, esta linhagem também foi a que apresentou o pior desempenho (Santos & Gouveia, 2007). As linhagens Agrisa S e Agrisa R apresentaram rendimentos semelhantes apenas para 45 0 C. As linhagens Agrisa S e UFPEDA 1238 apresentaram maiores rendimentos para 30 e 37 0 C. Entretanto a linhagem UFPEDA 1238 foi selecionada, uma vez que também apresentou o maior rendimento também a 45 0 C. Aplicação de um planejamento fatorial para a seleção das melhores condições de temperatura e de agitação Na próxima etapa do trabalho foram realizados quatro experimentos em duplicata, cujas condições de temperatura e de agitação são descritas na Tabela1. Uma vez que a linhagem UFPEDA 1238 apresentou adequados rendimentos teóricos para CO 2, foram utilizadas estas mesmas temperaturas, mas com agitação. Foram escolhidos os dois valores de agitação, 80 e 150 rpm, visando futuros experimentos em SSF, ou seja, onde as condições de temperatura e de agitação precisam estar adequadas não apenas para a levedura, mas também para a sacarificação, que, neste caso, é simultânea à fermentação. A Figura 2 apresenta um gráfico sobre o rendimento teórico em etanol obtido após 24 horas de fermentação. Os maiores rendimentos foram obtidos nas fermentações a 37 0 C (ensaios 1 e 3), concordando com os resultados da etapa anterior. Entretanto, à medida que a agitação também aumenta, os rendimentos diminuem, sendo esta diminuição ainda maior, para a temperatura de 45 0 C (ensaio 4). A Figura 3 apresenta os valores de produtividades volumétricas máximas obtidas com 24 horas de fermentação para as quatro condições de temperatura e agitação testadas. Os resultados de produtividade concordam com os de rendimento (Figura 2), com relação às variações de temperatura e de agitação. Figura 3. Produtividades volumétricas máximas com 24 horas de fermentação. A Tabela 2 apresenta os resultados com relação à concentração de etanol obtida em cada ensaio realizado em duplicata. A Tabela 3 apresenta os valores dos efeitos principais e de interação entre os dois fatores para o planejamento fatorial 2 2. Tabela 2. Concentração de etanol obtida em cada ensaio do planejamento fatorial. Ensaios T A EtOH Média ( 0 C) (rpm) (g/l) ,43 18,73 19, ,07 3,00 2, ,86 11,57 10, ,92 0,85 0,89 No nível de 95% de confiança, o valor do test-t correspondente a 4 graus de liberdade é 2,776. Isto significa que apenas os efeitos que foram maiores que o valor do test-t multiplicado pelo erro (0,37), são considerados significativos (Neto et al., 1995). No presente trabalho, todos os efeitos foram considerados significativos (Tabela 3). Figura 2. Rendimentos teóricos em EtOH obtidos nas fermentações do planejamento fatorial.

5 Seleção de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial para a produção de etanol... Santos et al. 79 Tabela 3. Valores dos efeitos principais e de interação Estimativa ± erro padrão Média global 8,30 ± 0,07 T -13,18 ± 0,13 A -5,01 ± 0,13 TA 3,36 ± 0,13 A Figura 4 é um diagrama que facilita a interpretação dos resultados obtidos quando ocorre a variação ao mesmo tempo da temperatura e da agitação durante as fermentações com Saccharomyces cerevisiae UFPEDA Como se pode observar no diagrama da Figura 4, com o aumento da temperatura ocorre a diminuição da concentração de etanol, sendo este efeito muito mais pronunciado a uma agitação de 80 rpm (-16,55), do que de 150 rpm (-9,83). O aumento da agitação também diminui a concentração de etanol, sendo este efeito maior a 37 0 C (-8,37) do que a 45 0 C (-1,65). A (rpm) -8,37 19,08-9,83 10,72 0,89-16,55 T ( 0 ) Figura 4. Diagrama para a interpretação dos resultados do planejamento fatorial. Apesar dos quatro ensaios terem apresentado baixos rendimentos em etanol, quando comparados com o rendimento teórico (0,51 g EtOH/ g glicose), é preferível realizar futuros experimentos de sacarificação e fermentação simultâneas em temperatura maior que 30 0 C, num processo não estático, devido às condições de temperatura e de agitação necessárias à sacarificação (Adsul et al., 2005). CONCLUSÕES 2,54-1,65 A linhagem UFPEDA 1238 apresentou maior desempenho fermentativo nas condições adversas de temperatura e de agitação utilizadas no presente trabalho. O aumento da temperatura foi muito mais prejudicial à fermentação do que o aumento da agitação, para os níveis testados. A maior concentração de etanol foi obtida a 37 0 C e 80 rpm. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adsul, M.G.; Ghuleb, J.E.; Singhb, R.; Shaikhb, H. Enzymatic hydrolysis of delignified bagasse polysaccharides. Carbohydrate Polymers, v. 62, p. 6-10, Gouveia, E.R.; Nascimento, R.T.; Souto-Maior, A.; Rocha, G.J.M. Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Química Nova, Jan, H.D.; Chen, K.S. Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T3-1. World Journal Microbiology and Biotechnology, v. 19, p , Lima, U.A.; Basso, L.C.; Amorim, H.V., Produção de etanol. In: Lima, U.A.; Aquarone, E.; Borzani, W.; Schmidell, W. (Ed.) Biotecnologia Industrial, São Paulo: Edgard Blücher LTDA, 2001, cap. 1, p Lima, A.L.G.; Nascimento, R.P.; Bon, E.P. S.; Coelho, R.R.R. Streptomyces drozdowiczii cellulase production using agro-industrial by-products and its potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and its potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbiology Technology, v. 37, p , Martín, C.; Galve, M.; Fredrik Wahlbom, C.; Hagerdal, B.H.; Jonsson, L.J. Ethanol production from enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse using recombinant xilose utilising Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p , Martín, C.; Marcet, M.; Almazán, O.; Jonsson, L.J. Adaptation of a recombinant xyloseutilizing Saccharomyces cerevisiae strain to a sugarcane bagasse hydrolysate with high content of fermentation inhibitors. Bioresource Technology, v. 98, p , 2006.

6 80 Seleção de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial para a produção de etanol... Santos et al. Martin, C.; Thomsen, M.H.; Hauggaard- Nielsen, H.; Thomsen, A. B. Wet oxidation pretreatment, enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentation of clover-ryegrass mixtures. Bioresource Technology, v. 99, p , Neto, B.B.; Scarminio, I.S.; Bruns, R.E. Planejamento e otimização de experimentos, São Paulo, Editora da Unicamp, Palmqvist, E.; Hahn-Hagerdal, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates I: inhibition and detoxification. Bioresource Technology, v. 74, p , Philippidis, G.P.; Smith, T.K.; Wyman, C.E. Study of the enzymatic hydrolysis of cellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous saccharification and fermentation process. Biotechnology and Bioengineering, v. 41, p , Santos, J.R.A.; Gouveia, E.R. Produção de Etanol por Três Linhagens Industriais de Saccharomyces cerevisiae na Presença de Xilose. In: XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos,Anais , Curitiba, UFPA, (CD ROM).