RESUMO ANÁLISE DO CRESCIMENTO E ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE BACTÉRIA ISOLADA DO SOLO DA AGOROINDÚSTRIA SUCROALCOOLEIRA

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1 Análise do crescimento e atividade enzimática de bactéria isolada do solo da agroindústria sucroalcooleira Paulo Victor Sarmento Dias 1 Katharinne de Oliveira Ramos Itácio Queiroz de Melo Padilha Demetrius Antônio Machado de Araújo Sharline Florentino de Melo Santos Flávio Luiz Honorato da Silva RESUMO ANÁLISE DO CRESCIMENTO E ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE BACTÉRIA ISOLADA DO SOLO DA AGOROINDÚSTRIA SUCROALCOOLEIRA Celulases são biocatalisadores altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares a partir dos resíduos lignocelulósicos, dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial. A glicose liberada pode ser utilizada como o substrato para a produção de muitos produtos de fermentação, incluindo etanol. O novo conceito de etanol (ou bioetanol) corresponde a sua produção utilizando como matéria-prima a biomassa lignocelulósica. A busca de novos microrganismos produtores de enzimas celulolíticas é de suma importância, uma vez que os mesmos podem contribuir para a viabilização de rotas biológicas de produção de etanol de segunda geração. Este trabalho se propõe a avaliar a produção de carboximetilcelulases a partir de bactérias isoladas do solo da agroindústria sucroalcooleira paraibana, assim como o crescimento do microrganismo, através do cálculo das variáveis: velocidade específica máxima de crescimento e tempo de geração. Para tanto, foi feito um cultivo em triplicata, do qual foram retiradas amostras periódicas até 72 horas de cultivo, para a análise de concentração de biomassa e atividade enzimática. A velocidade específica máxima de crescimento foi de 0,490 h -1, o tempo de geração foi de 1,41 h e o pico de atividade foi de 327 U/L, em 36 horas de cultivo. Palavras chave: celulase; enzima; bioetanol 1Universidade Federal da Paraíba Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p , 2014

2 Dias, P. V. S.; et al. ABSTRACT ANALYSIS OF GROWTH AND ENZYMATIC ACTIVITY OF BACTERIA ISOLATED FROM SOIL OF SUGARCANE AGROINDUSTRY Cellulases are highly specific biocatalysts which act in synergy to produce less complex molecules from lignocellulosic residues, of which glucose is what arouses greater industrial interest. The glucose may be used as the substrate for the production of many fermentation products as ethanol. The concept of bioethanol corresponds to its production using glucose obtained from raw lignocellulosic biomass. The search for new microorganisms producing cellulolytic enzymes is very important since it can contribute to the viability of biological production routes of second generation bioethanol. This study aims to evaluate the production of carboximetilcellulases from bacteria isolated from the soil of a Paraiba sugar and alcohol industry. Besides it was evaluated the growth of the microorganism, by calculating the variables: maximum specific growth rate and generation time. To that end, we made a crop in triplicate, from which samples were taken periodically up to 72 hours of culture, for the analysis of biomass concentration and enzyme activity. The maximum specific growth rate was h -1, the generation time was 1.41 h and the higher activity was 327 U / L at 36 hours of cultivation. Key words: cellulase; enzyme; bioethanol INTRODUÇÃO A produção de etanol para uso combustível tem se mostrado como uma das mais importantes tecnologias relacionadas ao desenvolvimento sustentável, devido à redução da emissão de gases relacionados ao Efeito Estufa (LIN; TANAKA, 2006). Entretanto, apenas cerca de 1/3 da biomassa de um vegetal é composta por amido ou açúcar, sendo os 2/3 restantes constituídos de fibras, não servindo de substrato para a produção de bioetanol de primeira geração (LEITE; CORTEZ, 2008). Dessa forma, os efeitos positivos em relação à sustentabilidade gerados pela produção de bioetanol de primeira geração estariam associados a efeitos negativos, como o crescimento da demanda de vegetais, aumentando o preço dos alimentos e causando impacto sobre a cobertura florestal nativa, bem como o aumento da geração de resíduos industriais (NYKO et al., 2010). Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

3 Análise do crescimento e atividade enzimática... O bioetanol de segunda geração, por sua vez, é produzido a partir de uma ampla variedade de produtos não alimentícios. Entre eles estão incluídas a utilização de materiais lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, florestais e industriais (RODRIGUES, 2011). Assim, o bioetanol de segunda geração é uma alternativa viável para o desenvolvimento sustentável, contribuindo também para a redução de emissão de gases associados ao aquecimento global e ao efeito estufa (SUKUMARAN et al., 2009). As celulases são enzimas responsáveis por catalisar a reação de hidrólise em materiais celulósicos, liberando açúcares, dentre eles a glicose (CASTRO; PEREIRA JR., 2010). Por conta da estrutura morfológica da celulose dificultar sua catálise, essas enzimas apresentam diferentes atuações na quebra das ligações glicosídicas β-1,4 da celulose, sendo, assim, divididas em três classes: endoglucanases, celobiohidrolases (exoglucanases) e β-glicosidases (GUTIERREZ-CORREA et al., 1999). A atuação das celulases na hidrólise celulolítica é sinérgica e se dá através da formação de um complexo enzimático, onde endoglucanases atuam diretamente na estrutura da celulose, diminuindo seu grau de polimerização, exoglucanases hidrolisam o polímero nas extremidades não redutoras, liberando celobiose, e β-glicosidases são responsáveis pela catálise de cadeias pequenas e de celobioses, resultando em glicose (COELHO; NASCIMENTO, 2008). Devido ao alto custo da obtenção de celulases, a produção industrial de bioetanol é bastante limitada. Este trabalho se propõe a avaliar a seleção e o crescimento de bactérias celulolíticas através dos parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento e tempo de geração, assim como a quantificação da produção de carboximetilcelulases (CMCases) desses microrganismos isolados do solo da agroindústria sucroalcooleira paraibana. METODOLOGIA Microrganismo As bactérias utilizadas foram isoladas do solo cultivado de cana-de-açúcar da Usina Japungu Agroindustrial S.A, localizada no município de Santa Rita PB. Seleção das Bactérias Foram avaliadas qualitativamente 15 cepas isoladas do solo. Para tanto, os isolados foram inoculados no seguinte meio sólido: Carboximetilcelulose (1 g/l); NaNO 3 (0,5 g/l); K 2 HPO 4 (1 g/l); MgSO 4 O (0,5 g/l); FeSO 4 O (0,01 g/l); Extrato de Levedura (1 g/l) e Ágar (15 g/l). Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

4 Dias, P. V. S.; et al. Após 72 h de incubação, a 37 ºC, foi adicionada às colônias cultivadas uma solução aquosa de vermelho congo 0,1 %, e, posteriormente, as placas foram lavadas com NaCl 1,0 M (TEATHER; WOOD, 1982). Os halos amarelos formados ao redor das colônias indicam atividade celulolítica positiva. Dessa forma, para comparar a produção de celulases entre as linhagens, calculou-se o Índice Enzimático (IE), que é igual à medida do diâmetro da zona de hidrólise, em cm, dividida pelo diâmetro da colônia, em cm. As cepas que apresentaram IE maior ou igual a 1,5 são consideradas celulolíticas (FLORENCIO et al., 2013). Os ensaios foram realizados em triplicatas. Avaliação do crescimento do microrganismo Dentre as cepas com maior IE, uma foi selecionada para a avaliação do seu crescimento. Para tanto, foram utilizados: Um cultivo de inóculo, em erlenmeyer de 150 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani CMC (LB - CMC) [CMC (10 g/l); Extrato de Levedura (5 g/l); Triptona (10 g/l); NaCl (10 g/l)], cultivado a 37 ºC e 180 rpm, cultivado por 18 h, que foi inoculado a partir da placa na qual a cepa estava estocada em geladeira; Um cultivo de 250 ml em meio mínimo (ARIFFIN et al., 2008): CMC (10 g/l), Extrato de Levedura (3 g/l); KH 2 PO 4 (1 g/l); K 2 HPO 4 (1,145 g/l); MgSO 4 O (0,4 g/l); CaCl 2.2H 2 O (0,05 g/l); FeSO 4 O (0,00125 g/l) em erlenmeyer de 500 ml, sendo feito em triplicata, cultivado a 37 ºC e 180 rpm e inoculado a partir de 1 ml de inóculo. Para os tempos 0 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 32 h, 36 h, 52 h, 56 h e 60 h, foi recolhido 1mL de cada cultivo para a turbidimetria. No tempo de 24 h, foi recolhida uma alíquota de 15 ml do cultivo para a construção da curva padrão da absorbância vs. concentração de biomassa (g/l), feita a partir de uma série de diluições dessa amostra em água destilada e da análise da massa seca presente em 1 ml da amostra. Através da curva de calibração, foram obtidos os valores de concentração de biomassa em cada tempo analisado. Avaliação da produção de enzimas Para a análise de atividade enzimática, foram utilizados: Um cultivo de pré-inóculo, em erlenmeyer de 150 ml contendo 50 ml de meio LB - CMC cultivado a 37 ºC e 180 rpm por 24 h, que foi inoculado a partir da placa na qual a cepa estava estocada em geladeira; Um cultivo de inóculo em erlenmeyer de 1000 ml contendo 400 ml de meio LB CMC, cultivado a 37 ºC e 180 rpm por 18 h, inoculado a partir de 8 ml do pré-inóculo; Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

5 Análise do crescimento e atividade enzimática... Um cultivo de 250 ml em meio mínimo (Ariffin et al., 2008): CMC (10 g/l), Extrato de Levedura (3 g/l); KH 2 PO 4 (1 g/l); K 2 HPO 4 (1,145 g/l); MgSO 4 O (0,4 g/l);cacl 2.2H 2 O (0,05 g/l); FeSO 4 O (0,00125 g/l) em erlenmeyer de 500 ml, sendo feito em triplicata, cultivado a 37 ºC e 180 rpm, sendo o volume de inoculo adicionado ao meio equivalente a 20 % do volume total do cultivo. Foram retirados 2 ml de amostra nos tempos de 6 h, 12 h, 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 54 h e 72 h de cultivo. As amostras foram centrifugadas a 5000 rpm, a 30 ºC por 5 minutos, e o sobrenadante foi utilizado para a quantificação de atividade enzimática de CMCases presentes no meio de cultivo através do método proposto por Ghose (1987), em ph 7. RESULTADOS Seleção das Bactérias No total, 14 cepas foram isoladas, das quais 6 apresentaram atividade celulolítica. Os IEs de cada cepa celulolítica são apresentados na Tabela 1 Tabela 1 Índices Enzimáticos das linhagens celulolíticas Linhagem IE C1C ,37 C1AC ,22 CC ,61 C1AC ,42 CC ,92 C1AC ,63 A cepa C1AC55.07, identificada como um Bacillus sp., foi escolhida para os testes subsequentes de crescimento e atividade celulolítica em mesa agitadora devido ao alto IE associado ao rápido crescimento apresentado em placa pela mesma. Avaliação do crescimento do microrganismo A cinética de crescimento da cepa C1AC55.07 é apresentada na Figura 1 Figura 1 Cinética de crescimento da cepa C1AC55.07 Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

6 Dias, P. V. S.; et al. Na Figura 1, é possível identificar as fases de crescimento microbiano, tal como a fase lag ou de adaptação do microrganismo ao meio, em três horas de cultivo, a fase log ou de crescimento exponencial entre 3 e 9 horas de cultivo, e a fase estacionária, entre 12 e 30 horas, sendo a fase log a que desperta maior interesse industrial por ser a fase de maior produção enzimática do microrganismo (TORTORA et al., 2005). Para determinar a velocidade específica de crescimento celular, foi utilizada a Equação 1 na fase de crescimento log, visto que, nessa fase, a velocidade específica de crescimento assume um valor máximo e constante, configurando a Equação 1 como uma equação de reta. In X = µ(t - T i ) + 1n X i (1) Onde X é a concentração de células no meio no tempo T e X i é a concentração de células no meio no tempo T i. Dessa forma, para determinar o valor da velocidade específica de crescimento celular, os dados da Tabela 2 foram utilizados para construir o gráfico da Figura 2. Tabela 2 Dados para o cálculo do valor da velocidade específica de crescimento Tempo (h) ln(x) 3-3, , ,35410 Figura 2 Gráfico para o cálculo da velocidade específica de crescimento Comparando a equação da Figura 2 com a Equação 1, tem-se que µ = 0,490 h -1. Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

7 Análise do crescimento e atividade enzimática... Luerce (2002) também analisou a velocidade máxima específica de crescimento celular para um cultivo de Bacillus, utilizando um meio com 50 g/l de glicose como fonte de carbono. O valor de µ relatado foi de 0,410 h -1. O tempo de geração, tempo necessário para que a colônia dobre de tamanho (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005), foi calculado considerando, na Equação1, que o valor de X é o dobro do valor de X i, e o intervalo de tempo é o tempo de geração (t g ). Dessa forma, tem-se a Equação 2. t g = 1n 2 µ (2) Substituindo o valor de µ na Equação 2, tem-se que t g é igual a 1,413 h. Avaliação da produção de enzimas A cinética da produção enzimática do microrganismo em mesa agitadora é mostrada na Figura 3. Figura 3 Cinética de produção de celulases O pico de atividade foi de 327 U/L, no tempo de 36 h. Kim et al. (2012) realizaram um ensaio parecido, cultivando um isolado de Bacillus subtilis utilizando CMC como fonte de carbono por 120 h, e a retirada do sobrenadante foi feita através de centrifugação. As células precipitadas foram ressuspendidas através da lavagem com tampão fosfato (ph 6,5) e submetidas a ondas ultrassônicas por 20 minutos, a fim de provocar a ruptura das células e a liberação de enzimas intracelulares para o meio externo. Em seguida, foi feita mais uma centrifugação e o sobrenadante também foi utilizado para os ensaios de atividade. A medida da atividade enzimática foi realizada pela metodologia proposta por Ghose (1987). O pico de atividade obtido foi de 900 U/L, em 72 h de cultivo. Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

8 Dias, P. V. S.; et al. No caso de Ariffin et al. (2008), a obtenção de celulases foi feita a partir de um Bacillus Pumilus utilizando CMC como fonte de carbono e o meio de cultivo igual ao deste trabalho. Foi utilizada uma quantidade de 10 % de inóculo e o cultivo foi feito a 37 ºC e 200 rpm. Como resultado, foi observada uma produção enzimática máxima de 0,076 U/mL, em 36 h de cultivo. CONCLUSÃO Os experimentos apresentaram resultados promissores, tornando viável a continuidade do estudo da produção enzimática de celulase pela cepa C1AC Uma alternativa observada em outros trabalhos para o aumento da produção enzimática é a lise celular, de modo que as enzimas intracelulares também possam ser aproveitadas. REFERÊNCIAS ARIFFIN, H. et al. Production of bacterial endoglucanase from pretreated oil palm empty fruit bunch by bacillus pumilus EB3. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 106, n. 3, p , CASTRO, A. M. D.; PEREIRA JR, N. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, v. 33, n. 1, p , DE FARIA LUERCE, R. Produção de acetoína por Bacillus polymyxa Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. GHOSE, T. Measurement of cellulase activities. Pure and applied Chemistry, v. 59, n. 2, p , GUTIERREZ-CORREA, M.; TENGERDY, R. P. Production of cellulase on sugar cane bagasse by fungal mixed culture solid substrate fermentation. Biotechnology letters, v. 19, n. 7, p , KIM, Y.-K. et al. Isolation of cellulolytic Bacillus subtilis strains from agricultural environments. ISRN microbiology, Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,

9 Análise do crescimento e atividade enzimática... LEITE, R. C.; CORTEZ, L. A. B. O etanol combustível no Brasil. Revista Biocombustíveis no Brasil: Realidades e Perspectivas, Ministério das Relações Exteriores, LIN, Y.; TANAKA, S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied microbiology and biotechnology, v. 69, n. 6, p , NYKO, D. et al. A corrida tecnológica pelos biocombustíveis de segunda geração: uma perspectiva comparada. BNDES Setorial, v. 32, p. 5-48, RODRIGUES, J. A. R. Do engenho à biorrefinaria: a usina de açúcar como empreendimento industrial para a geração de produtos bioquímicos e biocombustíveis. Quim Nova, v. 34, p , SUKUMARAN, R. K. et al. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy, v. 34, n. 2, p , TEATHER, R. M.; WOOD, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology, v. 43, n. 4, p , TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia Artmed, ISBN AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), assim como ao Centro de Tecnologia (CT) e ao Centro de Biotecnologia (CBIOTEC) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pela infra estrutura disponibilizada para a execução dos experimentos. Rev. de Ci. Exatas, RJ, EDUR, v. 33 n 1 jan / jun p ,