Estudo da Fermentação Alcoólica por Saccharomyces cerevisiae, em Meio Semi-sintético sem Esterilização, na Presença de p-hidroxibenzaldeído

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1 Estudo da Fermentação Alcoólica por Saccharomyces cerevisiae, em Meio Semi-sintético sem Esterilização, na Presença de Juliana Maria Sampaio Furlani 1,2, Gabriele Cristine Ribeiro Aluvino 1, Gustavo Pereira Zago 1, Flávio Teixeira da Silva 1 1 Universidade de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena - DEBIQ Caixa Postal Lorena SP - juliana@debiq.eel.usp.br 2 Universidade Federal de Itajubá Instituto de Ciências Exatas - DFQ Caixa Postal Itajubá MG RESUMO A produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar (um material lignocelulósico) é um processo altamente desejável do ponto de vista do desenvolvimento sustentável. A fermentação do hidrolisado celulósico, porém, é inibida pela presença de compostos provenientes tanto da degradação dos carboidratos quanto da degradação da lignina, devido aos pré-tratamentos necessários para liberar os monossacarídeos presentes na parede celular. Neste trabalho, estudou-se o efeito da adição de a um meio semi-sintético contendo glicose (180 g.l -1 ) e nutrientes, sem esterilização, utilizando-se Saccharomyces cerevisiae ( g.l -1 ), para o processo fermentativo. Conclui-se que a adição de, nas concentrações utilizadas neste trabalho (0,008; 0,2; 0,6 e 1,0 g.l -1 ) não alterou significativamente os parâmetros rendimento de biomassa, Y X/S, rendimento de etanol, Y et/s, concentração de etanol e produtividade volumétrica de etanol. Esse conhecimento é importante, por exemplo, para orientar a escolha de processos de destoxificação dos hidrolisados celulósicos. Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, fermentação alcoólica, inibidores, compostos aromáticos,. INTRODUÇÃO A matriz energética, no âmbito mundial, é fortemente dependente do petróleo, seguida de duas outras fontes de origem fóssil, o carvão mineral e o gás natural, perfazendo 80,06% do suprimento de energia. A energia nuclear contribui com 6,33% do total. O restante, 13,61%, provém de fontes renováveis, que inclui a biomassa, a energia solar, a eólica e outras. (GOLDEMBERG, 07). Apesar de não ser recente, a preocupação com essa forte dependência da matriz energética mundial em relação às fontes fósseis vem crescendo. Somado aos problemas energéticos, tem crescido na comunidade internacional a preocupação com o desenvolvimento sustentável. Por iniciativa da Organização das Nações Unidas (ONU), o documento Sustainable Bioenergy: A Framework for Decision Makers delineia critérios bastante objetivos para o que deve ser considerado como desenvolvimento energético

2 sustentável. Recomenda-se a utilização da bioenergia moderna, considerada como a biomassa que, após secagem e aumento da densidade do combustível sólido, pode ser queimada diretamente, ou a biomassa que é convertida em combustíveis líquidos ou gasosos, usando as tecnologias de primeira ou de segunda geração (UNDP, 07). A produção de etanol a partir de biomassa de materiais lignocelulósicos, como é o caso do bagaço da cana-de-açúcar, constitui-se num processo altamente desejável do ponto de vista do desenvolvimento sustentável, já que essa conversão utiliza o bagaço, já disponível nas próprias usinas produtoras de açúcar e álcool, dispensando a necessidade de coleta desse resíduo no campo e contribuindo para a diminuição da necessidade de ocupação de novas áreas para o plantio da cana, visando o aumento da produção de etanol. A utilização do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol, porém, encontra alguns entraves relacionados às características dos materiais lignocelulósicos. Esse tipo de material é formado essencialmente por três macro-componentes: a celulose, as hemiceluloses e a lignina. Os dois primeiros componentes são carboidratos, fontes dos monossacarídeos que efetivamente são utilizados pelos micro-organismos nos processos fermentativos. Prétratamentos dos materiais lignocelulósicos são necessários para remover a lignina e viabilizar o acesso à celulose e às hemiceluloses presentes na parede celular. Dentre esses prétratamentos, a explosão a vapor tem sido um dos métodos mais eficientes (SILVA, 1995). Nesse processo, o material lignocelulósico é colocado em um reator com água a elevadas temperaturas, que gera vapor em alta pressão. Após certo tempo de operação, ocorre uma rápida descompressão do sistema. Durante o tratamento a vapor, as hemiceluloses são hidrolisadas, a celulose é levemente despolimerizada e a lignina flui, induzindo à fragilização da coesão da estrutura como um todo, o que explica o desfibramento do material durante a rápida descompressão. A lignina é expelida em direção ao lúmen da célula durante o tratamento e/ou na descompressão, sendo esse fenômeno mais pronunciado quando a temperatura é maior, devido à maior diferença de pressão quando o reator é aberto. As modificações na distribuição da lignina dentro da parede celular, proporcionadas pelo tratamento a vapor, e a laminação e desfibramento entre a lamela média e a parede celular, explicam o aumento do volume dos poros e da área acessível à celulose (MICHALOWICZ, 1991), facilitando o acesso de reagentes ou de enzimas para o processo de hidrólise da celulose. A hidrólise (ácida ou enzimática) libera a glicose e procede-se à fermentação alcoólica. O desenvolvimento dos processos de hidrólise se constitui em ponto fundamental para o desenvolvimento do etanol a partir do bagaço e também da palha de cana. Durante os pré-tratamentos, porém, são formados compostos de degradação dos açúcares e da lignina. Esses compostos podem atuar como inibidores tanto do crescimento dos micro-organismos quanto da fermentação alcoólica (LARSSON, 00; BOYER, 1992; PALMQVIST, 00; KLINKE, 04). O tipo e a quantidade desses compostos variam principalmente em função da matéria-prima e do tipo de pré-tratamento utilizado (HAHN HÄGERDAL e OLSSON, 1996). O estudo do efeito da concentração desses compostos em processos fermentativos é, portanto, de grande interesse para o desenvolvimento de tecnologias viáveis para a produção de etanol de segunda geração. Neste trabalho, estudamos a fermentação alcoólica realizada por Saccharomyces cerevisiae, na presença de compostos aromáticos de baixa massa molar, encontrados no bagaço de cana-de-açúcar, quando este é submetido à explosão a vapor. Alguns desses compostos foram identificados no bagaço da cana (NASCIMENTO, 07) e no hidrolisado

3 hemicelulósico (CUNHA, 05), quando o bagaço foi submetido à explosão a vapor (CUNHA, 05). Avaliamos a influência de oito compostos aromáticos, provenientes da degradação da lignina, na fermentação alcoólica realizada por S. cerevisiae em meio semisintético contendo glicose. Neste trabalho, apresentamos os resultados e conclusões para a fermentação na presença de um desses compostos, o. MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo Utilizou-se a levedura Saccharomyces cerevisiae, comprada no comércio local da cidade de Lorena/SP, como levedura de panificação comercial (fermento biológico), da marca Fleischmann. Para cada lote comprado, determinou-se a massa seca e também uma curva de calibração concentração x absorbância (600nm). Nos experimentos, utilizou-se a concentração de g.l -1 de fermento, base seca. Meio de cultura Os ensaios de fermentação foram realizados em meio de cultura contendo uma concentração inicial de glicose elevada (180 g.l -1 ). A solução com os nutrientes foi escolhida a partir de trabalhos anteriores (TAHERZADEH, 1996; MODIG, 08), com adaptações. Composição do meio de fermentação (mg. L -1 ): KH 2 PO 4 (3500), MgSO 4. 7H 2 O (75), CaCl 2.2H 2 O (9), (NH 4 ) 2 SO 4 (7500), ZnSO 4.7H 2 O (9), FeSO 4. 7H 2 O (6), H 3 BO 3 (2), MnCl 2.2H 2 O (0,8), Na 2 MoO 4.2H 2 O (0,8), CoCl 2.2H 2 O (0,6), CuSO 4.5H 2 O (0,6), KI (0,2), EDTA (30); extrato de levedura (0,5%) e octanol como antiespumante (1mL. L -1 aprox. gotas. L -1 ). Condições de fermentação Os experimentos foram conduzidos em triplicata, em frascos erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml do meio de cultura, com e sem adição de (controle), tampados com rolha de algodão envolto em gaze. Devido às condições não estéreis, uma fermentação controle acompanhou cada experimento. Os frascos foram colocados em um agitador orbital, com agitação de 100 rpm, a 30 C, por 9h. Para o estudo cinético da fermentação sem adição do composto aromático, amostras foram retiradas no tempo inicial e depois nos tempos de 2, 4, 6, 8 e 9 horas, avaliando-se o consumo de açúcares, o rendimento de etanol, Y et/s (g.g -1 ), a concentração de etanol (g.l -1 ), a produtividade volumétrica de etanol, P et (g.l -1.h -1 ), o crescimento microbiano (g.l -1 ), o rendimento da biomassa, Y x/s (g.g -1 glicose) e o ph, além da concentração de glicerol e de ácido acético (dados não mostrados). Para os experimentos realizados na presença do nas concentrações 0,008 e 0,2, a amostragem seguiu o mesmo padrão. Nas concentrações de 0,6 e 1,0 g.l -1 foram coletadas amostras para análise apenas no tempo inicial e após 6h de fermentação. Para cada bateria de fermentação, preparou-se o meio de fermentação (com ou sem p- hidroxibenzaldeído), ajustou-se o ph para 4,5, adicionou-se a levedura e completou-se o volume para 1,0 L. A cada tempo de amostragem, três alíquotas de 10 ml foram retiradas, transferidas para tubos de centrífuga (imersos em banho de gelo), centrifugadas a 3000 rpm, por 7 minutos. O sobrenadante foi separado e novamente centrifugado. Por fim, separou-se o novo sobrenadante, que foi guardado a 18 C para posterior análise em HPLC. Ressuspendeu-se a levedura com água destilada, agitou-se no vórtex e, após nova centrifugação, dispensou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se novamente a levedura, que foi guardada sob refrigeração para posterior avaliação da biomassa.

4 Concentração / g.l -1 Métodos analíticos O crescimento da levedura foi avaliado medindo-se, num espectrôfometro, a densidade ótica (600 nm) de uma suspensão de células em função da concentração (g.l -1 ) em base seca. Glicose, glicerol, ácido acético e etanol foram mensurados por cromatografia líquida de alta performance (Waters 600,TSP Spectra System, Waters, Milford, MA, USA) usando uma coluna Biorad Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). A temperatura foi de 45 o C, com ácido sulfúrico 5 mmol L 1 como fase móvel, com fluxo de 0.4 ml min 1 e detector de índice de refração (Waters 2414). RESULTADOS E DISCUSSÕES As variações das concentrações de glicose, etanol e da biomassa no processo fermentativo, nas condições especificadas e sem adição de, são mostradas na figura Glicose Etanol Biomassa Figura 1 Consumo de glicose, produção de etanol e crescimento microbiano. Nota-se que, com 6h de fermentação, a levedura consumiu toda a glicose do meio. Paralelamente a esse controle (Teste 1), realizou-se os testes com adição de p- hidroxibenzaldeído nas concentrações de 0,008 (Teste 2) e 0,2 (Teste 3) g.l -1. As figuras 2a, 2b e 2c mostram, respectivamente, o consumo de glicose, a produção de etanol e o crescimento microbiano para o controle ( ) e para os testes com nas concentrações de 0,008 ( ) e 0,2 ( ) g.l -1. Esses três primeiros testes constituíram a primeira bateria de testes. Pouca diferença foi observada entre os resultados do controle e dos testes com o p- hidroxibenzaldeído. Nos três testes, ocorreu o consumo total de glicose em 6h de fermentação. A maior diferença pode ser observada no crescimento microbiano, que foi maior no teste 3. Esse fato ocorreu, provavelmente, devido à menor concentração inicial de biomassa nesse teste. A partir desses resultados, realizamos outra bateria de testes, agora com duração de 6h, no qual as amostras para análise foram coletadas apenas nos tempos inicial e final. Paralelamente ao novo controle (Teste 4), adicionamos nas concentrações de 0,6 (Teste 5) e 1,0 (Teste 6) g.l -1.

5 Concentração / g.l -1 Concentração / g.l Controle 0,008 0, Controle 0,008 0, Concentração / g.l Controle 0,008 0, a 2b 2c Figuras - 2a: Consumo de glicose; 2b: Produção de etanol; 2c: Crescimento microbiano. Em todos os testes, o ph decresceu em relação ao valor inicial de 4,5. Esse resultado era esperado, pois utilizamos sulfato de amônio como uma das fontes de nitrogênio. Os valores de ph foram diferentes quando comparamos a primeira bateria de testes com a segunda. Como a levedura é comercial e o meio não recebeu qualquer esterilização, diferenças entre as baterias de testes eram esperadas e, por isso, realizamos um controle a cada novo experimento. Os dados do ph, após 6h de experimento são mostrado na tabela 1. Nota-se que, em uma mesma bateria de testes, o ph aumenta ligeiramente com o aumento da concentração de. Teste ph (6h) 2,74±0,02 2,80±0,04 2,84±0,04 3,34±0,02 3,49±0,06 3,54±0,05 Tabela 1 Valores do ph do meio de fermentação após 6h. A tabela 2 mostra os resultados experimentais dos parâmetros calculados para avaliar as fermentações. A produtividade volumétrica foi calculada para 6h de fermentação. Testes Y x/s (g.g -1 glicose) Y et/s (g.g -1 ) Concentração de etanol (g.l -1 ) P et (g.l -1.h -1 ) 1 Controle 1 0,046±0,007 0,366±0,004 64,4±0,5 10,7±0,5 2 0,008 g.l -1 de 3 0,2 g.l -1 de 0,043±0,003 0,37±0,02 67,2±0,8 11,2±0,8 0,049±0,004 0,37±0,01 67±1 11±1 4 Controle 2 0,040±0,004 0,38±0,01 66±1 11±1 5 0,6 g.l -1 de 0,037±0,004 0,38±0,04 60±4 10±4 6 1,0 g.l -1 de 0,039±0,005 0,38±0,03 64±4 11±4 Tabela 2 Parâmetros de avaliação dos testes de fermentação.

6 Ao comparar os testes 1 e 4 (controles), apesar da variação nos valores absolutos de todas as variáveis apresentadas, essa variação encontra-se dentro do desvio-padrão calculado para essas medidas. Desse modo, apesar de não haver esterilização e ser utilizada levedura comercial, os dados de ambas as fermentações são comparáveis. A adição de p- hidroxibenzaldeído ao meio de fermentação pouco alterou as variáveis analisadas. O rendimento de biomassa, Y x/s, foi menor na segunda bateria (4, 5 e 6) em relação à primeira. Porém o único valor significativamente maior de Y x/s ocorreu no teste 3. Como ressaltado anteriormente, isso provavelmente se deve ao fato de que a biomassa inicial, no teste 3, foi menor que nos demais. O rendimento de etanol, Y et/s, foi igual nos 6 testes efetuados, dentro do desvio-padrão, assim como a concentração de etanol e a produtividade volumétrica, P et. CONCLUSÕES A adição de, nas concentrações utilizadas neste trabalho (0,008; 0,2; 0,6 e 1,0 g.l -1 ) não alterou significativamente os parâmetros rendimento de biomassa, Y x/s, rendimento de etanol, Y et/s, concentração de etanol e produtividade volumétrica de etanol. Esse conhecimento é importante para orientar a escolha de processos de destoxificação dos hidrolisados celulósicos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOYER, L. J., VEGA, J. L., KLASSON, K. T., CLAUSEN, E.C, e GADDY, J. L. (1992) The effects of furfural on ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biomass Bioenergy. v. 3, p CUNHA, H. C.M. (05) Caracterização do hidrolisado hemicelulósico e do bagaço de cana prétratado por explosão a vapor: avaliação do poder inibitório dos compostos aromáticos de baixa massa molar em processos fermentativos. Tese de doutorado. Brasil, Lorena/SP, Faenquil. GOLDEMBERG, J. (07) Ethanol for a Sustainable Energy Future. Science v. 315, n. 5813, Errata em: Science, v. 317, n. 5843, p HAHN HÄGERDAL, B. e OLSSON, L. (1996) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol fermentation. Enzyme and Microbial Technology. v. 18, p KLINKE, H.B., THOMSEN, A.B., AHRING, B.K. (04): Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl Microbiol Biotechnol, 66: LARSSON, S., QUINTANA-SÁINZ, A., REIMANN, A., NILVEBRANT, N. e JÖNSSON, L. J. (00) Influence of Lignocellulose-Derived Aromatic Compounds on Oxygen-Limited Growth and Ethanolic Fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Applied Biochemistry and Biotechnology, v , p MICHALOWICZ, G., TOUSSAINT, B. e VIGNON, M. R. (1991) Ultrastructural Changes in Poplar during Steam Explosion Treatment. Holzforschung, v. 45 (3), p MODIG, T., ALMEIDA, J.R.M., GORWA-GRAUSLUND, M.F., LIDÉN, G. (08) Variability of the Response of Saccharomyces cerevisiae Strains to Lignocellulose Hydrolysate. Biotechnology and Bioengineering, v. 100, n. 3, p NASCIMENTO, R. A. A. (07) Caracterização da lignina de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor: identificação dos compostos de degradação e reações envolvidas. Tese de doutorado. Brasil, Lorena/SP, EEL, USP. PALMQVIST, E., HAHN-HÄGERDAL, B. (00): Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresour Technol, 74: SILVA, F. T. (1995) Obtenção de insumos químicos a partir do aproveitamento integral do bagaço de Cana. Tese de doutorado. Brasil, Campinas/SP, Unicamp. TAHERZADEH, M. J., LIDÉN, G., GUSTAFSSON, L. AND NIKLASSON, C. (1996) The effects of pantothenate deficiency and acetate addition on anaerobic batch fermentation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. v. 46, n. 2. p UNDP. (07) Sustainable Bioenergy: A Framework for Decision Makers. In: United Nations Development Program.